CN110982759A - 一株具有抗氧化能力的植物乳杆菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株具有抗氧化能力的植物乳杆菌及其应用，该乳酸菌命名为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum），保藏编号为CGMCC NO.18671，保藏日期为2019年10月12日。本发明的一株具有抗氧化能力的植物乳杆菌是从传统发酵食品中分离筛选得到的，具有良好的抗氧化活性，将其应用于益生菌粉等功能性食品或保健品，可增强机体免疫力。
Description
技术领域
本发明涉及一株具有抗氧化能力的植物乳杆菌及其应用，属于微生物领域。
背景技术
目前，国内外许多研究表明乳酸菌是有益菌，常作为肠道常驻菌群，可以直接在机体氧化损伤的重点部位肠道发挥抗氧化作用，维持肠道处于氧化还原平衡状态。究其原因，与乳酸菌在发酵过程中产生的多种生物活性密不可分。很多体外和体内试验研究表明，乳酸菌无细胞提取物具有抗氧化活性。Lin等研究了19株乳酸菌无细胞提取物的抗氧化活性，发现乳酸菌无细胞提取液对羟基自由基具有不同程度的清除能力。一些菌株无细胞提取物具有较强的抗脂质过氧化能力。Forsyth等研究发现乳酸菌GG可以缓解酒精造成的肠道氧化应激反应。张天博等测定了52株乳酸菌的菌体和无细胞提取物对DPPH的清除能力，发现菌株无细胞提取物对DPPH的清除率高于乳酸菌菌体。
通过膳食中补充抗氧化物质能有效增强机体的抗氧化能力，但许多化学合成的抗氧化剂存在安全性问题。而乳酸菌作为天然的抗氧化物，因具有降低活性氧(ROS)生成的作用而受到越来越多的关注。
本研究从传统发酵食品中分离得到的10株乳酸菌进行了抗氧化性能筛选，得到一株具有强抗氧化活性的植物乳杆菌，并分析了其抗氧化机理，为具有抗氧化性的乳酸菌应用于功能性食品或保健品的开发和生产提供理论依据。
发明内容
本发明的目的在于提供一株具有抗氧化能力的植物乳杆菌，为该菌在功能性食品或保健品的开发和生产奠定基础。
本发明提供一株具有抗氧化能力的植物乳杆菌，该菌命名为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，保藏编号为CGMCCNo.18671，保藏日期为2019年10月12日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明提供了一株具有抗氧化能力的植物乳杆菌及其应用，在制备用于机体抗氧化的益生菌粉保健品的应用。
本发明提供一种用于机体抗氧化的益生菌粉保健品，其特征在于包括上述的植物乳杆菌。
进一步的，将所述植物乳杆菌制备成菌粉与载体混匀即可。
进一步的，所述菌粉通过以下步骤得到：
将植物乳杆菌接种于固体斜面培养基中活化；
取活化后的植物乳杆菌，在无菌条件下接种于种子液体培养基中，得到一级种子液；
将所述的一级种子液接种于另一种子液体培养基中，培养得到二级种子液；
将所述的二级种子液接种于液体发酵培养基中发酵；
将所述发酵液干燥得到菌粉成品。
进一步的，所述种子液体培养基与液体发酵培养基包括：10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/L牛肉浸粉，20g/L葡萄糖，5g/L乙酸钠，2g/L磷酸氢二钾，2g/L柠檬酸铵，0.2g/L硫酸镁，0.05g/L硫酸锰，1mL/L吐温80，pH 5.0～5.4，121℃条件下灭菌20min；所述得到的一级种子液、所述得到的二级种子液和所述的液体发酵的培养条件均为30～37℃培养22～26h。
进一步的，所述的固体斜面培养基为所述种子液体培养基中添加1.5～2.0％的琼脂粉，菌种活化条件为30～37℃培养14～20h。
进一步的，所述的发酵液干燥得到菌粉的制备步骤为取植物乳杆菌发酵液3000～4000r/min的条件下离心4～6min去上清液，得到植物乳杆菌菌泥，经冷冻干燥，即为菌粉成品。
进一步的，所述一级种子液、所述二级种子液和所述的液体发酵液的菌种接种量为1.5～2.0％。
本发明的有益效果：本发明的一株具有抗氧化能力的植物乳杆菌是从传统发酵食品中分离筛选得到的，具有良好的抗氧化活性，将其应用于益生菌粉等功能性食品或保健品，可增强机体免疫力。
附图说明
图1为本发明植物乳杆菌的生长曲线；
图2为植物乳杆菌的显微形态观察；
图3为植物乳杆菌的系统进化分析。
具体实施方式
下文将结合具体附图详细阐述本发明具体实施例。
实施例1：植物乳杆菌的分离纯化
取传统发酵面制品10g溶于90mL无菌水中依次进行10倍梯度稀释，选择合适梯度的稀释液进行平板涂布，30℃恒温静置培养24h，挑取菌落大小、颜色不一的菌落进行革兰氏染色和过氧化氢酶反应，筛选出乳酸菌，并用MRS琼脂斜面培养基保存。
图1示出了植物乳杆菌的生长曲线，前4h为延滞期，4～12h为对数期，12～48h为平稳期，未出现衰亡期。
图2示出了植物乳杆菌的显微形态，该菌为革兰氏阳性菌，细胞形态为杆状，菌体大小(宽度×长度)为(1.28～1.60)μm×(2.4～8.0)μm。
实施例2：植物乳杆菌的序列分析
培养24h的乳酸菌发酵液按照细菌DNA试剂盒提取说明提取其基因组DNA，送与生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，测序结果与NCBI数据库进行同源性比对分析，找到同源性最接近的已知种属的序列。用软件MEGA7.0进行序列分析，并采用Neighbor-Joining法进行系统发育分析，构建进化树，研究分离菌株与模式株之间的亲缘关系。
图3示出了本发明分离得到的乳酸菌与植物乳杆菌种的亲缘关系最近，同属植物乳杆菌属。
实施例3：植物乳杆菌的抗氧化性分析
(1)无细胞提取物的制备
植物乳杆菌培养24h后，取发酵液4000r/min的转速下离心15min，收集菌体，并用双蒸水洗涤3次，将乳酸菌的菌数调节到1×109cells/mL，再在冰浴中超声破碎细胞，破碎液于6000r/min离心10min，收集上清，即为待测样品。
(2)清除超氧阴离子自由基实验
取2mL的50mmol/LpH 8.2的Tris-HCl缓冲液，与0.91mLH2O，50μL待测样品，混匀后加入40μL浓度为10mmol/L的邻苯三酚溶液，测量320nm处的吸光度值。计算线性范围内每分钟吸光度的增加值。
其中：△A0为空白溶液的吸光度随时间的变化；△A为样品溶液的吸光度随时间的变化。
经过测定得出，该植物乳杆菌的超氧阴离子自由基清除率为64.43％。
(3)清除DPPH实验
1mL待测液加1mL浓度为0.2mmol/L的DPPH，室温下静置30min后，在517nm处测吸光度变化。
式中：Ai为1mL的DPPH+1mL样品的吸光度；Aj为1mL溶剂+1mL样品的吸光度；A0为1mLDPPH+1mL溶剂的吸光度。
经过测定得出，该植物乳杆菌的DPPH清除率为71.30％。
结合以上清除超氧阴离子自由基和清除DPPH实验，该植物乳杆菌具有较高的抗氧化效果，因此可用于后续的益生菌粉保健品的制备。
实施例4：益生菌粉保健品的制备
将植物乳杆菌接种于固体斜面培养基中活化，取活化后的植物乳杆菌在无菌条件下按1％(v/v)接种于种子液体培养基中，30℃培养14h得到一级种子液，将所述的一级种子液接种于另一种子液体培养基中，再次培养得到二级种子液，将所述的二级种子液接种于液体发酵培养基中30℃发酵24h。取发酵液于4000r/min的条件下离心5min去除上清液，得到植物乳杆菌菌泥，经真空冷冻干燥，即为菌粉成品。
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一株具有抗氧化能力的植物乳杆菌，其特征在于：该菌命名为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，保藏编号为CGMCC No.18671，保藏日期为2019年10月12日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
2.如权利要求1所述的植物乳杆菌，在制备用于机体抗氧化的益生菌粉保健品的应用。
3.一种用于机体抗氧化的益生菌粉保健品，其特征在于包括权利要求1所述的植物乳杆菌。
4.如权利要求3所述的用于机体抗氧化的益生菌粉保健品，其特征在于所述植物乳杆菌制备成菌粉与载体混匀即可。
5.如权利要求4所述的用于机体抗氧化的益生菌粉保健品，其特征在于所述菌粉通过以下步骤得到：
(1)取植物乳杆菌接种于固体斜面培养基中活化；
(2)取活化后的植物乳杆菌，在无菌条件下接种于种子液体培养基中，得到一级种子液；
(3)将所述的一级种子液接种于另一种子液体培养基中，培养得到二级种子液；
(4)将所述的二级种子液接种于液体发酵培养基中发酵；
(5)将所述发酵液干燥得到菌粉成品。
6.如权利要求5所述的用于机体抗氧化的益生菌粉保健品，其特征在于，所述种子液体培养基与液体发酵培养基包括：10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/L牛肉浸粉，20g/L葡萄糖，5g/L乙酸钠，2g/L磷酸氢二钾，2g/L柠檬酸铵，0.2g/L硫酸镁，0.05g/L硫酸锰，1mL/L吐温80，pH 5.0～5.4，121℃条件下灭菌20min；所述得到的一级种子液、所述得到的二级种子液和所述的液体发酵的培养条件均为30～37℃培养22～26h。
7.如权利要求5所述的用于机体抗氧化的益生菌粉保健品，其特征在于，所述的固体斜面培养基为所述种子液体培养基中添加1.5～2.0％的琼脂粉，菌种活化条件为30～37℃培养14～20h。
8.如权利要求5所述的用于机体抗氧化的益生菌粉保健品，其特征在于，所述的发酵液干燥得到菌粉的制备步骤为取植物乳杆菌发酵液3000～4000r/min的条件下离心4～6min去上清液，得到植物乳杆菌菌泥，经冷冻干燥，即为菌粉成品。
9.如权利要求5所述的用于机体抗氧化的益生菌粉保健品，其特征在于，所述一级种子液、所述二级种子液和所述的液体发酵液的菌种接种量为1.5～2.0％。
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