CN111269847A - 一种高效产丙酮酸的菌株Desemzia incerta及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种产丙酮酸的Desemzia incerta L243菌株及其应用，所述Desemzia incerta L243菌株于2019年10月8日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏编号为：GDMCC No：60802。本发明所述Desemzia incerta L243菌株可发酵产丙酮酸，其发酵液中的丙酮酸含量可达117mg/mL，可用于在医药工业中制备其它药剂，具有较大的应用前景。

Description

一种高效产丙酮酸的菌株Desemzia incerta及其应用
技术领域
本发明涉及微生物应用技术领域，更具体地，涉及一种高效产丙酮酸的菌株Desemzia incerta及其应用。
背景技术
丙酮酸是重要的有机合成中间体，其广泛应用于医药、化妆品、化学品生产等工业中，丙酮酸在医药工业上用于合成治疗高血压的新药血管紧张肽Ⅱ、系列蛋白酶抑制，剂、镇静剂、消炎镇痛药辛可芬、药物磷酸烯醇丙酮酸、4-甲唑甲酸、抗结核药异烟肼丙酮酸钙、解热药2-苯基喹啉-4-羧酸以及噻咪唑药物等。尤其是在减肥产品中的大量应用，引起生产和研究的热潮。
丙酮酸的生产有化工法和生物技术法两种。相对于化工法生产的丙酮酸而言，生物技术法生产的丙酮酸具有低成本、高质量等优势。目前已知报道生物法生产丙酮酸的主要有菌株有光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata)，解脂假丝酵母 (Candidalipolytica)，裂褶菌(Schizophyllum commune)，Agaricus campestris，大肠杆菌(Escherichia coli)，Enterococcus casseliflavus，产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes)，不动杆菌(Acinetobacter sp.)，Debaryomyces coudertii等。目前还见有产丙酮酸的德库菌属(Desemzia)菌株的相关报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种高效产丙酮酸的Desemzia incerta L243菌株。
本发明的另一目的在于提供所述Desemzia incerta L243菌株的应用。
本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：
本发明第一次从生物气溶胶中分离筛选到了一株产丙酮酸的Desemzia incertaL243菌株，所述菌株于2019年10月8日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏编号为：GDMCC No：60802。
所述Desemzia incerta L243菌株具有如下形态和生理、生化特性：
a.菌体形态特征及生理生化特性：采用常规的细菌生理生化鉴定方法和电子显微镜观察，所述菌株L243为革兰氏阳性，杆状，氧化酶阴性，过氧化氢酶阳性，生长最佳pH 6～8，最佳温度是37℃。
b.菌落形态特征：所述菌株L243在营养琼脂培养基平板上培养24h后，菌落表面淡黄色，圆形，有小的凸起。
进一步地，所述Desemzia incerta L243菌株的16S rDNA序列如SEQ ID NO： 1所示。
本发明的Desemzia incerta L243菌株可发酵产丙酮酸，其发酵液中的丙酮酸含量可达117mg/mL。因此本发明请求保护所述的Desemzia incerta L243菌株在制备丙酮酸中的应用。
优选地，为Desemzia incerta L243菌株发酵液在制备丙酮酸中的应用。
具体地，将Desemzia incerta L243菌株接种至发酵培养液中，发酵产丙酮酸。
优选地，所述发酵培养液配方为：10％葡萄糖，0.1％大豆蛋白胨， 0.6％(NH4)2SO4，0.1％KH2PO4，0.05％MgSO4·7H2O和4％CaCO3，pH 5.5。
优选地，将对数生长期Desemzia incerta L243菌株接种至发酵培养液中，34～38℃(优选37℃)培养5～15h(10h)发酵产丙酮酸。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种产丙酮酸的Desemzia incerta L243菌株，所述Desemziaincerta L243菌株于2019年10月8日保藏于广东省微生物菌种保藏中心 (GDMCC)，保藏编号为：GDMCC No：60802。本发明所述Desemzia incerta L243 菌株可高效产丙酮酸，其发酵液中的丙酮酸含量可达117mg/mL，可用于在医药工业中制备其它药剂，具有较大的应用前景。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1 Desemzia incerta L243菌株的分离和鉴定
1、Desemzia incerta L243菌株的分离
(1)培养基配置
筛选培养基：硫酸铵0.5g，Na2S2O3·5H2O 10.00g，蛋白胨1g，CaCl2 0.2g， KH2PO43g，微量元素溶液10mL，蒸馏水1000mL，pH 7.0，121℃、20min灭菌。
微量元素溶液(g L-1)：乙二酸四乙酸二钠(EDTA)0.22g，(NH4)6Mo7O24·4H2O0.11g，CoCl2·6H2O 0.1g，MnCl2·4H2O 0.425g，ZnCl2 0.05g，CuSO4·5H2O 0.015g，Na2SeO4·2H2O 0.01g，其配制方法是按照上述各成分的含量加入到1L水中，搅拌溶解，即得。
(2)本发明的Desemzia incerta L243菌株是从南方医科大学的运动场的空气中分离、纯化而得。其分离纯化方法如下：
使用安德森六级空气微生物采样器BY-300采集空气样品，采样前给主机充好电，用75％酒精擦拭撞击器并紫外30分钟。采样时，在选定的采样地点，用三脚架将撞击器支起，放置于距离地面1.5米的高度，用橡胶管连接好主机，校正流量，使采样流量稳定在28.3L/min。带好口罩和手套，一手打开培养盖一手迅速盖上撞击盘，将培养皿(里面含有筛选培养基)按顺序放入。打开撞击器进去口上盖，离开采样点2米之外，启动采用。采样时间为10分钟，3次重复。记录采样当天气象参数。采样结束后，迅速取出采样平皿扣上盖子，放入无菌箱中带回实验室。皿底朝上，于37℃恒温箱中培养24小时，检查菌落生长情况。从中挑取快速生长的菌落进行纯化，并使用硫化物氧化能力筛选，最后获得菌株L243。
2、Desemzia incerta L243菌株的鉴定
(1)菌株L243的形态和生理、生化特性鉴定：
a.菌体形态特征及生理生化特性：采用常规的细菌生理生化鉴定方法和电子显微镜观察，所述菌株L243为革兰氏阳性，杆状，氧化酶阴性，过氧化氢酶阳性，生长最佳pH 6～8，最佳温度是37℃。
b.菌落形态特征：所述菌株L243在营养琼脂培养基平板上培养24h后，菌落表面淡黄色，圆形，有小的凸起。
(2)Desemzia incerta L243的分子生物学鉴定：
提取菌株菌株L243的16S rRNA并测序，其序列如SEQ ID NO.1所示，将其与 NCBI网站数据库进行BLAST分析，结果分析表明，其与菌株Desemzia incerta的模式菌种的相似性最高，其中与Desemzia incerta DSM 20581T的序列相似性为 99％。综合上述的生理生化特性、16S rRNA基因序列结果，鉴定菌株L243属于 Desemzia incerta，分类命名为Desemzia incerta L243菌株。所述Desemzia incerta L243菌株于2019年10月8日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所，邮编：510070，保藏编号为：GDMCC No：60802。
实施例2 Desemzia incerta L243菌株发酵产丙酮酸
1、Desemzia incerta L243发酵液的制备
挑取在平板上生长至对数生长期的Desemzia incerta L243菌株菌落1个，接种到发酵液体培养基中，37℃培养10h既得发酵液，用于后续丙酮酸产量的研究。所述发酵液体培养基的配方：10％葡萄糖，0.1％大豆蛋白胨，0.6％(NH4)2SO4， 0.1％KH2PO4，0.05％MgSO4·7H2O和4％CaCO3，pH 5.5。
2、丙酮酸产量的测定方法
(1)标准曲线的绘制：配置0.1mol/L的丙酮酸标准溶液，按表1顺序分别在5mL容量瓶按依次加入标准溶液，然后定容，摇匀显色，在540nm波长下比色测吸光值，作出标准曲线。
表1硝酸铁化学比色法各溶液加量
Figure RE-GDA0002449796890000041
(2)取10微升发酵液经无水乙醇稀释到1mL，转移至于5mL容量瓶中，加入2mL0.1mol/L硝酸铁，定容。在540nm下比色，查标准曲线得到发酵液中丙酮酸产量。OD540＝0.11，Y＝1.2872，1mL原液中的丙酮酸含量为128.72mg。
取10微升发酵液经无水乙醇稀释到1mL，转移至于5mL容量瓶中，加入2mL 0.1mol/L硝酸铁，定容。在540nm下比色，查标准曲线得到发酵液中丙酮酸产量。 OD540＝0.099，Y＝1.1583，1mL原液中的丙酮酸含量为115.83mg。
取10微升发酵液经无水乙醇稀释到1mL，转移至于5mL容量瓶中，加入2mL 0.1mol/L硝酸铁，定容。在540nm下比色，查标准曲线得到发酵液中丙酮酸产量。 OD540＝0.091，Y＝1.0645，1mL原液中的丙酮酸含量为106.45mg。
经过上述三次重复，测得Desemzia incerta L243菌株发酵液中丙酮酸含量为117mg/mL。
序列表
<110> 南方医科大学
<120> 一种高效产丙酮酸的菌株Desemzia incerta及其应用
<141> 2019-11-14
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1404
<212> DNA
<213> Desemzia incerta L243
<400> 1
gcagtcgaac gcttcctacc ggtgcttgca ccgggaaaga agagtggcgg acgggtgagt 60
aacacgtggg taacctacct acaagcgggg gataacattc ggaaacggat gctaataccg 120
catagatctt tttgtctcct ggcagaaaga agaaagacgg tttcggctgt cacttgtaga 180
tggacccgcg gcgcattagt tagttggtga ggtaatggct caccaagacg atgatgcgta 240
gccgacctga gagggtgatc ggccacactg ggactgagac acggcccaga ctcctacggg 300
aggcagcagt agggaatctt ccgcaatgga cgaaagtctg acggagcaac gccgcgtgag 360
tgaagaaggt tttcggatcg taaaactctg ttgttagaga agaacaagga tgagagtaac 420
tgctcgtccc ttgacggtat ctaaccagaa agccatggct aactacgtgc cagcagccgc 480
ggtaatacgt agatggcaag cgttgtccgg atttattggg cgtaaagcga gcgcaggcgg 540
ttctttaagt ctgatgtgaa agcccctggc tcaaccaggg agggtcattg gaaactggag 600
aacttgagtg cagaagagga aagtggaatt ccatgtgtag cggtgaaatg cgtagatata 660
tggaggaaca ccagtggcga aggcgacttt ctggtctgta actgacgctg aggctcgaaa 720
gcatggggag caaacaggat tagataccct ggtagtccat gccgtaaacg atgagtgcta 780
agtgttggag ggtttccgcc cttcagtgct gcagctaacg cattaagcac tccgcctggg 840
gagtacgacc gcaaggttga aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag 900
catgtggttt aattcgaagc aacgcgaaga accttacaag gtcttgacac atcctttgac 960
cactctagag atagagcttt cccttcgggg acaaagtgac aggtggtgca tggttgtcgt 1020
cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt cccgcaacga gcgcaaccct tattattagt 1080
tgccagcatt cagttgggca ctctagtgag actgccggtg ataaaccgga ggaaggtggg 1140
gatgacgtca aatcatcatg ccccttatga cctgggctac acacgtgcta caatggatgg 1200
tacaacgagt cgcaaaaccg cgaggttaag ctaatctctt aaagccattc tcagttcgga 1260
ttgtaggctg caattcgcct acatgaagcc ggaatcgcta gtaatcgcgg atcagaacgc 1320
cgcggtgaat acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt cacaccacga gagtttgtaa 1380
cacccaaagt cggtagaggt aagc 1404

Claims (6)

1.一种产丙酮酸的Desemzia incerta L243菌株，其特征在于，所述菌株于2019年10月8日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏编号为：GDMCC No：60802。
2.根据权利要求1所述的Desemzia incerta L243菌株，其特征在于，所述菌株的16SrDNA序列如SEQ ID NO：1所示。
3.权利要求1所述的Desemzia incerta L243菌株或其发酵液在制备丙酮酸中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，将权利要求1所述Desemzia incerta L243菌株接种至发酵培养液中，发酵产丙酮酸。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述发酵培养液配方为：10％葡萄糖，0.1％大豆蛋白胨，0.6％(NH4)2SO4，0.1％KH2PO4，0.05％MgSO4·7H2O和4％CaCO3，pH 5.5。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，将对数生长期的Desemzia incerta L243菌株接种至发酵培养液中，34～38℃，150r/min培养5～15h发酵产丙酮酸。
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