CN112608910A

CN112608910A - 烟酰胺核糖激酶及其应用

Info

Publication number: CN112608910A
Application number: CN202011473646.3A
Authority: CN
Inventors: 肖春英
Original assignee: Shenzhen Xijiya Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shenzhen Xijiya Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-12-15
Filing date: 2020-12-15
Publication date: 2021-04-06

Abstract

本申请公开了烟酰胺核糖激酶及其应用。该烟酰胺核糖激酶包括：(a)如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；或(b)由(a)所示的氨基酸序列经过取代、缺失或添加至少一个氨基酸，但烟酰胺核糖激酶活性不变的氨基酸序列。根据本申请实施例的烟酰胺核糖激酶，至少具有如下有益效果：与现有烟酰胺核糖激酶相比，本申请实施例所提供的烟酰胺核糖激酶具有更好的热稳定性。这种高热稳定性使得酶在纯化时可以通过简单的加热处理后就可以使用而无需进行复杂且昂贵的柱纯化。因此，可以大幅降低生产成本，适用于大规模工业化生产。

Description

烟酰胺核糖激酶及其应用

技术领域

本申请涉及酶工程技术领域，尤其是涉及烟酰胺核糖激酶及其应用。

背景技术

烟酰胺单核苷酸(Nicotinamide mononucleotide，NMN)是烟酰胺核糖激酶与烟酰胺核糖等反应的产物，同时是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide adeninedinucleotide，NAD+)的关键前体之一。NMN在人体内通过转化为NAD+来发挥其生理功能，如激活NAD+底物依赖性酶Sirt1(组蛋白脱乙酰酶，又称沉默调节蛋白)、调节细胞存活和死亡、维持氧化还原状态等。由于NAD+分子量过大，无法通过口服摄取至细胞内，主要依赖于体内细胞的合成，而且合成量很低。但随着对NAD+前体小分子物NMN的研究发现，食用NMN可以有效提升体内NAD+的含量，对心脑血管疾病、神经退行性病及老化退行性疾病等有较好的治疗和修复作用；另外，NMN还可通过参与和调节机体的内分泌，起到保护和修复胰岛功能，增加胰岛素的分泌，防治糖尿病和肥胖等代谢性疾病的作用。

随着对NMN的药用和保健作用研究的增加，对NMN的市场需求日益增长。目前NMN在欧、美、日等发达国家已批准作为保健食品原料，并以NMN为主要成份开发出多种保健品，如美国HERBALmax、基因港GeneHarbor NMN9000、日本MIRAI LAB NMN3000胶囊、澳大利亚synext等。NMN的体外制备方法目前以化学合成为主，比如，2002年，Tanimori等人用乙酰基保护的核糖与烟酰胺在三甲硅基三氟甲磺酸脂(TMSOTf)的催化下发生缩合反应；又比如2004年Palmarisa等人使用硅烷化试剂对烟酰胺进行硅烷化，然后与乙酰核糖在TMSOTf的催化下进行反应。这些化学合成方法存在杂质过多，分离纯化极其困难，成本高、收率低而且化学试剂污染严重等问题。

因此，生物转化制备NMN已经成为各大医药公司竞争的研究热点。以烟酰胺核糖激酶(NRK)催化转化包含烟酰胺核糖和ATP的底物为NMN是一种绿色环保的生物催化方法。然而，现有报道的烟酰胺核糖激酶的热稳定性普遍较差，例如酵母来源的烟酰胺核糖激酶最适反应温度只有30℃，人源粗烟酰胺核糖激酶的最适反应温度也只有37℃。热稳定性较差也进一步导致这些酶在反应前只有通过柱纯化的方式才能除去杂酶减少副反应，成本过高，无法满足工业化生产的要求。

发明内容

本申请旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本申请提出一种热稳定性较高的烟酰胺核糖激酶及其应用。

本申请的第一方面，提供烟酰胺核糖激酶，该烟酰胺核糖激酶包括：

(a)如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；或

(b)由(a)所示的氨基酸序列经过取代、缺失或添加至少一个氨基酸，但烟酰胺核糖激酶活性不变的氨基酸序列。

根据本申请实施例的烟酰胺核糖激酶，至少具有如下有益效果：

与现有烟酰胺核糖激酶相比，本申请实施例所提供的烟酰胺核糖激酶具有更好的热稳定性。这种高热稳定性使得酶在纯化时可以通过简单的加热处理后就可以使用而无需进行复杂且昂贵的柱纯化。因此，可以大幅降低生产成本，适用于大规模工业化生产。

本申请的第二方面，提供分离的多核苷酸，该多核苷酸包括：

(A1)编码上述烟酰胺核糖激酶的核苷酸序列；或

(A2)与(A1)的核苷酸序列互补的核苷酸序列。

根据本申请的一些实施例，多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

本申请的第三方面，提供重组载体，该重组载体包括上述的多核苷酸。

根据本申请的一些实施例，所述重组载体为pET、pCW、pUC、pPIC9k中的任一种。

本申请的第四方面，提供宿主细胞，该宿主细胞包括上述重组载体，或上述多核苷酸。

根据本申请的一些实施例，该宿主细胞选自大肠杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母、链霉菌、枯草芽孢杆菌等本领域熟知的能够用于表达目的的蛋白的真核或原核细胞。

本申请的第五方面，提供烟酰胺核糖激酶的生产方法，该生产方法包括以下步骤：培养上述的宿主细胞，获得培养物，从培养物中分离出烟酰胺核糖激酶。

根据本申请的一些实施例，在分离出烟酰胺核糖激酶的粗酶液后，可以按照下述纯化方法对其进行进一步的纯化以获得更高纯度的烟酰胺核糖激酶。

本申请的第六方面，提供烟酰胺核糖激酶的纯化方法，该纯化方法包括以下步骤：对粗酶液进行热处理，所述粗酶液包括上述烟酰胺核糖激酶。

根据本申请的一些实施例，热处理的温度可以是30～80℃，处理时间在50min以下。

根据本申请的一些实施例，热处理温度在35～75℃、40～70℃、45～65℃、50～60℃。

根据本申请的一些实施例，热处理时间在2～45min、2～40min、2～35min、2～30min、2～25min、2～20min、5～20min、2～15min、5～15min、2～10min、5～10min中的任一种。

本申请的第七方面，提供烟酰胺单核苷酸的生产方法，该生产方法包括以下步骤：

将底物与上述的烟酰胺核糖激酶、或上述的宿主细胞、或上述宿主细胞的培养物接触，底物包括烟酰胺核糖和ATP。

根据本申请的一些实施例，烟酰胺核糖激酶为酶溶液或酶冻干粉。

根据本申请的一些实施例，该生产方法包括以下步骤：

(1)将底物与上述烟酰胺核糖激酶混合，在40～80℃、pH为5.0～6.0的条件下反应；

(2)获得含烟酰胺单核苷酸的粗酶液，经分离纯化得到烟酰胺单核苷酸。

本申请的第八方面，提供上述烟酰胺核糖激酶，或上述多核苷酸，或上述重组载体，或上述宿主细胞在制备烟酰胺单核苷酸中的应用。

本申请的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本申请的实践了解到。

附图说明

图1是本申请的一个实施例的催化反应终产物的核磁共振氢谱结果。

具体实施方式

以下将结合实施例对本申请的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本申请的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本申请的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本申请的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本申请保护的范围。

下面详细描述本申请的实施例，描述的实施例是示例性的，仅用于解释本申请，而不能理解为对本申请的限制。

在本申请的描述中，若干的含义是一个以上，多个的含义是两个以上，大于、小于、超过等理解为不包括本数，以上、以下、以内等理解为包括本数。如果有描述到第一、第二只是用于区分技术特征为目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量或者隐含指明所指示的技术特征的先后关系。

本申请的描述中，除非另有明确的限定，设置、安装、连接等词语应做广义理解，所属技术领域技术人员可以结合技术方案的具体内容合理确定上述词语在本申请中的具体含义。

本申请的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示意性实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本申请的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

实施例1

本实施例提供一种烟酰胺核糖激酶，其制备方法如下：

1.重组质粒和重组菌的制备

本实施例所采用的烟酰胺核糖激酶来自于Thermothielavioides terrestrisNRRL 8126，其氨基酸序列如下所示：

MAQPRTVVIGISGCSSSGKTTLARLLRDIFPETFILHEDDFYKPESELPHKDGFLDWDCLEAISIPDLEAALRHIRETGSVPPTLFSIQDLNTVGPCPATPSQIADCAARGFLLYAPRPHPLAEHVTALLDIKLFLRASRDAALRRRAARDGYVTLEGFWKDPPGYVERVVWPNYVDAHRWLFEGGVVEGGRVDAAVLAREGIRVVDRRVRRSGEGEGEGEGEVVAMEQEEDVEFGRVLEWAVRVVMEELERICLPRNEGK(SEQ ID No.1)。

编码该烟酰胺核糖激酶的核苷酸序列如下所示：

ATGGCTCAACCCAGGACAGTTGTAATAGGAATCTCTGGGTGCTCCTCTTCCGGCAAGACCACCTTGGCGCGTCTGTTACGGGACATCTTTCCGGAAACGTTTATCCTGCATGAAGACGACTTTTATAAGCCGGAAAGCGAACTGCCGCACAAAGACGGTTTCCTGGATTGGGATTGCCTGGAGGCGATTTCGATCCCGGATTTGGAGGCGGCGCTGCGTCATATTCGTGAAACTGGTAGCGTTCCGCCAACGCTCTTCAGCATTCAAGATCTGAACACCGTTGGTCCGTGTCCGGCAACCCCGAGCCAGATTGCGGATTGTGCTGCCAGAGGTTTCTTGTTGTACGCACCGCGTCCGCACCCGCTGGCTGAACACGTGACCGCACTGTTGGACATCAAACTGTTCTTGCGCGCTAGCCGTGACGCGGCGCTGCGCCGTCGTGCGGCCCGCGACGGCTACGTTACCTTGGAGGGCTTCTGGAAAGATCCGCCTGGTTACGTCGAGCGCGTGGTTTGGCCCAACTATGTGGACGCGCATCGTTGGCTGTTTGAAGGCGGTGTTGTAGAAGGCGGTCGTGTGGACGCCGCTGTGCTGGCGCGTGAAGGCATCCGCGTCGTGGATCGTCGCGTGCGTAGGAGCGGTGAGGGTGAGGGTGAGGGCGAGGGCGAGGTTGTCGCAATGGAACAGGAGGAAGATGTTGAGTTTGGTCGCGTGCTGGAGTGGGCAGTTCGTGTGGTTATGGAAGAGCTTGAGCGTATTTGCCTGCCGCGTAATGAAGGCAAG(SEQ ID No.2)。

将编码上述烟酰胺核糖激酶的核苷酸序列针对大肠杆菌做密码子优化，由南京金斯瑞公司合成并重组到表达载体pET-22b(酶切位点BamH I、Hind III)上。重组质粒转化至宿主细胞E.coli BL21内，筛选出阳性克隆，提取质粒酶切验证及测序验证显示序列正确，获得重组菌E.coli BL21-pET-22b-NRK。

2.烟酰胺核糖激酶的生产

将上述含有烟酰胺核糖激酶基因的重组菌接种到含有氨苄青霉素的5mL LB液体培养基(LB(g/L)：蛋白胨10，氯化钠10，酵母提取物5)的50mL的摇管中，在摇床上以200rpm、37℃恒温培养8h。再将培养物按2％接种量接入含有100mL诱导培养基TB(TB(g/L)：酵母粉25，胰蛋白胨15，氯化钠10，葡萄糖2，乳糖3)的500mL摇瓶中，以200rpm、37℃培养2h，待OD₆₀₀达到0.2左右时转16℃诱导24h，离心收集菌体。超声破菌，离心取上清液为粗酶液，置于4℃冰箱，备用。

实施例2

酶最适反应温度检测

配制含60mM烟酰胺核糖、60Mm ATP、30mM MgCl₂的反应液作为底物，调节pH至5.0。取4份900μL的底物，分别加入100μL相同浓度的实施例1中的粗酶液，分别在50℃、60℃、70℃、80℃反应10min，以获得NMN。然后加入100μL 25％三氯乙酸终止反应，通过HPLC测定反应溶液中的NMN含量，并计算不同温度条件下烟酰胺核糖激酶的具体活性。以70℃的酶活作为相对酶活100％，比较不同反应温度下的相对酶活，结果如表1所示。

表1.不同温度条件下烟酰胺核糖激酶的相对酶活

实施例3

酶热稳定性检测

取实施例1中的粗酶液500μL，加入MgCl₂至终浓度为20mmol/L，静置于65℃水浴中，0min、15min、30min、45min、60min分别取出100μL作为反应酶液，放置于4℃冰箱备用。配制含60mM烟酰胺核糖、60mM ATP、30mM MgCl₂的反应液作为底物，调节pH至5.0。取5份900μL的底物，分别加入100μL上述不同热处理时间的反应酶液，在70℃反应10min，以获得HMN。然后加入100μL25％三氯乙酸终止反应，通过HPLC测定反应溶液中的NMN含量，并计算不同热处理时间条件下烟酰胺核糖激酶的具体活性，以热处理0min的酶活作为相对酶活100％，比较不同热处理时间的相对酶活，结果如表2所示。

表2.不同热处理时间条件下烟酰胺核糖激酶的相对酶活

实施例4

本实施例提供一种烟酰胺核糖激酶的纯化方法，该纯化方法包括以下步骤：

取实施例1中制备得到的含有烟酰胺核糖激酶的粗酶液，65℃热处理15min后，离心，取上清，得到纯化后的烟酰胺核糖激酶的酶液。

实施例5

本实施例提供一种烟酰胺单核苷酸的生产方法，该生产方法包括以下步骤：

(1)向反应器中加入含有含60mM烟酰胺核糖、60mM ATP、30mM MgCl2的反应液作为底物，调节pH至5.0。加入实施例4中纯化后的烟酰胺核糖激酶的酶液(与底物的体积比为1：10)，搅拌均匀后，在恒温水浴摇床中以50rpm、40℃恒温、pH5.0～6.0反应4小时，得到含粗品烟酰胺单核苷酸的溶液，经过滤、纯化、干燥，得到终产物。终产物的核磁共振氢谱(H-NMR)结果见图1、解析结果见表3，核磁共振碳谱(13C-NMR)结果见表4，质谱结果显示m/z＝335.02，与烟酰胺单核苷酸相对分子质量M的[M+H]⁺相符。

表3.核磁共振氢谱结果

表4.核磁共振碳谱结果

质谱结果表明，终产物的分子量与目标结构烟酰胺单核苷酸(C₁₁H₁₅N₂O₈P)的理论值一致。氢谱、碳谱验证原子归属符合烟酰胺单核苷酸结构式的特点。因此，终产物为烟酰胺单核苷酸。即，该烟酰胺核糖激酶具有催化烟酰胺核糖和ATP生成烟酰胺单核苷酸的相应催化活性。

另外，经计算，本实施例中烟酰胺单核苷酸的转化率达93％。

上面结合实施例对本申请作了详细说明，但是本申请不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本申请宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳希吉亚生物技术有限公司

<120> 烟酰胺核糖激酶及其应用

<130> 1

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 261

<212> PRT

<213> Thermothielavioides terrestris NRRL 8126

<400> 1

Met Ala Gln Pro Arg Thr Val Val Ile Gly Ile Ser Gly Cys Ser Ser

1 5 10 15

Ser Gly Lys Thr Thr Leu Ala Arg Leu Leu Arg Asp Ile Phe Pro Glu

20 25 30

Thr Phe Ile Leu His Glu Asp Asp Phe Tyr Lys Pro Glu Ser Glu Leu

35 40 45

Pro His Lys Asp Gly Phe Leu Asp Trp Asp Cys Leu Glu Ala Ile Ser

50 55 60

Ile Pro Asp Leu Glu Ala Ala Leu Arg His Ile Arg Glu Thr Gly Ser

65 70 75 80

Val Pro Pro Thr Leu Phe Ser Ile Gln Asp Leu Asn Thr Val Gly Pro

85 90 95

Cys Pro Ala Thr Pro Ser Gln Ile Ala Asp Cys Ala Ala Arg Gly Phe

100 105 110

Leu Leu Tyr Ala Pro Arg Pro His Pro Leu Ala Glu His Val Thr Ala

115 120 125

Leu Leu Asp Ile Lys Leu Phe Leu Arg Ala Ser Arg Asp Ala Ala Leu

130 135 140

Arg Arg Arg Ala Ala Arg Asp Gly Tyr Val Thr Leu Glu Gly Phe Trp

145 150 155 160

Lys Asp Pro Pro Gly Tyr Val Glu Arg Val Val Trp Pro Asn Tyr Val

165 170 175

Asp Ala His Arg Trp Leu Phe Glu Gly Gly Val Val Glu Gly Gly Arg

180 185 190

Val Asp Ala Ala Val Leu Ala Arg Glu Gly Ile Arg Val Val Asp Arg

195 200 205

Arg Val Arg Arg Ser Gly Glu Gly Glu Gly Glu Gly Glu Gly Glu Val

210 215 220

Val Ala Met Glu Gln Glu Glu Asp Val Glu Phe Gly Arg Val Leu Glu

225 230 235 240

Trp Ala Val Arg Val Val Met Glu Glu Leu Glu Arg Ile Cys Leu Pro

245 250 255

Arg Asn Glu Gly Lys

260

<210> 2

<211> 783

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atggctcaac ccaggacagt tgtaatagga atctctgggt gctcctcttc cggcaagacc 60

accttggcgc gtctgttacg ggacatcttt ccggaaacgt ttatcctgca tgaagacgac 120

ttttataagc cggaaagcga actgccgcac aaagacggtt tcctggattg ggattgcctg 180

gaggcgattt cgatcccgga tttggaggcg gcgctgcgtc atattcgtga aactggtagc 240

gttccgccaa cgctcttcag cattcaagat ctgaacaccg ttggtccgtg tccggcaacc 300

ccgagccaga ttgcggattg tgctgccaga ggtttcttgt tgtacgcacc gcgtccgcac 360

ccgctggctg aacacgtgac cgcactgttg gacatcaaac tgttcttgcg cgctagccgt 420

gacgcggcgc tgcgccgtcg tgcggcccgc gacggctacg ttaccttgga gggcttctgg 480

aaagatccgc ctggttacgt cgagcgcgtg gtttggccca actatgtgga cgcgcatcgt 540

tggctgtttg aaggcggtgt tgtagaaggc ggtcgtgtgg acgccgctgt gctggcgcgt 600

gaaggcatcc gcgtcgtgga tcgtcgcgtg cgtaggagcg gtgagggtga gggtgagggc 660

gagggcgagg ttgtcgcaat ggaacaggag gaagatgttg agtttggtcg cgtgctggag 720

tgggcagttc gtgtggttat ggaagagctt gagcgtattt gcctgccgcg taatgaaggc 780

aag 783

Claims

1.烟酰胺核糖激酶，其特征在于，包括：

(a)如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；或

(b)由(a)所示的所述氨基酸序列经过取代、缺失或添加至少一个氨基酸，但烟酰胺核糖激酶活性不变的氨基酸序列。

2.分离的多核苷酸，其特征在于，包括：

(A1)编码权利要求1所述的烟酰胺核糖激酶的核苷酸序列；或

(A2)与(A1)所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列。

3.根据权利要求2所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸的核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示。

4.重组载体，其特征在于，包括权利要求2至3任一项所述的多核苷酸。

5.宿主细胞，其特征在于，包括权利要求4所述重组载体，或包括权利要求2至3任一项所述的多核苷酸。

6.烟酰胺核糖激酶的生产方法，其特征在于，包括以下步骤：培养权利要求5所述的宿主细胞，获得培养物，从所述培养物中分离出所述烟酰胺核糖激酶。

7.烟酰胺核糖激酶的纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：对粗酶液进行热处理，所述粗酶液包括权利要求1所述的烟酰胺核糖激酶。

8.烟酰胺单核苷酸的生产方法，其特征在于，包括以下步骤：

将底物与权利要求1所述的烟酰胺核糖激酶、或权利要求5所述的宿主细胞、或权利要求5所述的宿主细胞的培养物接触，所述底物包括烟酰胺核糖和ATP。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将所述底物与权利要求1所述的烟酰胺核糖激酶混合，在40～80℃、pH为5.0～6.0的条件下反应；

(2)获得含所述烟酰胺单核苷酸的粗酶液，经分离纯化得到所述烟酰胺单核苷酸。

10.权利要求1所述的烟酰胺核糖激酶，或权利要求2至3任一项所述的多核苷酸，或权利要求4所述的重组载体，或权利要求5所述的宿主细胞在制备烟酰胺单核苷酸中的应用。