CN115896082A - 褐藻酸裂解酶突变体及其应用 - Google Patents

Abstract

一种褐藻酸裂解酶突变体，所述的褐藻酸裂解酶突变体由野生型褐藻酸裂解酶通过点突变获得，所述的野生型褐藻酸裂解酶氨基酸序列为SEQ ID NO:1；所述的褐藻酸裂解酶突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO:2‑3。本发明提供的褐藻酸裂解酶突变体的蛋白表达量高于野生型褐藻酸裂解酶，1L发酵液分离纯化后可获得700±50mg纯酶，远高现有水平，为褐藻酸裂解酶的工业化生产提供了可能。

Description

褐藻酸裂解酶突变体及其应用

技术领域

本发明属于酶制剂领域，具体涉及一种褐藻酸裂解酶及其应用。

背景技术

褐藻酸是一种线性酸性多糖，主要由褐藻以及细菌产生，是褐藻门植物如海带、裙带菜等细胞壁的主要成分。褐藻酸中主要包括两种单体，β-D-甘露糖醛酸(M)和α-L-古罗糖醛酸(G)。各个单体之间通过1→4糖苷键相连，可在褐藻酸中形成三个不同的嵌段：均聚甘露糖醛酸片段(polyM)、均聚古罗糖醛酸片段(polyG)、以及由两个单体交替连接形成杂合片段(polyMG)。

褐藻酸因聚合度高、分子量大、粘度高等很难被机体吸收利用，限制了其应用。褐藻酸寡糖(AOS)是褐藻酸的降解产物，具有显著的生理活性，如免疫调节、抗菌、抗氧化、益生元、抗高血压、抗糖尿病、抗肿瘤和抗凝血活性等。同时AOS可加速微生物代谢、促进根的生长、提高植物的产量和质量、提高植物的抗病性、诱导植物免疫性，可用于制备生物肥料。

目前制备AOS的方法主要包括物理降解法、化学法和酶法。化学方法已被广泛研究用于AOS的生产。盐酸(HCl)和过氧化氢(H₂O₂)是目前降解海藻酸盐最常用的化学试剂。然而，海藻酸盐相对耐酸，因此需在95-121℃进行高温热处理。超声波、紫外线和伽马辐照广泛用于海藻酸盐的降解，其他物理处理如等离子体处理、水热处理和亚临界水水解，也能有效地解聚藻酸盐。但物理降解法生产过程能耗高，且产品质量难以保证。

与物理和化学方法相比，酶法生产AOS使用化学试剂少，反应条件温和，更加环保和节能、可持续发展潜力大，利用海藻酸裂解酶的酶促方法可能为AOS的生产提供一种优越的方法。

褐藻酸裂解酶属于多糖裂解酶家族(polysaccharidelyasefamily，PLs)，可通过β-消除来降解褐藻酸。褐藻酸裂解酶的来源主要有：海洋细菌、土壤细菌、噬菌体以及真菌等微生物；海洋藻类；海洋棘皮动物；软体动物。目前对褐藻酸裂解酶的分类方法大致有以下几种方式：根据酶的作用方式可分为内切型和外切型褐藻酸裂解酶；根据氨基酸序列来分，褐藻酸裂解酶分属到12个多糖裂解酶家族，即PL5、PL6、PL7、PL14、PL15、PL17、PL18、PL31、PL32、PL34、PL36和PL39；根据底物特异性来分，可分为polyM特异性裂解酶(EC4.2.2.3)、polyG特异性裂解酶(EC 4.2.2.11)和可降解polyM和polyG的双功能裂解酶(EC4.2.2.-)。从结构上来看，褐藻酸裂解酶主要可以分为3类：①β果冻卷，主要是由2个β折叠片和少量的α螺旋组成的球状结构，PL7、PL14，PL18家族的酶多为这种结构；②(α/α)n桶状结构，通常由3到7个α螺旋组成，PL5、PL15、PL17家族的酶多为这种结构；③β螺旋，由三段β折叠片以及转角和环组成PL6家族的酶多为这种结构。

由于目前从自然界分离到的天然菌株，分泌褐藻酸裂解酶的能力很低，不能满足工业生产的需求。而工业用褐藻酸裂解酶由于异源表达菌株的分泌性能较差，产酶效率过低等因素，又极大地限制了我国褐藻酸裂解酶的规模化工业生产。为解决这些问题大致有两条途径：一是，通过传统的遗传学方法对已有的菌株进行改良以获得性能更优良的菌株；二是，通过基因工程的手段克隆性能优良的褐藻酸裂解酶基因并将其导入到合适的宿主体内得到优良的重组菌。Akira Inoue等截短表达了褐藻酸裂解酶FlAlyA，但其产量较低，1L发酵液仅获得18mg纯酶[1]。孙小越等对褐藻酸裂解酶HMS-Alg进行改造，1L发酵液可获得胞外酶0.58g，但HMS-Alg本身产酶量就低于FlAlyA[2]。

目前，褐藻酸裂解酶的工业化应用仍然存在需要解决的关键性问题：1)自然条件下，产酶量有限，不能满足工业生产的要求；3)现有基因工程菌株产酶量较低，经济成本较高。如上所述的缺陷在一定程度上减缓了褐藻酸裂解酶的应用进程。对褐藻酸裂解酶进行优化筛选以解决以上问题十分迫切。

[1]A.Inoue,et al.,The alginate lyases FlAlyA,FlAlyB,FlAlyC,and FlAlexfromFlavobacteriumsp.UMI-01have distinct roles inthe complete degradation ofalginate,Algal Res.(2016),http://dx.doi.org/10.1016/j.algal.2016.03.008.

[2]孙小越.海洋来源褐藻酸裂解酶的异源表达和规模化制备研究[D].华东理工大学,2018.

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：针对现在褐藻酸裂解酶存在产量低，难以实际应用于工业生产等问题，提供一种高产的褐藻酸裂解酶。

一方面，本发明提供了一种褐藻酸裂解酶突变体。

所述的褐藻酸裂解酶突变体由野生型褐藻酸裂解酶通过点突变获得，所述的野生型褐藻酸裂解酶氨基酸序列为SEQ ID NO:1；

所述的褐藻酸裂解酶突变体为FlAlyA^D21N；

所述的FlAlyA^D21N为SEQ ID NO:1第21位的天冬氨酸突变为天冬酰胺后得到，氨基酸序列为SEQ ID NO:2；

或者，所述的褐藻酸裂解酶突变体为FlAlyA^N166H；

所述的FlAlyA^N166H为SEQ ID NO:1第166位的天冬酰胺突变为组氨酸后得到，氨基酸序列为SEQ ID NO:3。

本发明还提供了编码上述褐藻酸裂解酶及突变体的核酸。

编码所述野生型褐藻酸裂解酶的核酸序列为SEQ ID NO:4。

编码所述FlAlyA^D21N的核酸序列为SEQ ID NO:5。

编码所述FlAlyA^N166H的核酸序列为SEQ ID NO:6。

又一方面，本发明还提供了包括前述核酸的载体，以及包括该载体的基因工程细胞。

优选地，所述的载体为pET22b。

优选地，所述的基因工程细胞为大肠杆菌工程菌株；所述的大肠杆菌工程菌株携带有表达褐藻酸裂解酶的重组质粒，优选为BL21-CodonPlus-RIL。

又一方面，本发明还提供了包括前述褐藻酸裂解酶突变体的酶制剂。

优选地，所述的酶制剂为液体酶、粉状酶、试剂酶、固定化酶中的一种或多种。

所述的酶制剂还包括其他本领域常用的辅料，以易于产品贮存、使用，如稀释剂、加工助剂等。

又一方面，本发明还提供了前述核酸和/或载体和/或基因工程细胞在生产褐藻酸裂解酶中的应用。

所述的基因工程细胞为大肠杆菌工程菌株。

优选地，所述的应用为通过培养前述大肠杆菌工程菌株对褐藻酸裂解酶进行表达。

优选地，所述的大肠杆菌工程菌株为BL21-CodonPlus-RIL。

优选地，所述的大肠杆菌工程菌株的培养条件为：将含有褐藻酸裂解酶突变体表达载体的宿主BL21-CodonPlus-RIL单克隆挑至LB试管当中，37℃，220r/min摇过夜，然后转接至LB三角瓶中，37℃，220r/min摇至OD600到0.8-1.0时，添加IPTG至终浓度0.1mM，25℃，220r/min诱导24h。

又一方面，本发明还提供了前述褐藻酸裂解酶突变体、核酸、载体、基因工程细胞、酶制剂在制备褐藻酸寡糖的应用，以及制备包括褐藻酸寡糖的产品中的应用。

所述的包括褐藻酸的产品包括但不限于：药物、食品、饲料。

所述的药物包括但不限于：所述的药物为心血管药物、降脂药、降糖药、降压药、抗栓药、抗病毒药物、抗尿路结石药物中的一种或多种。

根据本领域一般认知，褐藻酸寡糖在多种药物中的应用已经公开，本申请制备的褐藻酸寡糖可以相同地应用在相应的领域中，包括但不限于上述所提及的药物应用方向。

又一方面，本发明还提供了一种褐藻酸的制备方法。

所述的制备方法通过前述的褐藻酸裂解酶或核酸或载体或基因工程细胞或酶制剂实现。

优选地，所述的方法中包括使用前述的褐藻酸裂解酶突变体对褐藻酸进行裂解。

优选地，所述的裂解条件为：底物与酶混合后于30℃反应10min后，沸水煮沸10min，终止反应。

本发明的有益效果：

野生型褐藻酸裂解酶FlAlyA的酶活可达到1.0×10⁵U/mg，1L发酵液分离纯化后可获得600±50mg flAlyA纯酶。突变体FlAlyA^D21N和FlAlyA^N166H的蛋白表达量高于野生型褐藻酸裂解酶FlAlyA，1L发酵液分离纯化后可获得700±50mg flAlyA纯酶，远高现有水平，为褐藻酸裂解酶的工业化生产提供了可能。

附图说明

图1为pET22b-flAlyA质粒图谱。

图2为野生型褐藻酸裂解酶FlAlyA与突变体FlAlyA^D21N和FlAlyA^N166H的蛋白表达图。

图3为野生型褐藻酸裂解酶FlAlyA分离纯化SDS PAGE电泳分析图；其中M：Marker；1：破胞液；2：破胞液上清；3：破胞液沉淀；4：流穿液；5：洗杂液；6：洗脱液。

图4为突变体FlAlyA^D21N分离纯化SDS PAGE电泳分析图，其中M：Marke；1：破胞液；2：破胞液上清；3：破胞液沉淀；4：流穿液；5、6、7：洗杂液；8：洗脱液。

图5为突变体FlAlyA^N166H分离纯化SDS PAGE电泳分析图，其中M：Marker；1：破胞液；2：破胞液上清；3：破胞液沉淀；4：流穿液；5、6：洗杂液；7：洗脱液。

图6为野生型褐藻酸裂解酶FlAlyA与突变体FlAlyA^D21N和FlAlyA^N166H的酶活。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下实施例中各培养基及配方如下：

LB液体培养基：酵母提取物5.0g/L，蛋白胨10.0g/L，NaCl 10.0g/L。

LB固体培养基：酵母提取物5.0g/L，蛋白胨10.0g/L，NaCl 10.0g/L，琼脂2g/L。

实施例1重组褐藻酸裂解酶的构建、表达和纯化

为了提高野生型褐藻酸裂解酶FlAlyA(氨基酸序列为SEQ ID NO:1，编码核苷酸序列为SEQ ID NO:4)的蛋白表达量，对野生型的褐藻酸裂解酶FlAlyA的氨基酸位点进行了大量的点突变改造筛选。其中有些改造使突变体不可溶表达，有些改造使突变体的蛋白表达量未发生明显变化。最终筛选到两种蛋白表达量提高的褐藻酸裂解酶变体。

1.1重组载体的构建

合成野生型褐藻酸裂解酶FlAlyA的基因片段：CATATG(Nde I酶切位点序列)-褐藻酸裂解酶编码序列(SEQ ID NO:4)-CTCGAG(Xho I酶切位点序列)。野生型褐藻酸裂解酶FlAlyA的核酸序列由上海生工生物工程股份有限公司合成。

以野生型褐藻酸裂解酶FlAlyA基因为模板，设计引物FlAlyA^D21N-F及FlAlyA^D21N-R，PCR扩增得到突变体FlAlyA^D21N基因序列；以野生型褐藻酸裂解酶FlAlyA基因为模板，设计引物FlAlyA^N166H-F及FlAlyA^N166H-R，PCR扩增得到突变体FlAlyA^N166H基因序列；引物信息如下：

FlAlyA^D21N-F：

5'-CTGAGGAGAATCCAaatAAACCAGGTAAGCCATACTCTTTAGG-3'(SEQ ID NO:7)；

FlAlyA^D21N-R：

5'-attTGGATTCTCCTCAGGCACAGTAACCGTCC-3'(SEQ ID NO:8)；

FlAlyA^N166H-F：

5'-AGATTTGcacGCGCCTTATAAAGAAATGCTTTC-3'(SEQ ID NO:9)；

FlAlyA^N166H-R：

5'-AAGGCGCgtgCAAATCTTTAAGTACTTTTGTTTTCACACG-3'(SEQ ID NO:10)；

以上引物中，小写字母代表突变位点处的核苷酸序列。

将表达载体pET22b(+)分别用限制性内切酶Nde I和Xho I双酶切，得到具有粘性末端的载体pET22b(+)片段；将所述具有相同粘性末端的褐藻酸裂解酶基因片段flAlyA、flAlyA^D21N以及flAlyA^N166H分别与载体pET22b(+)片段通过同源重组连接，获得褐藻酸裂解酶重组表达载体pET22b-flAlyA、pET22b-flAlyA^D21N和pET22b-flAlyA^N166H。pET22b-flAlyA质粒图谱见图1。表达载体pET22b(+)启动子为T7，属于强启动子。

1.2大肠杆菌的转化和筛选

1)从-80℃冰箱中取100μL大肠杆菌DH5α感受态细胞悬液，冰上溶解10分钟。

2)取10μL上述重组表达载体加入感受态细胞中，轻轻摇匀，冰上放置30分钟。

3)42℃水浴中热击90秒，热击后迅速置于冰上冷却2分钟。

4)加入700μL LB液体培养基(不含氨苄青霉素)，混匀后37℃振荡培养1小时，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因(氨苄青霉素)。

5)将上述菌液摇匀后取100μL涂布于含氨苄青霉素的LB筛选平板上，正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养16-24小时。挑选单菌落送测序，测序正确后，即得到含有褐藻酸裂解酶基因的重组载体pET22b-flAlyA、pET22b-flAlyA^D21N和pET22b-flAlyA^N166H。

1.3重组菌株的构建

(1)重组质粒的提取

天根质粒DNA小提试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。

步骤参照说明书，具体如下：

1)柱平衡步骤：向吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中)加入500μL的平衡液BL，12000rpm(13400×g)离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

2)取2mL过夜培养的带有重组质粒的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心机，12000rpm(13400×g)离心1min，尽量吸除上清(菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中)。

3)向留有菌体沉淀的离心管中加入250μL溶液P1(请先检查是否已加入RNaseA)，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。

4)向离心管中加入250μL溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。

5)向离心管中加入350μL溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。12000rpm(13400×g)离心10min。

6)将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中)，注意尽量不要吸出沉淀。12000rpm(13400×g)离心30 60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。

7)可选步骤：向吸附柱CP3中加入500μL去蛋白液PD，12000rpm(13400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3重新放回收集管中。

8)向吸附柱CP3中加入600μL漂洗液PW(请先检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm(13400×g)离心3060sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。

9)重复操作步骤8)。

10)将吸附柱CP3放入收集管中，12000rpm(13400×g)离心2min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。

11)将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50 100μL洗脱缓冲液EB，室温放置2min，12000rpm(13400×g)离心2min将质粒溶液收集到离心管中。

(2)重组质粒转化大肠杆菌BL21-CodonPlus-RIL

从-80℃冰箱中取100μL大肠杆菌DH5α感受态细胞悬液，冰上溶解10分钟。

取10μL上述连接产物加入感受态细胞中，轻轻摇匀，冰上放置30分钟。

42℃水浴中热激90秒，热击后迅速置于冰上冷却2分钟。

加入700μL LB液体培养基(不含氨苄青霉素)，混匀后37℃振荡培养1小时，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因(氨苄青霉素)。

将上述菌液摇匀后取100μL涂布于含Amp的LB筛选平板上，正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养16-24小时。

挑取单菌种到含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃、220r/min培养12h，将菌液用于保存20℃，得到含有重组质粒的大肠杆菌。

1.4蛋白表达纯化

(1)蛋白诱导表达

将含有褐藻酸裂解酶野生型或优选突变体表达载体的宿主BL21-CodonPlus-RIL单克隆挑至LB试管当中，37℃，220r/min摇过夜，然后转接至LB三角瓶中，37℃，220r/min摇至OD₆₀₀到0.8-1.0时，添加IPTG至终浓度0.1mM，25℃，220r/min诱导24h。诱导结束后，离心收集菌体。

离心收集菌体：在4℃条件下，8000g，20min离心收集发酵所得的工程菌株的菌体。

超声破碎菌体：每1g湿菌体加入25mL缓冲液(20mM Tris，300mM NaCl，pH 7.0)重悬菌体，每50mL菌液于100mL烧杯中，冰水浴条件下，以600W功率，超声2s，间歇2s，破碎10min以裂解细胞。在4℃条件下，7200rpm，15min离心后，弃去沉淀，保留上清即为褐藻酸裂解酶的粗提取酶溶液。细胞液上清电泳结果见图2。

蛋白纯化：用裂解缓冲液(20mM Tris，300mM NaCl，pH＝7.0)重悬，用购自上海翊圣的Ni柱纯化粗酶液，20mM咪唑洗杂，500mM咪唑洗脱，收集洗脱液，进行蛋白SDS-PAGE电泳检测。电泳结果见图3-5。

实施例2基因工程产物检测

对实施例1的产物进行检测，具体包括以下：

2.1蛋白表达量确定

使用赛默飞NanoDrop2000C超微量分光光度计测量蛋白浓度。野生型褐藻酸裂解酶FlAlyA的1L发酵液分离纯化后可获得600±50mg flAlyA纯酶。突变体FlAlyA^D21N和FlAlyA^N166H的蛋白表达量高于野生型褐藻酸裂解酶FlAlyA，1L发酵液分离纯化后可获得700±50mg纯酶，远高于其他褐藻酸裂解酶，为褐藻酸裂解酶的工业化生产提供了可能。

2.2褐藻酸裂解酶酶活测定

褐藻酸裂解酶酶活力测定中所用的底物配制方法：称取0.5g海藻酸钠至100ml10mM的磷酸钠缓冲液中，沸水加热搅拌至溶解，然后添加NaCl至其终浓度为100mM，添加BSA至其终浓度为0.1mg/mL。

褐藻酸裂解酶酶活测定方法：

(1)酶活力单位(U)定义

在235nm处，每分钟水解使吸光度增加0.01所需的酶量。

(2)酶活测定

褐藻酸裂解酶酶活力测定包括野生型和突变体的测定。900μL 0.5％底物+100μL稀释的酶液(0.01mg/mL)，混合后于30℃反应10min后，沸水煮沸10min，终止反应。样品稀释20倍后用酶标仪测235nm波长处的吸光度，并换算成相应酶活单位。

野生型褐藻酸裂解酶FlAlyA的酶活为1.0×10⁵U/mg，突变体FlAlyA^D21N和FlAlyA^N166H的酶活可分别达到1.1×10⁵U/mg和0.98×10⁵U/mg(图6)。表明突变体FlAlyA^D21N和FlAlyA^N166H在提高表达量的同时，可保留较高酶活。

Claims (15)

1.一种褐藻酸裂解酶突变体，其特征在于，所述的褐藻酸裂解酶突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO:2-3。

2.编码权利要求1所述的褐藻酸裂解酶突变体的核酸。

3.根据权利要求2所述的核酸，其特征在于，核苷酸序列为SEQ ID NO:5-6。

4.包括权利要求2-3任一项所述的核酸的载体。

5.根据权利要求4所述的载体，其特征在于，所述的载体为pET22b。

6.包括权利要求4-5任一项所述的载体的基因工程细胞。

7.根据权利要求6所述的基因工程细胞，其特征在于，为BL21-CodonPlus-RIL。

8.包括权利要求1所述的褐藻酸裂解酶突变体的酶制剂。

9.根据权利要求8所述的酶制剂，其特征在于，为液体酶、粉状酶、试剂酶、固定化酶中的一种或多种。

10.权利要求2-3任一项所述的核酸和/或权利要求4-5任一项所述的载体和/或权利要求6-7任一项所述的基因工程细胞在制备褐藻酸裂解酶中的应用。

11.权利要求1所述的褐藻酸裂解酶突变体和/或权利要求2-3任一项所述的核酸和/或权利要求4-5任一项所述的载体和/或权利要求6-7任一项所述的基因工程细胞和/或权利要求8-9任一项所述的酶制剂在制备褐藻酸寡糖中的应用。

12.权利要求1所述的褐藻酸裂解酶突变体和/或权利要求2-3任一项所述的核酸和/或权利要求4-5任一项所述的载体和/或权利要求6-7任一项所述的基因工程细胞和/或权利要求8-9任一项所述的酶制剂在制备包含褐藻酸寡糖的产品中的应用，其特征在于，所述的包含褐藻酸寡糖的产品为：药物、食品、饲料中的一种或多种。

13.根据权利要求12所述的应用，其特征在于，所述的药物为心血管药物、降脂药、降糖药、降压药、抗栓药、抗病毒药物、抗尿路结石药物中的一种或多种。

14.一种褐藻酸寡糖的制备方法，其特征在于，通过权利要求1所述的褐藻酸裂解酶突变体和/或权利要求2-3任一项所述的核酸和/或权利要求4-5任一项所述的载体和/或权利要求6-7任一项所述的基因工程细胞和/或权利要求8-9任一项所述的酶制剂进行制备。

15.根据权利要求14所述的应用，其特征在于，包括使用权利要求1所述的褐藻酸裂解酶突变体对褐藻酸进行酶解。

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