CN115975989A - 一种制备玉米抗性淀粉的iii型普鲁兰水解酶突变体及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种制备玉米抗性淀粉的III型普鲁兰水解酶突变体及其制备方法和应用，涉及生物酶工程和基因工程领域。所述III型普鲁兰水解酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明对III型普鲁兰水解酶TK‑PUL中邻近催化活性中心的第500位异亮氨酸以及第538位亮氨酸进行饱和突变，构建得到了氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示的III型普鲁兰水解酶突变体。本发明提供的突变型III型普鲁兰水解酶突变体对普通玉米淀粉的比活力由突变前的48.08U/mg提高到133.66U/mg，利用该III型普鲁兰水解酶突变体制备玉米抗性淀粉的制备得率由突变前的30.87％提高到59.15％。

Description

一种制备玉米抗性淀粉的III型普鲁兰水解酶突变体及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物酶工程和基因工程领域，特别是涉及一种制备玉米抗性淀粉的III型普鲁兰水解酶突变体及其制备方法和应用。

背景技术

抗性淀粉(Resistant starch，RS)作为一种新型膳食纤维，不能被人体胃和小肠消化吸收，但可进入结肠中被肠道菌群发酵利用，进而发挥其降血糖、降血脂、预防心血管疾病和结肠癌等多种生理功效。根据来源、结构、消化特性和应用的不同，RS可分为5类：RS1型抗性淀粉(物理包埋淀粉)、RS2型抗性淀粉(抗性淀粉颗粒)、RS3型抗性淀粉(老化回生淀粉)、RS4型抗性淀粉(化学改性淀粉)、RS5型抗性淀粉(淀粉-脂质复合物)。RS3型抗性淀粉是膳食中抗性淀粉的主要组成部分，对人体具有重要的生理功能。作为一种新型的功能性食品原料，RS3型抗性淀粉制备方法的研究成为近年来碳水化合物科学的热点课题。

近年来，研究者针对不同淀粉原料，采取不同制备方法，以获得高含量RS3型抗性淀粉产品。不同处理方法、条件参数等对RS3型抗性淀粉制备时的得率有不同程度的影响。在RS3型抗性淀粉的制备过程中，影响抗性淀粉产率的一个重要因素是淀粉中直链淀粉含量。由于淀粉中的直链淀粉分子比支链淀粉分子更易老化，分子之间很容易产生有序的排列形成抗性淀粉；二者的比率越大，抗性淀粉含量越高。从这一角度考虑，高直链玉米淀粉在制备RS3型抗性淀粉时具有明显的原料优势。由于国内还没有高直链玉米淀粉的大规模种植生产，售价较高，并且在以高直链玉米淀粉制备RS3型抗性淀粉的过程中需要通过反复高温处理后得到，这种原料和加工条件均增加了产品的成本，因此亟需开发一种以普通玉米淀粉(低直链玉米淀粉)为原料制备高含量RS3型抗性淀粉的方法。

RS3型抗性淀粉的制备通常是采用热处理法和脱支法，或者二者相结合的方法。淀粉在受热糊化过程中，淀粉颗粒吸水膨胀破裂释放出直链淀粉，随后降温凝沉，长链聚合物间通过双螺旋叠加形成抗性淀粉。在RS3型抗性淀粉的制备过程中，现有的脱支法有两种，即酸法脱支和酶法脱支。酸法脱支是用酸处理淀粉，但其脱支效果和安全性不及酶法脱支效果好，并且酸对设备的高腐蚀性是实际生产必需考虑的技术问题；酶法脱支制备抗性淀粉可使制备过程中化学试剂的使用量大大降低，提高抗性淀粉的品质，减少对环境的污染，但是存在着酶解时间长、抗性淀粉制备得率不高的弊端。目前已报道的以普通玉米淀粉为原料，利用热处理法和酶法脱支相结合的方法制备玉米抗性淀粉的最高得率为58.87％。Zhang等以10％普通玉米淀粉乳为原料，将玉米淀粉乳于80℃下处理20min后，在温度90℃、pH值5.5的条件下添加4.0U/gα-淀粉酶，水解15min后，再用普鲁兰酶连续处理(添加酶量为12.8U/g、反应时间为32h、反应温度为46.2℃，pH值为5.0)，制备得到抗性淀粉含量为58.87％的RS3型抗性淀粉产品。即在玉米淀粉糊化时加入嗜热α-淀粉酶处理，α-淀粉酶作用于淀粉中α-1,4-糖苷键，改变淀粉的链长与结构；再加入普鲁兰酶，其作用于α-1,6-糖苷键从而使淀粉水解产物中含有更多的游离直链淀粉分子；该反应体系在低温下凝沉，不同的直链淀粉分子间通过氢键形成双螺旋，最后获得RS3型抗性淀粉。嗜热酸性III型普鲁兰水解酶TK-PUL可同时水解淀粉中α-1,4-糖苷键和α-1,6-糖苷键。将TK-PUL应用于RS3型抗性淀粉的制备，可同时发挥嗜热α-淀粉酶和普鲁兰酶的功能，通过对反应条件的选择和控制，简化RS3型抗性淀粉的制备流程、缩短酶解时间、提高制备效率。因此开发酶解效率高、抗性淀粉制备得率高的III型普鲁兰水解酶TK-PUL突变体对于抗性淀粉制备工艺的提升具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种制备玉米抗性淀粉的III型普鲁兰水解酶突变体及其制备方法和应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明制备得到的III型普鲁兰水解酶突变体，酶活力高，利用该突变体制备玉米抗性淀粉，可以有效提高制备得率。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种制备玉米抗性淀粉的III型普鲁兰水解酶突变体，所述III型普鲁兰水解酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供一种编码上述的III型普鲁兰水解酶突变体的编码基因。

进一步地，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供一种重组载体，包括上述的编码基因。

本发明还提供一种重组微生物菌株，包括上述的重组载体。

本发明还提供上述的编码基因、重组载体或重组微生物菌株在制备III型普鲁兰水解酶突变体中的应用。

本发明还提供上述的III型普鲁兰水解酶突变体在制备玉米抗性淀粉中的应用。

本发明公开了以下技术效果：

为了获得高效制备玉米抗性淀粉的III型普鲁兰水解酶突变体，本发明对III型普鲁兰水解酶TK-PUL中邻近催化活性中心的第500位异亮氨酸(I)以及第538位亮氨酸(L)进行饱和突变(将TK-PUL中第500位异亮氨酸突变为谷氨酸，将第538位亮氨酸突变为天冬氨酸)，构建相应的饱和突变体文库。通过初步比较重组酶以普通玉米淀粉为底物的比活力，并进一步比较重组酶以普通玉米淀粉为原料的玉米抗性淀粉制备得率，筛选出玉米抗性淀粉制备得率显著提高的III型普鲁兰水解酶突变体TP-I500E/L538D。

本发明提供的III型普鲁兰水解酶突变体TP-I500E/L538D对普通玉米淀粉的比活力由对照(突变前)的48.08U/mg提高到133.66U/mg，提高了1.78倍。利用III型普鲁兰水解酶TK-PUL和突变体TP-I500E/L538D制备玉米抗性淀粉的工艺条件如下：普通玉米淀粉乳浓度为15％、III型普鲁兰水解酶加酶量为15U/g玉米淀粉、反应时间为12h、反应温度为80℃、pH值为5.0。在此制备条件下，III型普鲁兰水解酶突变体TP-I500E/L538D的玉米抗性淀粉制备得率由对照(突变前)的30.87％提高到59.15％，提高了0.92倍。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为III型普鲁兰水解酶TK-PUL及突变体TP-I500E/L538D、TP-I500Q/L538K、TP-I500E/L538H的SDS-PAGE检测图。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

以下实施例中使用的实验材料如下：

1、菌株与载体

大肠杆菌(Escherichia coli)JM109(购自北京华越洋生物)，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WB600(购自北纳生物)，枯草芽孢杆菌表达载体pSTOP1622(购自MoBiTec公司)。

2、酶类及其他生化试剂

基因定点突变试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司，KOD-Plus-neo DNA聚合酶购自Toyobo公司，DNA限制性内切酶、T4 DNA连接酶购自Fermentase公司，DNA胶回收试剂盒、质粒抽提试剂盒E.Z.N.A.购自Omega Bio-tek公司，Chelating SepharoseTM FastFlow购自美国GE Healthcare公司，普通玉米淀粉、玉米直链淀粉、玉米支链淀粉购自百威灵科技有限公司，α-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶购自美国Sigma公司。其它化学试剂均为国产或进口分析纯。

3、培养基

LB培养基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10，pH 7.0。筛选培养基采用含50μg/mL氨苄青霉素的LB培养基。

本发明中所用到的分子克隆技术和蛋白质检测技术均为本领域中的常规技术。在以下实施例中未作详细介绍的技术，均按照如下实验手册中的相关部分来进行：Green MR,Sambrook J.Molecular cloning:a laboratory manual[M].New York:Cold SpringHarbor Laboratory Press,2012。

实施例1饱和突变体文库的构建

(1)基因TK-PUL的合成

根据基因TK-PUL在NCBI数据库中的Gene ID(No.3235344)，搜索获得其基因序列，如SEQ ID NO.4所示，交由上海博益生物科技有限公司进行TK-PUL的全基因合成。

(2)重组表达载体pSTOP1622-TK-PULh的构建

根据基因TK-PUL的碱基序列设计PCR引物F1、R1(表1)，以合成基因TK-PUL为模板，以F1、R1为引物，进行PCR扩增。PCR扩增条件为：95℃10min；98℃30sec，60℃30sec，74℃1min，30个循环；74℃，5min。扩增产物经Spe I和BamHI双酶切，连接至载体pSTOP1622，构建重组载体pSTOP1622-TK-PULh。

表1构建重组质粒所用的引物

注：下划线标注的部分为限制性酶切割位点，小写字母“nnk”为引入的简并密码子。

(3)饱和突变体文库的构建

采用NCBI数据库的在线软件BLASTP对TK-PUL的氨基酸序列进行相似性分析，选取与其氨基酸序列相似性高的淀粉水解酶。采用Clustal-Omega软件对TK-PUL以及这些淀粉水解酶的氨基酸序列进行多序列比对。根据多序列比对结果，选择邻近TK-PUL催化活性中心的氨基酸残基I500和L538作为饱和突变的位点。

首先以重组质粒pSTOP1622-TK-PULh为模板，以表1中I500F和I500R为引物，采用基因定点突变试剂盒对I500位点进行饱和突变。PCR扩增条件为：94℃5min；94℃30sec，55℃20sec，68℃4min，35个循环；68℃，10min。扩增产物经Dpn I酶处理后电击转化入大肠杆菌E.coli JM109感受态细胞，涂布含有100μg/mL氨苄青霉素的LB平板，于37℃过夜培养。挑取LB固体平板上单个转化子，提取其中所含重组质粒，并送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行DNA测序。将测得碱基序列与基因TK-PUL的碱基序列进行比对确认，比对结果显示相应碱基序列突变成功的重组质粒即为重组载体pSTOP1622-TK-PULhI500。

然后以重组质粒pSTOP1622-TK-PULhI500为模板，以表1中L538F和L538R为引物，采用基因定点突变试剂盒对L538位点进行饱和突变。PCR扩增条件为：94℃5min；94℃30sec，55℃20sec，68℃4min，35个循环；68℃，10min。扩增产物经Dpn I酶处理后电击转化入大肠杆菌E.coli JM109感受态细胞，涂布含有100μg/mL氨苄青霉素的LB平板，于37℃过夜培养。挑取LB固体平板上单个转化子，提取其中所含重组质粒，并送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行DNA测序。将测得碱基序列与基因TK-PUL的碱基序列进行比对确认，比对结果显示相应碱基序列突变成功的重组质粒即为重组载体pSTOP1622-TK-PULhI500L538。

将所获得的重组质粒pSTOP1622-TK-PULhI500L538转化B.subtilis WB600，将转化子涂布于含100μg/mL卡那霉素的LB固体平板上，于37℃过夜培养，即获得饱和突变体文库。

实施例2饱和突变体文库的初步筛选

(1)饱和突变体文库的高通量培养

取灭菌、烘干的96孔板，每孔加入500μL LB培养基。用灭菌牙签挑取上述LB固体上单菌落，转移到培养孔中，依次反复直至挑选结束。盖上盖子，于摇床中37℃过夜培养。用移液器按照顺序将活化后的种子液，以1％接种量转接至新的含有500μLLB培养基96孔板中，37℃培养5h后，向每孔中补加木糖溶液至其终浓度为0.5％(m/v)，然后再于37℃培养20h。

(2)饱和突变体文库的高通量筛选

将培养后的96孔板于4℃下4000×g离心10min，离心后的上清用于酶活检测。取灭菌、烘干的96孔板，每孔加入100μL发酵液上清，然后加入100μL含1％(m/v)玉米淀粉的50mmol/LMES，pH 4.5缓冲液，于80℃反应20min后，向其中补加300μL 3,5-二硝基水杨酸，沸水浴反应10min后转移至冰水浴中快速冷却。取洁净的酶标板加入150μL无菌水和50μL反应液并混匀，用酶标仪测定540nm下的吸光值。反应液吸光值的大小反应突变体的酶活大小，从饱和突变体文库中筛选出对应反应液吸光值提高的三个突变体。

将筛选出反应液吸光值提高的突变体对应的重组枯草芽孢杆菌接种于含有100μg/mL氨苄霉素的20mL LB液体培养基中，37℃快速振荡培养过夜。待培养结束后，收集菌体，并提取重组质粒。对重组质粒进行基因测序分析，与TK-PUL的基因序列进行对比，并利用三联体密码子推定突变体的氨基酸突变。突变体中氨基酸突变与对应反应液的吸光值如表2所示。其中TK-PUL对应反应液于540nm的吸光值为0.460；突变体TP-I500E/L538D对应反应液于540nm的吸光值为0.865；突变体TP-I500Q/L538K对应反应液于540nm的吸光值为0.648；突变体TP-I500E/L538H对应反应液于540nm的吸光值为0.510。

表2突变体与对应反应液的吸光值

注：TP-I500E/L538D：TK-PUL中第500位异亮氨酸(I)突变为谷氨酸(E)，将第538位亮氨酸(L)突变为天冬氨酸(D)；TP-I500Q/L538K：TK-PUL中第500位异亮氨酸(I)突变为谷氨酰胺(Q)，将第538位亮氨酸(L)突变为赖氨酸(K)；TP-I500E/L538H：TK-PUL中第500位异亮氨酸(I)突变为谷氨酸(E)，将第538位亮氨酸(L)突变为组氨酸(H)。

实施例3突变体的复筛

(1)重组酶的诱导表达与纯化

分别将含有重组质粒的B.subtilis WB600菌株接种于含有100μg/mL氨苄霉素的20mL LB液体培养基中，37℃快速振荡培养过夜。将过夜培养物以1％接种量转接至含有100μg/mL氨苄霉素的50mL LB液体培养基中，37℃快速振荡培养至菌液OD_600nm达到0.8左右。添加终浓度为0.5％(m/v)的木糖，继续于37℃培养30h后，12000r/min离心10min收集发酵上清液。

采用Ni²⁺亲和层析柱对发酵上清液中目的蛋白质进行纯化，用250mmol/L咪唑洗脱缓冲液洗脱，即得到纯化后的重组酶。利用SDS-PAGE检测重组酶的纯度，并采用Bradford法测定重组酶的浓度。III型普鲁兰水解酶TK-PUL及突变体TP-I500E/L538D、TP-I500Q/L538K、TP-I500E/L538H的SDS-PAGE检测图如图1所示。

(2)重组酶的比活力测定

重组酶的比活力测定：分别以玉米淀粉、玉米直链淀粉或玉米支链淀粉为底物测定重组酶的比活力。将10μL酶液与490μL含1％(m/v)底物的50mmol/LMES，pH5.0缓冲液混合，于80℃反应20min后，迅速放入冰水浴中终止反应，然后采用3,5-二硝基水杨酸法测定反应体系中还原糖量。生成的还原糖通过麦芽糖标准工作曲线折算为麦芽糖质量表示。酶活力单位(U)定义：在一定反应条件下，每分钟催化产生1μmol麦芽糖的酶量为一个酶活力单位(U)。

重组酶的比活力测定结果如表3所示。以玉米淀粉为底物，TK-PUL的比活力为48.08U/mg；突变体TP-I500E/L538D的比活力为133.66U/mg，提高了1.78倍；突变体TP-I500E/L538D的比活力为68.66U/mg，提高了0.43倍；突变体TP-I500E/L538D的比活力为55.20U/mg，提高了0.15倍。在这四种重组酶中，突变体TP-I500E/L538D的比活力最高，并且突变体TP-I500E/L538D以玉米直链淀粉或玉米支链淀粉为底物的比活力也是最高的。

表3TK-PUL及突变体的比活力

实施例4突变体应用于制备玉米抗性淀粉

分别利用III型普鲁兰水解酶突变体TP-I500E/L538D、TP-I500Q/L538K、TP-I500E/L538H制备玉米抗性淀粉，并以III型普鲁兰水解酶TK-PUL作为对照。

抗性淀粉的制备：取一定量普通玉米淀粉(M)于三角瓶中，加入蒸馏水，配制成浓度为15％(m/v)的玉米淀粉乳。向15％玉米淀粉乳中加入1mol/LHCl溶液调整pH值为5.0，添加III型普鲁兰水解酶进行处理(添加酶量为15U/g玉米淀粉、反应时间为12h、反应温度为80℃，pH值为5.0)。将处理后样品于沸水浴加热5min，再使其冷却至室温后，将其于4℃保存24h，回生。向充分回生后的样品中加入蒸馏水，用磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(pH 6.0)调节pH值至5.0～6.0，加入过量α-淀粉酶，60℃水浴24h；将水解后的样品于沸水浴加热5min，再加入4倍体积95％乙醇于室温下处理12h；将处理后样品于4000r/min离心20min，弃去上清液，加入10mL 95％乙醇洗涤沉淀2次，沉淀于50℃烘干称量(M0)，粉碎、过100目筛，得所述玉米抗性淀粉。

抗性淀粉含量的测定：准确称取1.0g(M1)粉碎后的抗性淀粉样品于离心管中，加入6mL水和6mL 4mol/L KOH溶液，室温搅拌30min；加入11.5mL 2mol/L HCl溶液和6mL0.4mol/L乙酸钠缓冲液(pH值为4.75)，调整pH至4.5；加入1mL 1％(m/v)葡萄糖淀粉酶(1500U/mL)，60℃水解45min；沸水浴加热5min，4000r/min离心20min，收集上清液，10mL蒸馏水洗涤沉淀2次；上清液合并，定容至100mL。菲林滴定法测定上清液中还原糖含量，数据乘以0.9即为抗性淀粉量(M2)。根据公式(1)计算抗性淀粉的含量(X)，并以此代入公式(2)计算抗性淀粉的得率(Y)。

X(％)＝M1/M2×100％ (1)

Y(％)＝(M0×X)/M×100％ (2)

利用III型普鲁兰水解酶TK-PUL和突变体制备玉米抗性淀粉的工艺条件如下：普通玉米淀粉乳浓度为15％(m/v)、III型普鲁兰水解酶加酶量为15U/g玉米淀粉、反应时间为12h、反应温度为80℃、pH值为5.0。在此制备条件下，III型普鲁兰水解酶TK-PUL和突变体的玉米抗性淀粉制备率如表4所示，其中突变体TP-I500E/L538D的玉米抗性淀粉制备率最高，突变体TP-I500E/L538D的玉米抗性淀粉制备得率由对照(突变前)的30.87％提高到59.15％，提高了0.92倍。

表4TK-PUL及突变体的玉米抗性淀粉制备率

TP-I500E/L538D的氨基酸序列(SEQ ID NO.1)：

MKKGGLLLILLILVSIASGCISESNENQTATASTVPPTSVTPSQSSTPTTSTSTYGPSERTELKLPSVNYTPIYVGIEKGCPSGRVPVKFTYNPGNKTVKSVSLRGSFNNWGEWPMELKNGTWETTVCLRPGRYEYKYFINGQWVKDMSDDGTGRPYDPDADAYAPDGYGGKNAVRVVEGREAFYVEFDPRDPAYLSIADKRTVVRFEAKRDTVESAVLVTDHGNYTMKLQVWWDFGETWRAEMPVEPADYYILVTSSDGGKFAVLNTSESPFFHFDGVEGFPQLEWVSNGITYQIFPDRFNNGNKSNDALALDHDELILNQVNPGQPILSNWSDPITPLHCCHQYFGGDIKGITEKLDYLQSLGVTIIYINPIFLSGSAHGYDTYDYYRLDPKFGTEDELREFLDEAHRRGMRVIFDFVPNHCGIGNPAFLDVWEKGNESPYWDWFFVKKWPFKLGDGSAYVGWWGFGSLPKLNTANQEVREYLIGAALHWIEFGFDGERVDVPNEVLDPGTFFPELRKAVKEKKPDAYLVGEIWTDSPEWVKGDRFDSLMNYALGRDILLNYAKGLLSGESAMKMMGRYYASYGENVVAMGFNLVDSHDTSRVLTDLGGGKLGDTPSNESIQRLKLLSTLLYALPGTPVTFQGDERGLLGDKGHYDEQRYPIQWDTVNEDVLNHYRALAELRKRVPALRSSAMRFYTAKGGVMAFFRGHHDEVLVVANSWKKPALLELPEGEWKVIWPEDFSPELLRGTVEVPAIGIIILERG。

TP-I500E/L538D的核苷酸序列(SEQ ID NO.2)：

ATGAAAAAAGGTGGTCTGCTGCTCATTCTCCTGATTCTGGTCTCAATCGCCAGCGGATGTATCTCGGAGAGCAACGAAAATCAAACTGCAACGGCTTCGACCGTTCCACCGACTTCAGTGACACCCTCACAGTCTTCCACTCCCACAACCTCGACCTCGACGTACGGCCCTTCCGAAAGAACGGAGCTTAAACTTCCTTCGGTTAACTACACTCCCATCTACGTCGGCATAGAGAAAGGCTGTCCCTCCGGAAGAGTCCCGGTGAAGTTCACGTACAACCCCGGAAACAAGACCGTAAAGTCTGTCAGCCTCCGCGGGAGCTTCAACAACTGGGGAGAGTGGCCGATGGAGCTGAAGAACGGCACGTGGGAGACGACCGTCTGTCTCCGCCCTGGAAGGTATGAGTATAAGTACTTCATCAACGGCCAGTGGGTCAAGGACATGTCCGACGACGGGACGGGAAGGCCCTACGACCCCGATGCAGACGCCTATGCCCCCGATGGCTACGGGGGAAAGAACGCCGTGAGGGTAGTTGAGGGCCGCGAAGCGTTCTACGTGGAGTTCGATCCAAGAGACCCAGCCTACCTCAGCATCGCGGACAAAAGAACCGTGGTCAGGTTCGAGGCTAAGAGAGACACCGTCGAGTCTGCGGTTCTCGTTACGGATCACGGGAACTACACGATGAAGCTTCAGGTCTGGTGGGACTTCGGCGAAACCTGGCGCGCCGAGATGCCAGTTGAACCCGCTGATTATTACATTCTCGTAACCTCCTCCGACGGCGGGAAGTTTGCCGTCCTAAACACAAGCGAAAGCCCGTTCTTCCACTTTGATGGCGTTGAGGGGTTCCCCCAGCTGGAGTGGGTGAGCAACGGGATAACCTACCAGATATTCCCCGACAGGTTCAACAACGGCAATAAAAGCAACGATGCCCTAGCTTTGGATCACGACGAGCTAATTTTGAACCAGGTTAATCCAGGGCAGCCAATCCTCTCCAACTGGAGCGACCCGATAACGCCCCTCCACTGCTGCCACCAGTACTTCGGCGGCGACATAAAGGGAATAACGGAGAAGCTCGACTACCTTCAGAGCCTAGGTGTTACTATAATCTACATCAACCCGATTTTCCTCTCGGGAAGCGCCCACGGCTACGACACCTACGACTACTACCGGCTCGACCCCAAGTTCGGGACCGAGGATGAGCTGAGAGAGTTCCTCGATGAGGCCCACAGGAGGGGAATGAGGGTAATCTTCGATTTCGTGCCCAACCACTGCGGCATAGGGAATCCAGCCTTCCTCGACGTCTGGGAGAAGGGCAACGAAAGCCCATACTGGGACTGGTTCTTCGTCAAGAAGTGGCCCTTCAAGCTCGGCGATGGGAGCGCCTACGTCGGCTGGTGGGGCTTTGGGAGCCTTCCGAAGCTCAACACTGCCAACCAGGAGGTCAGGGAGTACCTGATAGGAGCGGCCCTCCACTGGATAGAGTTCGGCTTTGACGGCGAAAGGGTGGATGTGCCGAACGAAGTCCTCGACCCGGGGACGTTCTTCCCGGAGCTGAGAAAGGCAGTTAAGGAGAAAAAGCCCGACGCGTACCTCGTCGGCGAGATATGGACGGACTCCCCGGAGTGGGTGAAGGGAGACCGCTTCGACTCCCTCATGAACTACGCCCTCGGGAGGGACATCCTCCTGAACTACGCTAAGGGCCTGCTCAGCGGAGAAAGTGCAATGAAAATGATGGGACGTTACTACGCTTCCTACGGCGAGAACGTAGTTGCGATGGGCTTCAACCTCGTTGATTCGCACGACACTTCGAGGGTTCTCACTGACCTCGGTGGTGGCAAACTGGGAGACACACCGTCAAACGAGTCAATTCAGAGGCTCAAGCTCCTCTCAACGCTCCTCTATGCCCTGCCCGGAACTCCCGTCACCTTCCAGGGGGACGAGAGGGGACTGCTCGGAGACAAGGGACACTACGATGAGCAACGCTATCCGATACAGTGGGATACTGTGAACGAGGACGTCCTGAACCACTACAGGGCACTGGCGGAGCTCAGAAAAAGAGTTCCCGCATTGAGGAGCAGCGCAATGAGGTTCTACACTGCCAAAGGCGGCGTTATGGCCTTCTTCAGGGGACATCATGACGAGGTTCTCGTCGTTGCCAACAGCTGGAAGAAGCCAGCCCTACTGGAGCTTCCCGAGGGAGAGTGGAAAGTAATCTGGCCTGAGGATTTCAGCCCGGAACTGCTTCGCGGCACAGTTGAAGTGCCAGCCATAGGGATAATCATCCTTGAGCGGGGTTGA。

III型普鲁兰水解酶TK-PUL的氨基酸序列(SEQ ID NO.3)：

MKKGGLLLILLILVSIASGCISESNENQTATASTVPPTSVTPSQSSTPTTSTSTYGPSERTELKLPSVNYTPIYVGIEKGCPSGRVPVKFTYNPGNKTVKSVSLRGSFNNWGEWPMELKNGTWETTVCLRPGRYEYKYFINGQWVKDMSDDGTGRPYDPDADAYAPDGYGGKNAVRVVEGREAFYVEFDPRDPAYLSIADKRTVVRFEAKRDTVESAVLVTDHGNYTMKLQVWWDFGETWRAEMPVEPADYYILVTSSDGGKFAVLNTSESPFFHFDGVEGFPQLEWVSNGITYQIFPDRFNNGNKSNDALALDHDELILNQVNPGQPILSNWSDPITPLHCCHQYFGGDIKGITEKLDYLQSLGVTIIYINPIFLSGSAHGYDTYDYYRLDPKFGTEDELREFLDEAHRRGMRVIFDFVPNHCGIGNPAFLDVWEKGNESPYWDWFFVKKWPFKLGDGSAYVGWWGFGSLPKLNTANQEVREYLIGAALHWIEFGFDGIRVDVPNEVLDPGTFFPELRKAVKEKKPDAYLVGEIWTLSPEWVKGDRFDSLMNYALGRDILLNYAKGLLSGESAMKMMGRYYASYGENVVAMGFNLVDSHDTSRVLTDLGGGKLGDTPSNESIQRLKLLSTLLYALPGTPVTFQGDERGLLGDKGHYDEQRYPIQWDTVNEDVLNHYRALAELRKRVPALRSSAMRFYTAKGGVMAFFRGHHDEVLVVANSWKKPALLELPEGEWKVIWPEDFSPELLRGTVEVPAIGIIILERG。

III型普鲁兰水解酶TK-PUL的核苷酸序列(SEQ ID NO.4)：

ATGAAAAAAGGTGGTCTGCTGCTCATTCTCCTGATTCTGGTCTCAATCGCCAGCGGATGTATCTCGGAGAGCAACGAAAATCAAACTGCAACGGCTTCGACCGTTCCACCGACTTCAGTGACACCCTCACAGTCTTCCACTCCCACAACCTCGACCTCGACGTACGGCCCTTCCGAAAGAACGGAGCTTAAACTTCCTTCGGTTAACTACACTCCCATCTACGTCGGCATAGAGAAAGGCTGTCCCTCCGGAAGAGTCCCGGTGAAGTTCACGTACAACCCCGGAAACAAGACCGTAAAGTCTGTCAGCCTCCGCGGGAGCTTCAACAACTGGGGAGAGTGGCCGATGGAGCTGAAGAACGGCACGTGGGAGACGACCGTCTGTCTCCGCCCTGGAAGGTATGAGTATAAGTACTTCATCAACGGCCAGTGGGTCAAGGACATGTCCGACGACGGGACGGGAAGGCCCTACGACCCCGATGCAGACGCCTATGCCCCCGATGGCTACGGGGGAAAGAACGCCGTGAGGGTAGTTGAGGGCCGCGAAGCGTTCTACGTGGAGTTCGATCCAAGAGACCCAGCCTACCTCAGCATCGCGGACAAAAGAACCGTGGTCAGGTTCGAGGCTAAGAGAGACACCGTCGAGTCTGCGGTTCTCGTTACGGATCACGGGAACTACACGATGAAGCTTCAGGTCTGGTGGGACTTCGGCGAAACCTGGCGCGCCGAGATGCCAGTTGAACCCGCTGATTATTACATTCTCGTAACCTCCTCCGACGGCGGGAAGTTTGCCGTCCTAAACACAAGCGAAAGCCCGTTCTTCCACTTTGATGGCGTTGAGGGGTTCCCCCAGCTGGAGTGGGTGAGCAACGGGATAACCTACCAGATATTCCCCGACAGGTTCAACAACGGCAATAAAAGCAACGATGCCCTAGCTTTGGATCACGACGAGCTAATTTTGAACCAGGTTAATCCAGGGCAGCCAATCCTCTCCAACTGGAGCGACCCGATAACGCCCCTCCACTGCTGCCACCAGTACTTCGGCGGCGACATAAAGGGAATAACGGAGAAGCTCGACTACCTTCAGAGCCTAGGTGTTACTATAATCTACATCAACCCGATTTTCCTCTCGGGAAGCGCCCACGGCTACGACACCTACGACTACTACCGGCTCGACCCCAAGTTCGGGACCGAGGATGAGCTGAGAGAGTTCCTCGATGAGGCCCACAGGAGGGGAATGAGGGTAATCTTCGATTTCGTGCCCAACCACTGCGGCATAGGGAATCCAGCCTTCCTCGACGTCTGGGAGAAGGGCAACGAAAGCCCATACTGGGACTGGTTCTTCGTCAAGAAGTGGCCCTTCAAGCTCGGCGATGGGAGCGCCTACGTCGGCTGGTGGGGCTTTGGGAGCCTTCCGAAGCTCAACACTGCCAACCAGGAGGTCAGGGAGTACCTGATAGGAGCGGCCCTCCACTGGATAGAGTTCGGCTTTGACGGCATTAGGGTGGATGTGCCGAACGAAGTCCTCGACCCGGGGACGTTCTTCCCGGAGCTGAGAAAGGCAGTTAAGGAGAAAAAGCCCGACGCGTACCTCGTCGGCGAGATATGGACGCTCTCCCCGGAGTGGGTGAAGGGAGACCGCTTCGACTCCCTCATGAACTACGCCCTCGGGAGGGACATCCTCCTGAACTACGCTAAGGGCCTGCTCAGCGGAGAAAGTGCAATGAAAATGATGGGACGTTACTACGCTTCCTACGGCGAGAACGTAGTTGCGATGGGCTTCAACCTCGTTGATTCGCACGACACTTCGAGGGTTCTCACTGACCTCGGTGGTGGCAAACTGGGAGACACACCGTCAAACGAGTCAATTCAGAGGCTCAAGCTCCTCTCAACGCTCCTCTATGCCCTGCCCGGAACTCCCGTCACCTTCCAGGGGGACGAGAGGGGACTGCTCGGAGACAAGGGACACTACGATGAGCAACGCTATCCGATACAGTGGGATACTGTGAACGAGGACGTCCTGAACCACTACAGGGCACTGGCGGAGCTCAGAAAAAGAGTTCCCGCATTGAGGAGCAGCGCAATGAGGTTCTACACTGCCAAAGGCGGCGTTATGGCCTTCTTCAGGGGACATCATGACGAGGTTCTCGTCGTTGCCAACAGCTGGAAGAAGCCAGCCCTACTGGAGCTTCCCGAGGGAGAGTGGAAAGTAATCTGGCCTGAGGATTTCAGCCCGGAACTGCTTCGCGGCACAGTTGAAGTGCCAGCCATAGGGATAATCATCCTTGAGCGGGGTTGA。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (7)

1.一种制备玉米抗性淀粉的III型普鲁兰水解酶突变体，其特征在于，所述III型普鲁兰水解酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种编码如权利要求1所述的III型普鲁兰水解酶突变体的编码基因。

3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。

4.一种重组载体，其特征在于，包括权利要求2或3所述的编码基因。

5.一种重组微生物菌株，其特征在于，包括权利要求4所述的重组载体。

6.一种如权利要求2或3所述的编码基因、如权利要求4所述的重组载体或权利要求5所述的重组微生物菌株在制备III型普鲁兰水解酶突变体中的应用。

7.一种如权利要求1所述的III型普鲁兰水解酶突变体在制备玉米抗性淀粉中的应用。

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