CN117402766A - 一种菌株及其在生产β-烟酰胺单核苷酸中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种菌株及其在生产β‑烟酰胺单核苷酸中的应用。一种大肠杆菌(Escherichia coli)的菌株，所述菌株的保藏编号为CCTCC M2022922。本发明提供一种新的生产β‑烟酰胺单核苷酸(NMN)的菌株，使用该菌株制备NMN具有产量高、方法简单的优点。
Description
技术领域
本发明属于生物发酵领域，具体涉及一种菌株及其在生产β-烟酰胺单核苷酸中的应用。
背景技术
β-烟酰胺单核苷酸又称烟酰胺单核苷酸(nicotinamide mononucleotide，NMN)，是人体内天然存在的物质，是细胞能量重要来源之一。NMN作为哺乳动物体内辅酶I——烟酰胺腺嘌呤核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+)合成的关键前体之一，逐渐被研究者了解和研究。NMN通过提高NAD+水平发挥抗衰老功能。随着对NMN研究的逐渐深入，研究人员认为补充NMN可以修复脑损伤、改善胰岛功能、保护心脏免于缺血再灌注损伤、修复脑线粒体呼吸缺陷，对老年退行性疾病、视网膜退行性疾病等均具有一定治疗作用。目前由于合成工艺的限制，NMN的价格较为昂贵。
目前化学合成法制备NMN的技术较为成熟，如溴代乙酰核糖法、TMSOTF催化缩合法、AMP酸水解催化法、缩酮化保护合成法等，但存在制备条件苛刻、安全性低、生产成本高等缺陷。
NMN的生物合成包括酶促法和发酵法。酶促法路线一以磷酸核糖焦磷酸(PRPP)和烟酰胺(NAM)为底物在烟酰胺磷酸核糖转移酶(NAMPT)的催化作用下生成NMN；路线二以烟酰胺核苷(NR)为底物，ATP为磷酸供体，在烟酰胺核苷激酶(NRK)的催化作用下发生磷酸化反应生成NMN；路线三以D-5-磷酸核糖和烟酰胺为原料，在ATP存在的条件下，利用磷酸核糖焦磷酸合成酶(Prs)和NAMPT酶组合进行催化，合成NMN。
发酵法如Ss A,Ty A,Hm A,et al.(Metabolic design for selectiveproduction of nicotinamide mononucleotide from glucose and nicotinamide-ScienceDirect[J].Metabolic Engineering,2020.)通过对代谢路径中与NMN生成有关的酶基因改造得到生产NMN的大肠杆菌菌株。该菌株以葡萄糖和烟酰胺为底物，发酵制备NMN，其产量可达6.79g/L。该方法的产量相对较低，不利于大规模的工业化生产。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供一种菌株及其在生产β-烟酰胺单核苷酸中的应用。本发明提供一种新的生产β-烟酰胺单核苷酸(又称烟酰胺单核苷酸，nicotinamidemononucleotide，NMN)的菌株，使用菌株制备NMN具有产量高、方法简单的优点，比如本发明的NMIS208菌株制备NMN能够带来可达14.50g/L的高产率。
本发明第一方面提供一种大肠杆菌(Escherichia coli)的菌株，所述菌株的保藏编号为CCTCC M2022922。
本发明所述的大肠杆菌(Escherichia coli)的菌株即为NMIS208菌株。
本发明第二方面提供一种微生物菌体，其通过培养本发明第一方面所述的菌株获得。
所述培养使用的培养基可为适于大肠杆菌生长的本领域常规的培养基。
较佳地，培养使用的培养基为TB培养基或M9培养基。
所述TB培养基或所述M9培养基可为本领域常规培养基，较佳地，所述M9培养基配方(浓度g/L)为：十二水磷酸氢二钠17.9；磷酸二氢钾6.8；甘油5mL；胰化蛋白胨5；酵母提取物5；氯化铵2.7；无水硫酸钠0.71；无水硫酸镁0.24；四水氯化锰0.02；氯化铁0.016；氯化钙0.01。
较佳地，所述TB培养基配方(g/L)：胰化蛋白胨10；酵母提取物18；甘油4mL；磷酸氢二钾16.43；磷酸二氢钾2.31。
更佳地，培养所述NMIS208菌株时所述培养基中含有40μg/mL Km、40μg/mL Spec、20μg/mL Cm。
Km为卡那霉素，Spec为链霉素，Cm为氯霉素。
在某一较佳实施方案中，所述培养包括以下步骤：
a)使用培养基为TB培养基或M9培养基进行培养；培养条件为25-40℃，100-300rpm。
b)当a)中培养OD600达到0.6-1时，加入0.1mM的诱导剂进行诱导培养，其中所述诱导剂为IPTG，诱导培养条件为25-40℃，100-300rpm，12-24h。
优选地，所述培养基中还加入40μg/mL卡那霉素、40μg/mL链霉素、20μg/mL氯霉素。
在某一较佳实施方案中，所述微生物菌体通过以下方法获得：
取菌株的甘油菌按4％的接种量接种至5mL LB培养基(含50μg/mL Km、50μg/mLSpec、25μg/mL Cm)中，于37℃、250rpm条件下培养4h。按1％的接种量转接至TB培养基或M9培养基(含40μg/mL Km、40μg/mL Spec、20μg/mL Cm)中，于37℃250rpm条件下培养，当OD600达到0.8左右时，加入终浓度为0.1mM的IPTG，25℃、250rpm下诱导培养16h。
本发明第三方面提供一种生产NMN的方法，其使用本发明第二方面所述的微生物菌体与底物在反应体系中发生反应生产所述NMN，所述底物为葡萄糖和烟酰胺。
所述方法中，较佳地，所述的反应体系含有磷酸缓冲液和/或培养基。
所述培养基可为适于大肠杆菌生长的本领域常规的培养基。
较佳地，所述培养基为TB培养基或M9培养基。
较佳地，所述磷酸缓冲溶液为PBS缓冲液和/或MB缓冲液，所述MB缓冲溶液包括Na2HPO4、K2HPO4、NH4Cl和NaCl。
在某一较佳实施方案中，所述MB缓冲液包括Na2HPO4 6.8g/L、K2HPO43.0g/L、NH4Cl1.0g/L、NaCl 0.5g/L。
所述PBS缓冲液为本领域常规。
在某一较佳实施方案中，所述磷酸缓冲液为PBS缓冲液和MB缓冲液的混合缓冲液。
较佳地，所述混合缓冲液包含300mM PBS缓冲液和2*MB缓冲液。
在某一较佳实施方案中，将所述微生物菌体制备为菌体悬浮液后与所述底物混合得到所述反应体系。
所述菌体悬浮液的制备包括以下任一项：
i：将所述微生物菌体加入磷酸缓冲液中进行悬浮即得到所述菌体悬浮液；优选地，所述微生物菌体与所述磷酸缓冲液的质量体积比为1:(5～20)例如1:10；
ii：将所述微生物菌体与培养其的培养基上清混合后得到所述菌体悬浮液；优选地，所述微生物菌体与所述培养基上清的质量体积比为1:(5～20)例如1:10。
较佳地，当使i的方法制备所述菌体悬浮液时，所述底物溶于所述PBS磷酸缓冲液中并与所述菌体悬浮液混合；当使ii的方法制备所述菌体悬浮液时，所述底物溶于所述混合缓冲液中并与所述菌体悬浮液混合。
所述方法中，较佳地，所述反应体系中：
所述烟酰胺占所述反应体系的浓度为5～10g/L，例如8g/L。
所述烟酰胺与所述葡萄糖的质量比为1：(1.5～5)，例如1:2.625。
所述微生物菌体占所述反应体系的质量体积比为1：(10～30)，例如1:20。
所述质量体积比指的是g/mL。
所述微生物菌体与所述烟酰胺的质量比为1:(0.1～0.3)，例如1:0.16。
在某一较佳实施方案中，所述微生物菌体是经离心第一方面所述菌株培养后的菌液后获得的湿菌体。具体可通过以下方法获得：获取微生物菌体的菌液于4℃、4000rpm下离心15min，分别收集上清液和湿菌体，并置于4℃冷藏，待用。
在某一较佳实施方案中，所述反应通过搅拌或震荡的方式进行。
优选地，所述反应的条件为25-35℃、200-300rpm和6-24h，更优选30℃、220rpm和8～24h。
在某一较佳实施方案中，当所述反应的时间达到4-6h时，补充所述底物，使所述葡萄糖占所述反应体系的浓度为7～15g/L例如10.5g/L，且所述烟酰胺占所述反应体系的浓度为3～5g/L例如4g/L。
本发明第四方面提供一种本发明第一方面所述的大肠杆菌(Escherichia coli)菌株或本发明第二方面所述的微生物菌体在制备NMN中的应用。
本发明所述的NMN指的是β-烟酰胺单核苷酸(又称烟酰胺单核苷酸，nicotinamidemononucleotide，NMN)。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：本发明提供一种新的生产NMN的菌株，使用菌株制备NMN具有产量高、方法简单的优点，比如本发明的NMIS208菌株制备NMN能够带来可达14.50g/L的高产率。
生物材料保藏信息
本发明的大肠杆菌(Escherichia coli)NMIS208菌株，于2022年6月20日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址：中国湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学，邮编：430072，保藏编号为CCTCC M2022922，培养物名称为大肠杆菌(Escherichia coli)NMIS208菌株。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例中，所用M9培养基配方(浓度g/L)为：十二水磷酸氢二钠17.9；磷酸二氢钾6.8；甘油5mL；胰化蛋白胨5；酵母提取物5；氯化铵2.7；无水硫酸钠0.71；无水硫酸镁0.24；四水氯化锰0.02；氯化铁0.016；氯化钙0.01。
TB培养基配方(g/L)：胰化蛋白胨10；酵母提取物18；甘油4mL；磷酸氢二钾16.43；磷酸二氢钾2.31。
MB缓冲液(g/L)：Na2HPO4 6.8、K2HPO4 3.0、NH4Cl 1.0、NaCl 0.5。
实施例中实验结果的检测采用高效液相色谱(HPLC)，色谱柱：Welch UltimateAQ-C18(5μm，250×4.6mm)，流速：1mL/min；柱温：35℃，检测波长：260nm进样体积：5μL。
流动相：A：10mM乙酸铵+0.1％甲酸，B：乙腈。
梯度洗脱程序见下表1：
表1
实施例1 NMIS208菌株的培养
取NMIS208甘油菌按4％的接种量接种至5mL LB培养基(含50μg/mL Km、50μg/mLSpec、25μg/mL Cm)中，于37℃、250rpm条件下培养4h。按1％的接种量转接至TB或M9培养基(含40μg/mL Km、40μg/mL Spec、20μg/mL Cm)中，于37℃、250rpm条件下培养，当OD600达到0.8左右时，加入终浓度为0.1mM的IPTG，25℃、250rpm下诱导培养16h。
将上述菌液于4℃、4000rpm下离心15min，分别收集上清液和湿菌体，并置于4℃冷藏，待用。
实施例2发酵TB-催化法制备NMN
(1)配制反应底物溶液：向300mM PBS缓冲液中加入葡萄糖和烟酰胺得到反应底物溶液，其中葡萄糖浓度为42g/L，烟酰胺浓度为16g/L。
(2)菌体悬浮液的制备：
将10*MB缓冲溶液稀释5倍得到2*MB缓冲液，取实施例1所述NMIS208湿菌体按1:10(g/mL)的比例加入到2*MB缓冲液中进行悬浮，得到菌体悬浮液。
(3)转化反应及结果检测：将配制好的反应底物溶液与菌体悬浮液按照1:1的体积比混合得到20mL反应体系，于30℃、220rpm条件下反应。4h后取样检测，HPLC检测结果如表2所示。
检测方法为：取1mL反应液，12000rpm离心10min后，取100μL上清液加入880μL去离子水和20μL 20％盐酸溶液，混合后于12000rpm离心10min，得到的上清液经过滤后，进行HPLC测定。
(4)补料：反应转化6h后，向反应液中补加葡萄糖和烟酰胺，至其浓度分别为10.5g/L和4g/L。24h后再次取样检测，检测方法同上，检测结果如表2所示。
表2发酵TB-催化法制备NMN实验结果
由结果可知，在本实施例的条件下，当反应转化24h，NMN的产量可达12.96g/L。
实施例3双阶段发酵法制备NMN
(1)配制反应底物溶液：将1.5M PBS缓冲液和10*MB缓冲液混合并稀释，得到300mMPBS+2*MB的混合缓冲液，加入葡萄糖和烟酰胺配置成反应底物溶液，其中，葡萄糖浓度为42g/L，烟酰胺浓度为16g/L。
(2)菌体悬浮液的制备：将实施例1所述的NMIS208湿菌体和培养基M9上清液按质量体积比1:10(g/mL)进行混合，得到菌体悬浮液。
(3)转化反应及结果检测：将配制好的反应底物溶液与菌体悬浮液按照1:1的体积比混合得到20mL反应体系，于30℃、220rpm条件下反应。反应4h后取样检测，检测方法同实施例2所述，HPLC检测结果如表3所示。
(4)补料：反应转化6h后，向反应液中补加葡萄糖和烟酰胺，至其浓度分别为10.5g/L和4g/L。24h后再次取样检测，检测方法同上，HPLC检测结果如表3所示。
表3双阶段发酵法制备NMN实验结果
由结果可知，当使用原培养液重悬菌体，反应转化24h时，NMN的产量可达14.50g/L。
Claims (10)
1.一种大肠杆菌(Escherichia coli)的菌株，其特征在于，所述菌株的保藏编号为CCTCC M2022922。
2.一种微生物菌体，其特征在于，其通过培养如权利要求1所述的菌株获得。
3.如权利要求2所述的微生物菌体，其特征在于，所述培养包括以下步骤：
a)使用培养基为TB培养基或M9培养基进行培养；培养条件为25-40℃，100-300rpm；优选地，所述培养基中还加入40μg/mL卡那霉素、40μg/mL链霉素、20μg/mL氯霉素；
b)当a)中培养OD600达到0.6-1时，加入0.1mM的诱导剂进行诱导培养，其中所述诱导剂为IPTG，诱导培养条件为25-40℃，100-300rpm，12-24h。
4.一种生产NMN的方法，其特征在于，使用如权利要求2或3所述的微生物菌体与底物在反应体系中发生反应生产所述NMN，所述底物为葡萄糖和烟酰胺。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的反应体系含有磷酸缓冲液和/或培养基；较佳地，所述培养基为TB培养基或M9培养基，所述磷酸缓冲溶液为PBS缓冲液和/或MB缓冲液，所述MB缓冲溶液包括Na2HPO4、K2HPO4、NH4Cl和NaCl，例如Na2HPO4 6.8g/L、K2HPO43.0g/L、NH4Cl 1.0g/L、NaCl 0.5g/L。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述磷酸缓冲液为PBS缓冲液和MB缓冲液的混合缓冲液；较佳地，所述混合缓冲液包含300mM PBS缓冲液和2*MB缓冲液。
7.如权利要求4-6任一项所述的方法，其特征在于，所述反应体系中：
所述烟酰胺占所述反应体系的浓度为5～10g/L，例如8g/L；和/或，
所述烟酰胺与所述葡萄糖的质量比为1：(1.5～5)，例如1:2.625；和/或，
所述微生物菌体占所述反应体系的质量体积比为1：(10～30)，例如1:20；和/或，
所述微生物菌体与所述烟酰胺的质量比为1:(0.1～0.3)，例如1:0.16。
8.如权利要求4-7任一项所述的方法，其特征在于，所述反应通过搅拌或震荡的方式进行；较佳地，所述反应的条件为25-35℃、200-300rpm和6-24h，优选30℃、220rpm和8～24h。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，当所述反应的时间达到4-6h时，例如6h时，补充所述底物，使所述葡萄糖占所述反应体系的浓度为7～15g/L例如10.5g/L，且所述烟酰胺占所述反应体系的浓度为3～5g/L例如4g/L。
10.如权利要求1所述的大肠杆菌(Escherichia coli)的菌株或如权利要求2或3所述的微生物菌体在制备NMN中的应用。
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