CN106434483A

CN106434483A - 一种布氏乳杆菌及其应用

Info

Publication number: CN106434483A
Application number: CN201610964912.XA
Authority: CN
Inventors: 贠军贤; 关今韬; 关怡新
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2016-11-04
Filing date: 2016-11-04
Publication date: 2017-02-22
Anticipated expiration: 2036-11-04
Also published as: CN106434483B

Abstract

本发明提供一株布氏乳杆菌及其在发酵和转化合成高值有机酸中的应用，该布氏乳杆菌株命名为（Lactobacillus buchneri）GBS3，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC No.M 2016215。以本发明提供的菌种为出发菌株，通过微生物发酵代谢同步合成苯乳酸和乳酸；以本发明提供的菌株的菌体细胞为全细胞催化剂，以苯丙酮酸和葡萄糖为底物，经微生物转化合成苯乳酸。本发明提供的菌株，分离自传统发酵食品泡菜，生物安全性好，转化反应条件温和，转化率高；发酵液中乳酸的终浓度可达1.8 g/L，苯乳酸终浓度为13 mg/L；转化液中苯乳酸浓度可达12 g/L，具有很好的工业应用前景。

Description

一种布氏乳杆菌及其应用

技术领域

本发明属于生物化工技术领域，具体涉及一种布氏乳杆菌微生物菌株及其在发酵同步合成和转化合成高值有机酸中的应用。

背景技术

有机酸在化工、材料、农业、医药和食品等许多领域有重要应用。利用微生物发酵或微生物转化合成有机酸，具有制备条件温和、环境友好和合成路径较简便等优点，是生物化工领域的重要方向。

乳酸和苯乳酸都是十分重要的高值有机酸。乳酸作为一种带羟基的羧酸，具有广泛的用途，如在临床用于消毒剂、手术缝合线、药物制剂，在食品领域作为保鲜剂、调味剂，日用品领域作为化妆品的滋润剂、护发剂、保湿剂，农业领域作为缓释剂、地膜、饲料添加剂，化工和材料领域作为重要的单体等。苯乳酸不仅是新型广谱抗菌剂，而且是合成高分子材料的重要单体，也是合成抗血小板凝聚和心肌梗塞药物的前体，在诸多工业领域有重要的应用前景。

化学法合成乳酸和苯乳酸过程中，存在一些局限性，如使用高毒溶剂、环境污染及产物中溶剂残留等。微生物法合成乳酸和苯乳酸，可以克服化学合成法的局限性，是近几年研究发展的新途径。

但是，通过微生物发酵合或转化合成这些高值有机酸，常常存在菌株的安全性、高效性、转化产率低、产物浓度低等难题。因此，需要探索既安全又具有很好发酵合成或转化合成能力的新菌株。

发明内容

针对现有技术中存在的上述问题，本发明目的是提供一株布氏乳杆菌株，该菌株既有很好的生物安全性，又有很好的乳酸和苯乳酸同步发酵合成能力和苯乳酸转化合成能力。

为实现上述目的，所采取如下的技术方案：

（1）一种布氏乳杆菌株，其特征在于，所述菌株命名为布氏乳杆菌（Lactobacillus buchneri）GBS3，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No. M 2016215。保藏时间：2016年4月21日；保藏地址：湖北省武汉市武昌区珞珈山武汉大学生命科学学院，邮编430072。

进一步，所述的布氏乳杆菌（Lactobacillus buchneri）GBS3为革兰氏阳性杆菌，0.8微米×1.5~2.0微米；成链生长、无芽孢、不运动、兼性厌氧、过氧化氢酶阴性、化能异养。

更进一步，所述的布氏乳杆菌（Lactobacillus buchneri）GBS3菌株16S rDNA序列如SEQ ID NO ：1所示。

（2）一种布氏乳杆菌（Lactobacillus buchneri）GBS3在发酵合成乳酸和苯乳酸中的应用。

进一步，该应用以所述的布氏乳杆菌（Lactobacillus buchneri）GBS3菌株为出发菌株，在液体培养基中进行发酵，得到含有乳酸和苯乳酸的发酵液。

进一步，所述的液体培养基组成为：葡萄糖20 g，蛋白胨10 g，柠檬酸氢二胺2 g，无水乙酸钠5 g，硫酸锰0.25 g，硫酸镁0.58 g，磷酸氢二钾2 g，酵母膏5 g，牛肉膏10 g，吐温80 1 g，去离子水1 L，pH值自然。

进一步，所述的发酵条件为：温度25~35℃，发酵时间24~72 h，静置发酵。

更进一步，所述的含有乳酸和苯乳酸的发酵液中，乳酸的终浓度为0.5~1.8 g/L，苯乳酸终浓度为1~13 mg/L。

（3）一种布氏乳杆菌（Lactobacillus buchneri）GBS3在微生物转化制备苯乳酸中的应用。

进一步，该应用以所述的布氏乳杆菌（Lactobacillus buchneri）GBS3菌株为出发菌株发酵所得的菌体为全细胞生物催化剂，以苯丙酮酸和葡萄糖溶液为关键底物，在进行微生物转化，得到含苯乳酸的转化液。

进一步，所述的微生物转化条件为：葡萄糖14 g/L，苯丙酮酸15 g/L，溶剂为100mM pH 8的磷酸盐缓冲液，布氏乳杆菌（Lactobacillus buchneri）GBS3菌株菌体浓度100g/L，转化温度35℃，转化时间4 h，搅拌速度70 rpm。

更进一步，所述的含苯乳酸的转化液中，苯乳酸的终浓度可达12 g/L。

通过采用上述技术，与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

（1）本发明提供的菌株分离自传统泡菜，生物安全性很好，发酵周期短，能够同步发酵合成乳酸和苯乳酸。

（2）本发明提供的布氏乳杆菌，可以作为全细胞生物催化剂，能够将苯丙酮酸高效转化为苯乳酸，转化迅速，转化液中苯乳酸的浓度可达12 g/L，放大容易，具有很好的工业应用前景。

具体实施方式

为了更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1

本发明从传统泡菜中进行菌株分离筛选。取一定量泡菜汁液，于无菌水中进行稀释，在含有碳酸钙的固体培养基（组成：葡萄糖20 g，蛋白胨10 g，柠檬酸氢二胺2 g，无水乙酸钠5g，硫酸锰0.25 g，硫酸镁0.58 g，磷酸氢二钾2 g，酵母膏5 g，牛肉膏10 g，吐温80 1 g，琼脂20 g，碳酸钙30 g，去离子水1 L，pH值自然）上进行初筛，温度30℃，静置培养24~72 h。

选取过氧化氢阴性的单一菌落，接种于液体培养基（组成：葡萄糖20 g，蛋白胨10g，柠檬酸氢二胺2 g，无水乙酸钠5 g，硫酸锰0.25 g，硫酸镁0.58 g，磷酸氢二钾2 g，酵母膏5 g，牛肉膏10 g，吐温80 1 g，去离子水1 L，pH值自然），30℃静置培养24 h；复筛多次，得到一株乳杆菌株GBS3。

经检测，菌株GBS3的生理生化特征为：革兰氏阳性杆菌，0.8微米×1.5~2.0微米；成链生长、无芽孢、不运动、兼性厌氧、过氧化氢酶阴性、化能异养。

结合菌株生理生化特征及16S rDNA序列，与GreenGenes16S rRNA 基因数据库进行比对，将菌株GBS3鉴定为布氏乳杆菌（Lactobacillus buchneri），命名为布氏乳杆菌（Lactobacillus buchneri）GBS3，已于2016年4月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC No. M 2016215。

实施例2

以本发明所述的布氏乳杆菌（Lactobacillus buchneri）GBS3菌株为出发菌株，于1 L液体培养基（组成：葡萄糖20 g，蛋白胨10 g，柠檬酸氢二胺2 g，无水乙酸钠5 g，硫酸锰0.25 g，硫酸镁0.58 g，磷酸氢二钾2 g，酵母膏5 g，牛肉膏10 g，吐温80 1 g，去离子水1L，pH值自然）中进行静置发酵，温度控制在25~35℃，发酵24小时，得到含有乳酸和苯乳酸的发酵液；用高效液相色谱进行检测分析，所得发酵液中的乳酸浓度为0.5 g/L，苯乳酸终浓度为1 mg/L。

实施例3

以本发明所述的布氏乳杆菌（Lactobacillus buchneri）GBS3菌株为出发菌株，于1 L液体培养基（组成同实施例2）中进行静置发酵，温度控制在25~35℃，发酵72小时，得到含乳酸和苯乳酸的发酵液；用高效液相色谱进行检测分析，所得发酵液中的乳酸浓度1.8 g/L，苯乳酸终浓度13 mg/L。

实施例4

以本发明所述的布氏乳杆菌（Lactobacillus buchneri）GBS3菌株为出发菌株，于1.5L液体培养基（组成同实施例2）中进行静置发酵，温度控制在25~35℃，发酵72小时，取其中离心所得的2 g菌体，作为全细胞催化剂，取20 mL含0.28 g葡萄糖和0.30 g苯丙酮酸的溶液（100 mM pH 8磷酸盐缓冲液）为底物，转化4小时，温度35℃，搅拌速度70 rpm，得到转化液；用高效液相色谱进行检测分析，所得转化液中苯乳酸浓度12 g/L。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江工业大学

<120> 一种布氏乳杆菌及其应用

<130> 1

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 949

<212> DNA

<213> 菌株GBS3

<400> 1

ggaacgtggc ggggtgctat actgcaagtc gaacgcgtct ccgttgatga ttttaggtgc 60

ttgcacttga aagatttaac attgagacga gtggcgaact ggtgagtaac acgtgggtaa 120

cctgcccttg aagtagggga taacacttgg aaacaggtgc taataccgta taacaaccaa 180

aaccacctgg ttttggttta aaagacggct tcggctgtca ctttaggatg gacccgcggc 240

gtattagctt gttggtaagg taacggccta ccaaggcgat gatacgtagc cgacctgaga 300

gggtaatcgg ccacattggg actgagacac ggcccaaact cctacgggag gcagcagtag 360

ggaatcttcc acaatggacg aaagtctgat ggagcaacgc cgcgtgagtg atgaagggtt 420

tcggctcgta aaactctgtt gttggagaag aacaggtgtc agagtaactg ttgacatctt 480

gacggtatcc aaccagaaag ccacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag 540

gtggcaagcg ttgtccggat ttattgggcg taaagcgagc gcaggcggtt ttttaggtct 600

gatgtgaaag ccttcggctt aaccggagaa gtgcatcgga aaccgggaga cttgagtgca 660

gaagaggaca gtggaactcc atgtgtagcg gtgaaatgcg tagatatatg gaagaacacc 720

agtggcgaag gcggctgtct ggtctgtaac tgacgctgag gctcgaaagc atgggtagcg 780

aacaggatta gataccctgg tagtccatgc cgtaaacgat gagtgctaag tgttggaggg 840

tttccgccct tcagtgctgc agctaacgca ttaagcactc cgcctgggga gtacgaccgc 900

aaggttgaaa ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag cggtggaac 949

Claims

1.一种布氏乳杆菌株（Lactobacillus buchneri）GBS3，保藏编号为CCTCC No. M2016215。

2.如权利要求1所述的一种布氏乳杆菌（Lactobacillus buchneri）GBS3在同步发酵合成乳酸和苯乳酸中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于以所述的布氏乳杆菌（Lactobacillus buchneri）GBS3为出发菌株，在液体培养基中进行发酵，得到含有乳酸和苯乳酸的发酵液。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述的液体培养基组成为：葡萄糖20 g，蛋白胨10 g，柠檬酸氢二胺2 g，无水乙酸钠5 g，硫酸锰0.25 g，硫酸镁0.58 g，磷酸氢二钾2 g，酵母膏5 g，牛肉膏10 g，吐温80 1 g，去离子水1 L，pH值自然；发酵条件为：温度25~35℃，发酵时间24~72h，静置发酵。

5.如权利要求1所述的一种布氏乳杆菌（Lactobacillus buchneri）GBS3在微生物转化制备苯乳酸中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于以所述的布氏乳杆菌（Lactobacillus buchneri）GBS3为出发菌株发酵所得的菌体为全细胞生物催化剂，以苯丙酮酸和葡萄糖溶液为主要底物，进行微生物转化，得到含苯乳酸的转化液。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述的微生物转化条件为：葡萄糖14 g/L，苯丙酮酸15 g/L，溶剂为100 mM pH 8的磷酸盐缓冲液，布氏乳杆菌（Lactobacillus buchneri）GBS3菌株菌体浓度100 g/L，转化温度35℃，转化时间4 h，搅拌速度70 rpm。