CN112852678B - 一株产烟酰胺单核苷酸的成都肠杆菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一株产烟酰胺单核苷酸的成都肠杆菌及其应用，涉及菌株的筛选与应用技术领域。本发明所述成都肠杆菌从生产NMN相关产品的工厂的下水道附近采集土壤，通过初筛，复筛，挑选出土壤中转化烟酰胺生成烟酰胺单核苷酸能力强的菌株，并对其进行鉴定与保藏，经测定所述肠杆菌为革兰氏阴性菌，属于成都肠杆菌属。以烟酰胺为底物利用所述成都肠杆菌在发酵生产NMN时，15min时NMN产量能达到67.66μM，即22.6mg/L，表明该野生菌株具有很强的合成NMN的活性，降低了合成NMN时对Nampt的依赖性，具有较高的规模化应用前景。

Description

一株产烟酰胺单核苷酸的成都肠杆菌及其应用
技术领域
本发明属于菌株的筛选与应用技术领域，具体涉及一株产烟酰胺单核苷酸的成都肠杆菌及其应用。
背景技术
烟酰胺单核苷酸(Nicotinamide Mononucleotide，NMN)是一种有机分子，也是一种核苷酸，具有逆转衰老和延长寿命的作用。
目前，多采用酶促反应来实现烟酰胺单核苷酸的大规模合成，但是酶促反应成本高昂，反应条件苛刻，生产工艺不稳定，每个批次产品指标相差大，反应产能低；近些年也有通过生物手段发酵生产NMN的方法，但是天然烟酰胺磷酸核糖转移酶(NiaciNamidephosphoribosyltransferase，Nampt)存在酶活性较低的问题，且催化耗时长、成本高、收率低，难以实现工厂化大规模生产，限制了NMN的大规模应用。为此，中国专利CN201811606780.9中公开了一种利用重组大肠杆菌发酵NMN的方法，但是转基因重组菌株成本较高，且生物安全性存疑，尤其是将其应用到化妆品、食品或药品中时。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一株产烟酰胺单核苷酸且具有高生产活性的成都肠杆菌及其应用，所述成都肠杆菌可催化烟酰胺(nicotinamide，Nam)生成NMN，为后续的工业化生产奠定基础。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一株产烟酰胺单核苷酸的成都肠杆菌(Enterobacterchengduensis)2021T4.7，所述成都肠杆菌2021T4.7的生物保藏编号为CGMCCNo.21695。
优选的，所述成都肠杆菌2021T4.7的16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供了上述成都肠杆菌2021T4.7在生产烟酰胺单核苷酸中的应用。
本发明还提供了一种利用上述成都肠杆菌2021T4.7生产烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)以烟酰胺为诱导物，将所述成都肠杆菌2021T4.7在发酵培养基中进行发酵富集，发酵后先离心再用PBS缓冲液重悬，得到菌液；所述发酵培养基包括以下质量百分含量的组分：葡萄糖0.25％～1.5％、胰蛋白胨0.25％～1.5％、KH2PO40～1.5％和MgSO4·7H2O 0～0.15％，pH值为5～10；
(2)以烟酰胺为底物，利用步骤(1)得到的菌液进行发酵反应，得烟酰胺单核苷酸。
优选的，步骤(1)中诱导物烟酰胺的质量百分含量为0～1.25％。
优选的，步骤(1)中发酵培养基的pH值为7.0。
优选的，步骤(1)中所述发酵富集的温度为25～40℃，时间为12～24h。
优选的，进行步骤(2)所述发酵反应时还包括母液，所述母液与菌液的体积比为1:1；所述母液包括以下浓度的组分：50mM Tris-Hcl缓冲液、质量浓度为0.02％BSA、12mMMgCl2、2mMATP、2mM DTT和40μM prpp。
优选的，步骤(2)中底物烟酰胺的浓度为100～1000μM。
优选的，步骤(2)所述发酵反应的温度为37℃，时间为15min。
本发明提供了一株产烟酰胺单核苷酸的成都肠杆菌2021T4.7，从生产NMN相关产品的工厂的下水道附近采集土壤，通过初筛，复筛，挑选出土壤中转化烟酰胺生成烟酰胺单核苷酸能力强的菌株，并对其进行鉴定与保藏，经测定所述成都肠杆菌2021T4.7为革兰氏阴性菌，属于成都肠杆菌属。
以烟酰胺为底物利用所述成都肠杆菌2021T4.7在发酵生产NMN时，15min时NMN产量能达到67.66μM，即22.6mg/L，表明该野生菌株具有很强的合成NMN的活性，能提供Nampt的同工酶，降低了合成NMN时对Nampt的依赖性。本发明所述肠杆菌为野生菌，相比于利用重组菌发酵NMN，成本更低，生物安全性更高。
生物保藏信息
成都肠杆菌(Enterobacter chengduensis)2021T4.7，于2021年01月21日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，具体地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.21695。
附图说明
图1为NMN浓度与荧光度标准曲线；
图2为肠杆菌菌体形态图；
图3为肠杆菌经革兰氏染色后染色结果；
图4为步骤(1)发酵培养基中葡萄糖含量优化对NMN产量影响图；
图5为步骤(1)发酵培养基中胰蛋白胨含量优化对NMN产量影响图；
图6为步骤(1)发酵培养基中KH2PO4含量优化对NMN产量影响图；
图7为步骤(1)发酵培养基中MgSO4·7H2O含量优化对NMN产量影响图；
图8为步骤(1)诱导物烟酰胺含量优化对NMN产量影响图；
图9为步骤(1)发酵培养基初始pH值优化对NMN产量影响图；
图10为步骤(1)发酵富集温度优化对NMN产量影响图；
图11为步骤(1)发酵富集时间优化对NMN产量影响图；
图12为在步骤(1)发酵富集最优条件时步骤(2)底物烟酰胺含量优化对NMN产量影响图。
具体实施方式
本发明提供了一株产烟酰胺单核苷酸的成都肠杆菌(Enterobacterchengduensis)2021T4.7，所述成都肠杆菌2021T4.7的生物保藏编号为CGMCC No.21695。
本发明所述成都肠杆菌2021T4.7为革兰氏阴性菌，16S rDNA序列优选如SEQ IDNO.1所示：TTACTGGGCGTAAGCGCACGCAGGCGGTCTGTCAAGTCGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTCGAAACTGGCAGGCTAGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACAAAGACTGACGCTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCGACTTGGAGGTTGTGCCCTTGAGGCGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAGTCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCTTGACATCCAGAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACTCTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGTTGCCAGCGGTTAGGCCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCAGTGATAAACTGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGCATACAAAGAGAAGCGACCTCGCGAGAGCAAGCGGACCTCATAAAGTGCGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTAGATCAGAATGCTACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCAAAAGAAGTAGGTAGCTTAACCTTCGGGAGGGCGCTTACCACTTTGTGATTCATGACTGGGGTGAA，且所述序列与NCBI数据库中可获得的已知物种的序列相似度为99％，确定所述菌株为肠杆菌属。
本发明所述成都肠杆菌2021T4.7筛选分离自邦泰生物工程(深圳)有限公司工厂下水管道附近的土壤，经初筛和复筛，挑选出的具有转化烟酰胺生成烟酰胺单核苷酸能力的菌株。
本发明还提供了上述成都肠杆菌2021T4.7在生产烟酰胺单核苷酸中的应用。本发明所述成都肠杆菌2021T4.7具有分解烟酰胺并生成烟酰胺单核苷酸的能力，可将所述成都肠杆菌2021T4.7用于烟酰胺单核苷酸的工业生产。
本发明还提供了一种利用上述成都肠杆菌2021T4.7生产烟酰胺单核苷酸的方法，包括以下步骤：
(1)以烟酰胺为诱导物，将所述成都肠杆菌2021T4.7在发酵培养基中进行发酵富集，发酵后先离心再用PBS缓冲液重悬，得到菌液；所述发酵培养基包括以下质量百分含量的组分：葡萄糖0.25％～1.5％、胰蛋白胨0.25％～1.5％、KH2PO40～1.5％和MgSO4·7H2O 0～0.15％，pH值为5～10；
(2)以烟酰胺为底物，利用步骤(1)得到的菌液进行发酵反应，得烟酰胺单核苷酸。
本发明以烟酰胺为诱导物，将所述成都肠杆菌2021T4.7在发酵培养基中进行发酵富集，发酵后先离心再用PBS缓冲液重悬；所述发酵培养基包括以下质量百分含量的组分：葡萄糖0.25％～1.5％、胰蛋白胨0.25％～1.5％、KH2PO40～1.5％和MgSO4·7H2O 0～0.15％，pH值为5～10。本发明所述发酵培养基以葡萄糖为碳源，以胰蛋白胨为氮源，以烟酰胺为诱导物，且所述发酵培养基中葡萄糖的质量百分含量优选为1％，胰蛋白胨的质量百分含量优选为1.25％，KH2PO4的质量百分含量优选为0.75％，MgSO4·7H2O的质量百分含量优选为0.025％，诱导物烟酰胺的质量优选为所述发酵培养基质量的0～1.25％，更优选为1％。本发明所述发酵培养基的pH值优选为7。本发明对所述发酵培养基的制备方法并没有特属于限定，优选将各组分混合均匀即可。本发明对所述发酵培养基中各组分的来源并没有特殊限定。本发明所述发酵培养基中含有烟酰胺，起诱导作用，可用于扩增所述肠杆菌。
本发明进行所述发酵富集时，所述肠杆菌的接种体积优选为所述发酵培养基体积的0.1％～2％，更优选为1.5％。本发明所述发酵富集的温度优选为25～40℃，更优选为37℃，且所述发酵富集的时间优选为12～24h，更优选为20h。本发明在所述发酵富集过程中优选伴随振荡，所述振荡频率优选为200rpm。
本发明在所述发酵后先离心再用PBS缓冲液重悬，所述离心优选4℃转速为4000rmp，时间优选为20min。本发明对所述PBS缓冲液重悬的方法并没有特殊限定，利用本领域的常规方法进行重悬即可，优选将经所述重悬后的菌液的OD600调节为1.5。
得菌液后，本发明以烟酰胺为底物，利用所述菌液进行发酵反应，得烟酰胺单核苷酸。本发明所述发酵反应优选在菌液和母液按体积1:1混合而成的体系进行，其中母液组成优选包括：50mM Tris-Hcl缓冲液、质量浓度为0.02％BSA、12mM MgCl2、2mMATP、2mM DTT和40μM prpp。本发明所述发酵反应时，底物烟酰胺的浓度优选100～1000μM，更优选400μM；反应优选为在37℃反应15min。
本发明还提供了一组鉴定上述成都肠杆菌2021T4.7的引物对，所述引物对包括上游引物516f和下游引物1540r，所述上游引物516f的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示：TGCCAGCAGCCGCGGTA，所述下游引物1540r的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示：AGGAGGTGATCCAGCCGCA。
下面结合实施例对本发明提供的一株产烟酰胺单核苷酸的成都肠杆菌及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
本发明实施例中各培养基的组成成分及来源，如非特殊说明，均为常见的市售产品。
实施例1菌株筛选及鉴定
1、土壤采集与预处理
采集邦泰生物工程(深圳)有限公司工厂下水管道附近的土壤，采样深度为5cm～10cm。称取1g土壤样品至50ml锥形瓶中，加入20ml生理盐水并至于摇床中，充分摇匀后取出静置备用。
2、富集培养：吸取预处理后的土壤悬浊液的上层清液1ml接种于富集培养基(10ml/50ml锥形瓶)中，于37℃、150r/min恒温培养箱培养12h。富集培养基组成包括：2g/L烟酰胺、5g/L葡萄糖、5g/L酵母膏、5g/L蛋白胨、14g/LK2HPO4·3H2O、5.2g/LKH2PO4及2g/LMgSO4·7H2O，富集培养基pH为7.0。
3、筛选
初筛：对富集液用生理盐水进行逐级梯度稀释，取稀释至10-4、10-5、10-6梯度的菌液进行菌种初筛工作。取100μl稀释液于初筛平板分离培养基上进行涂布，过夜培养，次日挑取平板上的单菌落(挑选形态，颜色，大小不同的菌)，移至96深孔细胞板中(同初筛平板分离培养基)进行振荡培养，转速600r/min，培养12h。利用酶标仪检测方法检测各样品中NMN含量，根据荧光强弱挑选出NMN含量高的菌株，甘油管进行菌种保藏。初筛平板分离培养基组成包括：2g/L烟酰胺、5g/L酵母膏、5g/L蛋白胨、14g/L K2HPO4·3H2O、5.2g/L KH2PO4及14g/LMgSO4·7H2O，初筛平板分离培养基pH为7.0。
复筛：将初筛得到的菌种，以1％的接种量接种至营养琼脂培养基中(10ml/50ml锥形瓶)进行发酵传代培养，测量发酵液的OD600值，并进行酶转化反应实验，测定NMN衍生化后体系的荧光强度，依据产物浓度，转化率指标复筛出高产烟酰胺单核苷酸的菌种。营养琼脂培养基组成包括：12.5g/L琼脂粉、10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、5g/L NaCl，营养琼脂培养基pH为7.0。
4、酶转化反应实验：取1ml富集培养的菌液，先离心去除上清液中的培养液，再用PBS缓冲液进行重悬(已去除发酵培养基中的烟酰胺)，测定OD600的值，通过调节使OD600为1.5时菌液浓度即为合适。以Nam为底物，取50mM Tris-Hcl缓冲液、质量浓度为0.02％BSA、12mM MgCl2、2mMATP、2mM DTT、40μM prpp和80μM Nam共计12.5μl，取菌液12.5μl，依次加入黑色96孔酶标板(测荧光专用)中，振荡混匀，置于37℃反应15分钟。
5、NMN产量测定
NMN在激发波长382nm、发射波长445nm处有荧光信号，据此可以比较不同菌种生成NMN的能力。
酶转化反应结束后，在96孔酶标板反应的孔中加入20％苯乙酮10μl，2M KOH 10μl，振荡混合均匀，此时会产生白色沉淀，放入设置0℃的金属浴中，反应10min。从金属浴取出酶标板，加入45μl 88％的甲酸，金属浴设置为70℃，随后于金属浴中反应5min。冷却后，在酶标仪激发波长382nm、发射波长445nm处测定荧光强度，gain值设置为70。
在本实施例“酶转化反应实验”相同反应体系下，加入NMN配置成不同浓度(0，5μM，10μM，15μM，20μM，25μM，30μM，35μM，40μM，45μM，50μM，55μM，60μM，70μM及80μM)，在酶标仪激发波长382nm、发射波长445nm处测定荧光强度，gain值设置为70，得到NMN浓度与荧光强度标准曲线，如图1所示，其中x轴表示NMN浓度，y轴表示荧光度，y＝66.176x-56.662，R2＝0.9965。据此标准曲线可得出不同荧光强度下对应的NMN浓度。
6、菌株鉴定
形态观察：取甘油管保藏的菌株进行LB液体培养基活化培养(37℃，180rmp，振荡培养12h)，取菌液稀释并涂布至LB平板分离培养基中培养分离出单菌落，观察菌种的固体平板单菌落状态，结果如图2所示。取分离纯化后的单菌落过夜培养，按照革兰氏染色方法进行染色，在显微镜下观察革兰氏染色结果，结果如图3所示。该菌株是一种革兰氏阴性菌，属于成都肠杆菌属。
采用购于生工生物工程(上海)股份有限公司的细菌基因组DNA快速抽提试剂盒来进行提取染色体中的DNA，采用PCR进行扩增，之后进行琼脂糖凝胶电泳分析，扩增的DNA序列长度约为1000bp左右，将PCR扩增产物送至广州艾基生物技术有限公司进行16S rDNA测序，测序结果如SEQ ID NO.1所示，鉴定为成都肠杆菌属，命名为成都肠杆菌2021T4.7。
PCR的上游引物和下游引物为：516f：TGCCAGCAGCCGCGGTA，1540r：AGGAGGTGATCCAGCCGCA。
实施例2成都肠杆菌2021T4.7发酵富集条件优化对NMN产量的影响
成都肠杆菌2021T4.7在发酵培养基中进行发酵富集时，依次改变发酵培养基各组分浓度(包括葡萄糖浓度、胰蛋白胨浓度、KH2PO4浓度、MgSO4·7H2O浓度)、发酵培养基初始pH值、诱导物Nam浓度、发酵富集温度及时间，而其他条件不变，在200rpm恒温摇床振荡培养；之后在实施例1“酶转化反应实验”条件下进行发酵，结束后测定OD600及酶活。
1、在发酵培养基中分别加入不同浓度葡萄糖(0.25％，0.5％，0.75％，1％，1.25％，1.5％，质量分数)，而其他成分不变结果如图4所示，当葡萄糖浓度为1％时，NMN产量最高，为47.36μM；
2、在发酵培养基中加入不同浓度胰蛋白胨(0.25％，0.5％，0.75％，1％，1.25％，1.5％，质量分数)、1％的葡萄糖，其他成分保持不变，结果如图5所示，当胰蛋白胨浓度为1.25％时，NMN产量最高，达55.67μM；
3、在发酵培养基中加入不同浓度KH2PO4(0，0.25％，0.5％，0.75％，1％，1.25％，1.5％，质量分数)、1％的葡萄糖及1.25％胰蛋白胨，其他成分保持不变，结果如图6所示，KH2PO4的含量为0.75％时，NMN产量最高，为51.43μM；
4、在发酵培养基中加入不同浓度MgSO4·7H2O(0，0.025％，0.05％，0.075％，0.1％，0.125％，0.15％，质量分数)、1％葡萄糖、1.25％胰蛋白胨及0.75％KH2PO4，其他条件保持不变，结果如图7所示，MgSO4·7H2O的含量为0.025％时，NMN产量最高，为50.93μM；
5、在发酵培养基中加入不同浓度诱导物烟酰胺(0％，0.25％，0.5％，0.75％，1.0％，1.25％，质量分数)、1％葡萄糖、1.25％胰蛋白胨、0.75％KH2PO4及0.025％MgSO4·7H2O，其他条件保持不变，结果如图8所示，诱导物烟酰胺添加量为1％时，NMN产量最高，为43.57μM；
6、采用含1％葡萄糖、1.25％胰蛋白胨、0.75％KH2PO4、0.025％MgSO4·7H2O和1％诱导物烟酰胺的发酵培养基，依次改变发酵培养基初始pH值(5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0)、发酵富集温度(25℃，28℃，30℃，34℃，37℃，40℃)和时间(12h，14h，16h，18h，20h，22h，24h)，其他条件不变，结果如图9～11所示：当发酵培养基初始pH值为7.0时，NMN产量最高，为49.31μM；当发酵富集温度为37℃时，NMN产量最高，为47.52μM；当发酵富集时间为20h时，NMN产量最高，为67.66μM。
实施例3底物Nam浓度对NMN产量的影响
在实施例2成都肠杆菌2021T4.7发酵富集最优条件时(即发酵培养基为：葡萄糖1％，胰蛋白胨1.25％，0.75％KH2PO4，0.025％MgSO4·7H2O，诱导物烟酰胺1％，pH值7.0，发酵温度37℃、发酵时间20h)，仅改变实施例1“酶转化反应实验”中底物Nam浓度(100μM、200μM、300μM、400μM、500μM、600μM、700μM、800μM、900μM、1000μM)进行发酵，其他条件不变，结束后测定OD600及酶活。
结果如图12所示，当底物Nam浓度为400μM时，NMN产量最高，为66.47μM。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 泓博元生命科技（深圳）有限公司
<120> 一株产烟酰胺单核苷酸的成都肠杆菌及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 932
<212> DNA
<213> 成都肠杆菌(Enterobacter chengduensis)
<400> 1
ttactgggcg taagcgcacg caggcggtct gtcaagtcgg atgtgaaatc cccgggctca 60
acctgggaac tgcattcgaa actggcaggc tagagtcttg tagagggggg tagaattcca 120
ggtgtagcgg tgaaatgcgt agagatctgg aggaataccg gtggcgaagg cggccccctg 180
gacaaagact gacgctcagg tgcgaaagcg tggggagcaa acaggattag ataccctggt 240
agtccacgcc gtaaacgatg tcgacttgga ggttgtgccc ttgaggcgtg gcttccggag 300
ctaacgcgtt aagtcgaccg cctggggagt acggccgcaa ggttaaaact caaatgaatt 360
gacgggggcc cgcacaagcg gtggagcatg tggtttaatt cgatgcaacg cgaagaacct 420
tacctactct tgacatccag agaactttcc agagatggat tggtgccttc gggaactctg 480
agacaggtgc tgcatggctg tcgtcagctc gtgttgtgaa atgttgggtt aagtcccgca 540
acgagcgcaa cccttatcct ttgttgccag cggttaggcc gggaactcaa aggagactgc 600
cagtgataaa ctggaggaag gtggggatga cgtcaagtca tcatggccct tacgagtagg 660
gctacacacg tgctacaatg gcgcatacaa agagaagcga cctcgcgaga gcaagcggac 720
ctcataaagt gcgtcgtagt ccggattgga gtctgcaact cgactccatg aagtcggaat 780
cgctagtaat cgtagatcag aatgctacgg tgaatacgtt cccgggcctt gtacacaccg 840
cccgtcacac catgggagtg ggttgcaaaa gaagtaggta gcttaacctt cgggagggcg 900
cttaccactt tgtgattcat gactggggtg aa 932
<210> 2
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
tgccagcagc cgcggta 17
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
aggaggtgat ccagccgca 19

Claims (10)

1.一株产烟酰胺单核苷酸的成都肠杆菌(Enterobacter chengduensis)2021T4.7，其特征在于，所述成都肠杆菌2021T4.7的生物保藏编号为CGMCC No.21695。
2.根据权利要求1所述成都肠杆菌2021T4.7，其特征在于，所述成都肠杆菌2021T4.7的16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。
3.权利要求1或2所述成都肠杆菌2021T4.7在生产烟酰胺单核苷酸中的应用。
4.一种利用权利要求1或2所述成都肠杆菌2021T4.7生产烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)以烟酰胺为诱导物，将所述成都肠杆菌2021T4.7在发酵培养基中进行发酵富集，发酵后先离心再用PBS缓冲液重悬，得到菌液；所述发酵培养基包括以下质量百分含量的组分：葡萄糖0.25％～1.5％、胰蛋白胨0.25％～1.5％、KH2PO40～1.5％和MgSO4·7H2O 0～0.15％，pH值为5～10；
(2)以烟酰胺为底物，利用步骤(1)得到的菌液进行发酵反应，得烟酰胺单核苷酸。
5.根据权利要求4所述方法，其特征在于，步骤(1)中诱导物烟酰胺的质量百分含量为0～1.25％。
6.根据权利要求5所述方法，其特征在于，步骤(1)中发酵培养基的pH值为7.0。
7.根据权利要求4所述方法，其特征在于，步骤(1)中所述发酵富集的温度为25～40℃，时间为12～24h。
8.根据权利要求4所述方法，其特征在于，进行步骤(2)所述发酵反应时还包括母液，所述母液与菌液的体积比为1:1；所述母液包括以下浓度的组分：50mM Tris-Hcl缓冲液、质量浓度为0.02％BSA、12mM MgCl2、2mM ATP、2mM DTT和40μM prpp。
9.根据权利要求4所述方法，其特征在于，步骤(2)中底物烟酰胺的浓度为100～1000μM。
10.根据权利要求4所述方法，其特征在于，步骤(2)所述发酵反应的温度为37℃，时间为15min。
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