CN114457062B

CN114457062B - 用于制备褐藻寡糖的褐藻胶裂解酶及其用途

Info

Publication number: CN114457062B
Application number: CN202210199877.2A
Authority: CN
Inventors: 刘晓勇; 沐万孟; 张文立; 徐炜; 王鑫绣; 王伶秀
Original assignee: Shandong Haizhibao Seafood Co ltd
Current assignee: Shandong Haizhibao Seafood Co ltd
Priority date: 2022-03-02
Filing date: 2022-03-02
Publication date: 2024-03-26
Anticipated expiration: 2042-03-02
Also published as: CN114457062A

Abstract

本发明通过筛选来源于爱媛类芽孢杆菌(Paenibacillus ehimensis)中的酶基因，经重组获得一种具有褐藻胶裂解的酶活力的蛋白质，由此，本发明提供了由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的蛋白质用作褐藻胶裂解酶的用途及其应用。本发明人发现，该褐藻胶裂解酶相比现有技术具有更高的酶活力、良好的耐热性和优异的产糖性能，能够在短时间内降解大量海藻酸钠，并且生产成本低，所用设备少，具备工业规模化生产的潜力。

Description

用于制备褐藻寡糖的褐藻胶裂解酶及其用途

技术领域

本发明涉及生物酶领域，具体地涉及一种用于酶解褐藻酸盐以制备褐藻寡糖的褐藻胶裂解酶。

背景技术

海藻酸钠，又名褐藻酸钠，最初自褐藻类生物生成的褐藻胶中提取，在工业中通常由β-D-甘露糖醛酸(β-D-mannuronic acid，M)和α-L-古罗糖醛酸(α-L-guluronic acid，G)通过1,4-糖苷键聚合而成的一种聚合物。在食品工业中具有增稠、凝胶、稳定体系等多种用途。褐藻寡糖(AOS,Alginate Oligosaccharides)是一种聚合度在2-10的分子，由褐藻胶分解而成，具有调节人体免疫、抗氧化、抗肿瘤、保护神经系统、促进植物生长、抑菌等多种功能。AOS因具有特殊的化学特性和生物特性，在农业、食品、药品、保健品、化妆品、冶金、化工等领域具有潜在、广泛的应用价值。目前，褐藻胶的分解方法包括化学分解法、物理分解法和生物酶法，其中由于通过褐藻胶裂解酶的生物酶法的反应副产物少、耗能低且能生成含有不饱和双键的高生物活性寡糖，具有环保、清洁、条件温和、效率高等优点，其取代物理化学法称为制备AOS的主流方法已是必然。

迄今为止，尽管国内外学者对褐藻胶裂解酶的来源、分类、酶学性质、酶的结构、酶催化机理等方面作了大量的基础研究，但现有技术的褐藻胶裂解酶仍存在发酵水平低、酶活力不高、价格昂贵、且不适合大规模使用等问题。国际市场上只有美国Sigma公司商业化的褐藻胶裂解酶产品A1603-100MG，酶活力大于10000U/g，但价格昂贵，仅以试剂形式出售。

因此，本领域仍需要一种酶活力高且成本低廉的褐藻胶裂解酶。

发明内容

本发明的目的在于提供一种酶活力高、耐热性好且具有改善的产糖能力的褐藻胶裂解酶以及应用。本发明的褐藻胶裂解酶制备方法简单、使用设备少，具有工业规模化生产的潜力。

本发明的发明人在NCBI库中筛选出一种源于爱媛类芽孢杆菌(Paenibacillusehimensis)的蛋白(蛋白序列登录号为WP_127487869.1)，合成该蛋白并经试验发现该蛋白质具有优异的褐藻胶降解活性。由此，完成本发明。

在第一方面，本发明提供了具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的蛋白质用作褐藻胶裂解酶的用途。

在第二方面，本发明提供了一种由褐藻酸盐酶解制备褐藻寡糖的方法，包括以下步骤：使包含作为褐藻胶裂解酶的具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的蛋白质和褐藻酸盐的反应体系在45℃至65℃的温度反应。

综上，本发明提供一种褐藻胶裂解酶及其用于生产褐藻寡糖的用途，相比现有技术，本发明的褐藻胶裂解酶具有更高的酶活力、良好的耐热性和优异的产糖性能，能够在短时间内降解大量海藻酸钠，并且生产成本低，所用设备少，具备工业规模化生产的潜力。

附图说明

得益于以下具体实施方式以及参考附图，本发明的技术方案和益处对本领域技术人员会变得显而易见。

图1示出了根据本发明的一个实施方案得到的经纯化的褐藻胶裂解酶的电泳图，其中，M：Marker；1-5泳道：诱导时间分别为0、4、8、16、24h的发酵上清；6泳道：纯化前粗酶液；7泳道：纯化后得到的paeh酶液。

图2示出了根据本发明的一个实施方案得到的褐藻胶裂解酶在45℃温度随时间的相对酶活变化。

图3示出了根据本发明的一个实施方案得到的褐藻胶裂解酶分别在50℃和55℃温度随时间的相对酶活变化。

图4示出了根据本发明的一个实施方案得到的褐藻胶裂解酶随温度(20℃至85℃)的相对酶活变化。

图5示出了根据本发明的一个实施方案得到的褐藻胶裂解酶随pH(pH 5至pH10.5)的相对酶活变化。

图6示出了根据本发明的一个实施方案得到的褐藻胶裂解酶的裂解产物的质谱图。

具体实施方式

下面对本发明进行详细的描述。需理解，以下描述仅以示例方式来对本发明进行说明，无意于对本发明的范围进行限制，本发明的保护范围以随附权利要求为准。并且，本领域技术人员理解，在不背离本发明的精神和主旨的情况下，可以对本发明技术方案进行修改。

如背景技术部分所描述，现有的褐藻胶裂解酶存在各种各样的问题，例如发酵水平低、酶活力不高，并且现有的商用褐藻胶裂解酶的价格昂贵。针对上述问题，本发明的目的在于提供一种高酶活力、高产糖量、且成本低廉的褐藻胶裂解酶及其应用。

如前所述，本发明的发明人在NCBI库中筛选出一种源于爱媛类芽孢杆菌(Paenibacillus ehimensis)的蛋白(SEQ ID NO：1)(蛋白序列登录号为WP_127487869.1)，合成该蛋白并经试验发现该蛋白具有优异的褐藻胶降解活性，是目前已发现的PL31家族的第二例褐藻胶降解酶。

在一个具体的实施方案中，所述蛋白质由SEQ ID NO:2所示的核酸序列编码。

在一个具体的实施方案中，所述蛋白质是通过重组表达获得的，例如在大肠杆菌表达载体pET-22b(+)中进行重组表达，但不限于此。所述重组表达是通过本领域技术人员熟知的方式进行，例如可以通过以下步骤进行：

(1)重组质粒构建：合成例如SEQ ID NO：2所示的基因序列，在合成过程中可以将亲和标签(例如6个组氨酸标签)添加到目的基因片段的C末端，以配合后续对蛋白质的的分离纯化，例如Ni²⁺亲和层析分离纯化，并且该片段中含有Nde I和Xho I酶切位点的编码序列；将该片段中插入经Nde I和Xho I酶切过的大肠杆菌表达载体pET-22b(+)中，获得重组质粒。上述方法可以通过本领域熟知的方法进行，并不限于此。

(2)工程菌构建：将所述重组质粒转入诸如大肠杆菌BL21(DE3)的感受态细胞中，得到重组工程菌，这可以通过本领域技术人员熟知的方式，例如热激转化法，但不限于此。

(3)表达诱导：从重组工程菌中挑取单菌落在培养基中进行培养，并通过添加表达诱导剂如异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(IPTG)来诱导该重组工程菌来表达目标蛋白；本领域技术人员可以根据实际需要选择合适的培养基、添加剂和合适的培养温度，这里并无特别限制。

(4)蛋白纯化：本领域技术人员可以根据实际需要选择合适的纯化步骤，这里并无特别限制。

在又一个具体的实施方案中，所述蛋白质可以为存在于重组细菌的全细胞培养液中的形式。换句话说，该蛋白质在经由重组细菌如大肠杆菌进行重组表达之后，可以直接用于进行酶解反应，而无需经由步骤(4)的蛋白纯化。即，可以直接使用包括蛋白质和重组细菌的全细胞培养液与褐藻酸盐反应。

在一个进一步具体的实施方案中，所述蛋白质作为褐藻胶裂解酶的酶活力为120U/mg至130U/mg，例如125.7U/mg。在本发明中，一单位“酶活力”定义为在55℃的温度和pH7.5下，每分钟释放1μmol还原糖所需的酶量，其中还原糖的含量通过DNS(二硝基水杨酸)比色法测得。

本发明的褐藻胶裂解酶的酶活力高且为胞外酶。

在一个具体的实施方案中，所述反应在50℃至60℃的温度下进行。

在一个更优选的实施方案中，所述反应在45℃至55℃的温度下进行。本发明人发现，根据本发明的重组酶在45℃时兼具酶活力和持久性，而在55℃时具有更快的反应速度。可以根据需求选择在合适的温度条件下进行褐藻寡糖的制备。例如，当需要较快的反应速度时，则可以选择较高的反应温度，例如55℃、60℃。当需要持久的酶活力时，则可以选择较低的反应温度，例如45℃。

在一个具体的实施方案中，所述反应进行至少3小时。

在一个优选的实施方案中，所述反应进行至少5小时。

在一个进一步优选的实施方案中，所述反应进行6-8小时。反应时间的选择可以基于反应温度的选择，例如在45℃时，酶活力的持久性较好，可以选择较长的反应时间，又例如在55℃时，反应速度较快，但同时酶活力的下降也较快，则可以选择较短的反应时间。本领域技术人员可以根据对反应的监控进行合理的选择。

在一个具体的实施方案中，所述褐藻酸盐是褐藻酸钠、褐藻酸钾、褐藻酸钙等，优选为褐藻酸钠，其是海带加工用水中最常见的副产品。由于海带在漂洗的过程中经历了高温处理，这导致海带加工用水中含有以褐藻酸钠为主的大量有机物和无机营养盐(以磷盐和氮盐为主)。含有大量有机污染物及无机营养盐的海带加工用水如果得不到有效的处理，会对水域生态环境产生极大的危害，例如水体的富营养化等。

在一个进一步具体的实施方案中，所述褐藻酸盐来源于海带加工用水。

本发明人发现，本发明的褐藻胶裂解酶与褐藻酸盐发生反应时，反应体系的盐度对与褐藻胶裂解酶的酶活力的影响不大。因此，对于海带加工用水中的褐藻酸盐的处理，可以先通过例如钙离子沉淀法等本领域熟知的方法回收水体中的褐藻酸盐，然后与褐藻胶裂解酶发生反应，也可以直接在海带加工用水中加入本发明的褐藻胶裂解酶，省略回收的步骤。通过本发明的褐藻胶裂解酶将褐藻酸盐制备成极具经济效益的褐藻寡糖，能够极大的降低海带加工用水的处理成本。事实上，如褐藻酸盐这类有机物的回收，能够部分地抵消整个海带加工用水的处理过程的成本，使得这类废水的处理具有成本效益。

在又一个具体的实施方案中，所述褐藻胶裂解酶在反应体系中的浓度为3μg/mL至5μg/mL。

在一个优选的实施方案中，所述褐藻胶裂解酶在反应体系中的浓度为4μg/mL。

在又一个具体的实施方案中，所述褐藻酸盐在反应体系中的浓度以重量计为0.3％至0.4％。

在又一个优选的实施方案中，所述褐藻酸盐在反应体系中的浓度以重量计为0.35％。

在又一个具体的实施方案中，所述反应体系被调节至pH为7至9。在又一个优选的实施方案中，所述反应体系被调节至7至8。在又一个更优选的实施方案中，所述反应体系被调节至7.5。pH值的调节可以采用本领域熟知的方式进行，例如使用Tris-HCl缓冲液，但不限于此。

在又一个具体的实施方案中，所述蛋白质由SEQ ID NO:2所示的核酸序列编码。

在一个进一步具体的实施方案中，所述蛋白质通过重组表达获得的。重组表达的方式可以采用本领域技术人员熟知的方式，本发明并无特别的限定。

在又一个进一步具体的实施方案中，所述蛋白质可以为存在于重组细菌的全细胞培养液中的形式。换句话说，该蛋白质在经由重组细菌如大肠杆菌进行重组表达之后，可以直接用于进行酶解反应，而无需经由步骤(4)的纯化。即，可以直接使用包括蛋白质和重组细菌的全细胞培养液与褐藻酸盐反应。

在一个进一步具体的实施方案中，所述蛋白质作为褐藻胶裂解酶的酶活力为120U/mg至130U/mg，例如为125.7U/mg。本发明的褐藻胶裂解酶酶活力高且为胞外酶，能够在短时间内降解大量海藻酸盐。

在一个进一步具体的实施方案中，通过所述方法能够获得聚合度为2-4的褐藻寡糖。

综上可知，本发明的褐藻胶裂解酶具有更高的酶活力和良好的耐热性。当其用于生产褐藻寡糖时，相比现有技术，表现出优异的产糖性能，能够在短时间内降解大量海藻酸钠，并且生产成本低，所用设备少，具备工业规模化生产的潜力。

下文中，结合示例性的实施方案会更详细地描述本发明。然而，本文公开的示例性的实施方案仅出于示例的目的，而不应该被认为旨在解释本发明的范围。

实施例

下面参照附图，通过具体实施例来对本发明进行更为详细的描述。应理解，除非特别说明，否则本发明采用的试剂、方法和设备均为本技术领域常规的试剂、方法和设备。除非特别说明，否则以下实施例所用试剂和材料均为市购。未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或制造厂商所建议条件实施。

实施例1：蛋白重组表达和纯化

(1)筛酶：在NCBI库中筛选出来源于Paenibacillus ehimensis的目的蛋白(蛋白序列登录号为WP_127487869.1)。

(2)质粒构建：合成编码步骤(1)的目的蛋白的基因片段，并在合成过程中将6个组氨酸标签添加到目的基因片段的C末端，以配合后续重组酶的Ni²⁺亲和层析分离纯化步骤。该基因片段还含有Nde I和Xho I酶切位点，用于实现重组质粒的构建。将该基因片段插入经Nde I和Xho I酶切过的大肠杆菌表达载体pET-22b(+)中，直接获得重组质粒。

(3)工程菌构建：采用热激转化法，将合成的重组质粒转入E.coli BL21(DE3)感受态细胞，得到相应的重组工程菌。

(4)表达诱导：挑取单菌落接种于4mL LB培养基，于37℃、200r/min培养过夜；以2％接种量转接至200mL LB培养基中，并于37℃、200r/min培养大约2至2.5小时，培养基中氨苄青霉素(Amp)浓度为1％。培养至OD600到0.6至0.8后，添加1％异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，在18℃、200r/min下诱导表达24h。

(5)蛋白纯化：将诱导菌液6000rpm离心，取上清，通过0.45μm水系膜去除杂质，连接蛋白纯化系统中恒流泵、Ni²⁺亲和层析柱、紫外检测器等装置之间的管路，设置恒流泵的流速为1mL/min，用去离子水进行检漏。蛋白纯化系统准备就绪后，先用两个柱体积的结合缓冲液(50mM Tris，500mM NaCl，pH 7.5)平衡Ni²⁺亲和层析柱，再以0.5mL/min流速将粗蛋白液泵入层析柱。待粗蛋白液全部进入层析柱后，继续用结合缓冲液洗去未吸附的蛋白和其他杂质。待检测器读数稳定后，泵入洗涤缓冲液(50mM咪唑，50mM Tris、500mM NaCl，pH7.5)洗去结合能力较弱的杂蛋白。待检测器读数再次稳定后，泵入洗脱缓冲液(500mM咪唑，50mM Tris，500mM NaCl，pH 7.5)将吸附的重组蛋白洗脱下来，并根据紫外检测器的信号值收集流出液，即为目标重组蛋白。将上述得到的目标重组蛋白溶液转移至截留分子量为10kDa的透析袋中，用透析夹夹紧后放入透析液1(10mM EDTA·2Na，50mM Tris，pH 7.5)中，置于4℃的层析柜，透析18h，每6h更换一次新鲜的透析液，以除去目标重组蛋白溶液中的咪唑以及其他金属离子。再将透析袋转移至透析液2(50mM Tris，pH 7.5)中，同样透析18h，每6h更换一次新鲜的透析液。透析结束后，收集目标重组蛋白液至管中，于4℃冰箱保存，备用。

对上述制备得到的纯化的目标重组蛋白进行分析，图1示出了经纯化的目标重组蛋白的电泳图。由图1可知，本发明的实施例1得到的目标重组蛋白的分子量的预测值约为36.167KDa，是一种胞外蛋白。

实施例2：重组蛋白作为褐藻胶裂解酶的作用验证和比较

本发明人还以实施例1所示的类似方法合成其他蛋白。这些蛋白与已鉴定为褐藻胶裂解酶蛋白的序列具有50％-70％的相似性(即，可能具有褐藻胶裂解活性的蛋白)。在此基础上，本发明人通过下述方法对所获得的重组蛋白是否具有褐藻胶裂解酶作用进行了验证：

挑取单菌落接种于LB培养基，培养基中氨苄青霉素(Amp)浓度为100μg/mL，37℃、200r/min培养，培养至OD₆₀₀约0.6-0.8后，添加终浓度1mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，在28℃、200r/min下诱导表达12h，培育获得重组蛋白。向全细胞液中加入1％的海藻酸钠溶液，共同于45℃水浴反应15min，以煮沸菌液为空白对照，利用DNS法吸光度测定相对酶活。

表1：重组蛋白作为褐藻胶裂解酶的酶活力(U/mg)

由表1可知，相比其他可能具有褐藻胶裂解活性的重组蛋白，源自于爱媛类芽孢杆菌(Paenibacillus ehimensis)的基因片段经重组表达获得的蛋白具有相对最高的酶活力，并因此表现出规模化生产和应用的潜力。

实施例3：本发明褐藻胶裂解酶的耐热性能测试

本实施例的酶解反应体系包括：终浓度0.35％的海藻酸钠，终浓度为50mM的NaCl，0.4μg/mL的实施例1制备的重组蛋白，终浓度50mM的Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)。酶解反应总体积为1mL。

将实施例1中得到的酶液稀释至浓度约28.6μg/mL后，分别在45℃、50℃和55℃的温度分别保温，分为额外加氯化钠(50mM，以模拟高盐度的海带加工用水)和不加氯化钠两组，并间隔定时取样进行裂解反应，以观察本发明的褐藻胶裂解酶在不同的温度下随时间的酶活变化，以未经处理的酶液为对照(即100％)，结果如图2和图3所示。由图2可知，在没有Na⁺离子存在下，本发明的褐藻胶裂解酶能够在45℃的温度下在44个小时内保持其酶活在50％以上，而在Na⁺离子的存在下，本发明的褐藻胶裂解酶能够在45℃的温度下在35个小时内保持其酶活在50％以上。图3给出的结果表明在55℃的温度下仍能够在5个小时内保持其酶活在50％以上，显示出优异的耐热性能。

实施例4：本发明褐藻胶裂解酶在不同温度下的产糖性能测试

本实施例采用DNS法测量了根据本发明的重组酶在20℃至85℃的温度范围中的相对酶活(以相对产糖量表示)随温度的变化曲线，结果如图4所示(以最高酶活为100％)。由图4可知，在50℃至60℃的温度范围中，重组酶的相对酶活高达90％以上，而在45℃和65℃的温度下，重组酶的相对酶活仍高于80％。结合实施例3中的结果，本发明人发现，在45℃的温度下，可以同时拥有80％的相对酶活力与长时间的工作寿命，由此确定了生产褐藻寡糖的最优温度。

实施例5：本发明褐藻胶裂解酶在不同pH下的产糖性能测试

本实施例采用DNS法测量了根据本发明的重组酶在pH 5-pH 10.5的范围中的相对酶活(以相对产糖量表示)的变化曲线，其中，分别采用了NaAc-HAc、HEPES-NaOH、Tris-HCl和甘氨酸-NaOH作为pH缓冲液，结果如图5所示(以最高酶活为100％)。由图5可知，在pH为7-9的范围内，本发明的重组酶的相对酶活能够维持在40％以上，而以pH 7.5的相对酶活最高。同时，也可以得出Tris-HCl是适用于本发明的优选pH缓冲液。

实施例6：褐藻寡糖的制备和表征

向1％海藻酸钠溶液(50mM Tris-HCl缓冲液，50mM NaCl,pH 7.5)加入4μg/mL酶，45℃反应3h便可获得0.82±0.06mg/mL的还原糖(以DNS法记)，反应接近完全平衡，反应液经0.22μm过膜后冻干，产物记为粗寡糖，转化率为92.4±2.7％。

选择相对酶活较高的55℃作为反应温度(由前可知，在该温度下尽管酶活的持续性一般，但反应速度更快)，使上述反应体系反应6小时，然后煮沸5分钟以终止反应。反应得到的酶解液与无水乙醇以2：3的比例混合以除去残余多糖，12000r/min离心5分钟后通过LC-MS检测产物组成，结果如图6所示。由图6可知，本发明的重组酶制备得到的褐藻寡糖的质谱主要表现出在351m/z、527m/z、703m/z附近的峰，分别对应于褐藻寡糖的二聚体、三聚体和四聚体。

序列表

<110> 山东海之宝海洋科技有限公司

<120> 用于制备褐藻寡糖的褐藻胶裂解酶及其用途

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 340

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Lys Lys Ser Trp Arg Ser Arg Leu Ser Cys Ile Ser Thr Val Leu

1 5 10 15

Thr Leu Gly Ser Val Leu Leu Ser Phe Pro Ala Ser Ser Met Ala Ala

20 25 30

Ser Val Thr Cys Ser Thr Ala Ala Cys Leu Lys Asn Ala Leu Ala Asn

35 40 45

Ala Ser Pro Gly Asp Val Ile Thr Leu Ala Ala Gly Val Thr Phe Asn

50 55 60

Gly Asn Phe Val Ala Ala Ala Asn Gly Ser Ser Thr Gly Lys Ile Thr

65 70 75 80

Leu Gln Ser Ala Ser Ala Ser Asn Lys Ala Glu Leu Asn Gly Gly Gly

85 90 95

Thr Gly Ser Gly Tyr Ala Leu His Val Thr Gly Asp His Trp Val Ile

100 105 110

Lys Asp Leu Lys Val Thr Asn Ala Lys Lys Gly Ile Met Leu Asp His

115 120 125

Ala Asn Tyr Thr Leu Ile Asp Gly Ala Glu Val Tyr Gln Ile Gly Glu

130 135 140

Glu Gly Val His Tyr Arg Asp Gly Ser Ser Tyr Asn Thr Ile Arg Asn

145 150 155 160

Ser Tyr Val His Asp Ile Gly Thr Val Asn Pro Gln Tyr Gly Glu Ala

165 170 175

Ile Tyr Val Gly Ser Asp Lys Gly Lys Trp Gly Thr Phe Asn Ala Ala

180 185 190

Thr Asn Tyr Asn Thr Ile Ala Asn Asn Thr Leu Gly Pro Asn Val Ala

195 200 205

Ala Glu His Ile Asp Ile Lys Glu Gly Ser Ala Gly Thr Leu Val Glu

210 215 220

Asn Asn Thr Phe Asp Gly Thr Gly Met Ser Gly Ala Asn Ala Ala Asp

225 230 235 240

Ser Phe Ile Asp Val Lys Gly Asn Asn Asp Val Ile Arg Asn Asn Thr

245 250 255

Gly Tyr Arg Asn Gly Asn Ser Ser Ile Lys Asp Ala Phe Gln Val His

260 265 270

Gln Arg Ala Ala Gly Trp Gly Gln Asn Ala Ser Phe Thr Asn Asn Thr

275 280 285

Val Tyr Leu Asp Asn Thr Thr Ala Tyr Val Val Asn Ala Ala Ser Gly

290 295 300

Thr Thr Ala Ser Ala Ser Gly Asn Thr Arg Tyr Pro Ala Gly Asn Met

305 310 315 320

Tyr Asn Gly Ser Val Thr Ser Gly Glu Lys Thr Glu Arg Pro Ser Ala

325 330 335

Ser Ser Ser His

340

<210> 2

<211> 1023

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgaaaaaaa gttggcgttc ccgtctttcc tgcatatcga ccgttttgac gcttggctcg 60

gtgctgctct cgtttcccgc ttcgtcgatg gccgcctccg tcacctgcag tacggctgct 120

tgcttgaaaa atgccctcgc taatgcgtcg ccgggagacg ttattacttt agcggcgggc 180

gtgacgttca acggcaactt cgtagctgcc gccaacggct cctcaaccgg caagattacg 240

ctgcaaagcg ccagcgcttc caacaaagcc gagctgaacg gcggcggtac ggggagcggc 300

tatgcgctgc acgtgacagg cgaccattgg gtaatcaagg atctgaaagt gacaaacgcc 360

aagaaaggaa tcatgctcga tcatgcgaat tacacgctga ttgacggggc cgaggtgtac 420

cagatcgggg aagagggcgt gcattaccgg gacggcagct cctataatac gatccgcaac 480

tcgtatgttc acgatatcgg caccgtaaac cctcagtacg gagaggcgat atacgtcggg 540

tccgacaaag gaaagtgggg cacctttaac gcggcgacga actataacac gattgcgaac 600

aacaccctgg ggccgaatgt tgctgccgag catatcgaca ttaaggaagg ctctgccggg 660

acgcttgtcg agaacaacac gttcgacgga accgggatga gcggcgccaa cgctgcggac 720

agcttcatcg atgtgaaagg gaataacgac gtgatccgca acaataccgg ctaccgcaac 780

ggcaacagca gcatcaagga tgcgtttcag gttcatcagc gggcggccgg ctggggacaa 840

aacgcctcgt tcacgaacaa tacggtctat ttggacaaca cgaccgccta tgtcgtgaac 900

gcggccagcg gtacgaccgc cagcgcctcc ggcaatacgc gttacccggc cggaaacatg 960

tacaacggca gcgtcacgag cggggaaaag acggaacgtc cgtctgcgtc aagctcccat 1020

taa 1023

Claims

1.氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的蛋白质用作褐藻胶裂解酶的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其中，所述蛋白质由SEQ ID NO:2所示的核酸序列编码。

3.根据权利要求1或2所述的用途，其中，所述蛋白质是通过重组表达获得的。

4.根据权利要求3所述的用途，其中，所述蛋白质为存在于重组细菌的全细胞培养液中的形式。

5.根据权利要求4所述的用途，其中，所述蛋白质为存在于大肠杆菌的全细胞培养液中的形式。

6.根据权利要求1或2所述的用途，其中，所述蛋白质作为褐藻胶裂解酶的酶活力为120U/mg至130 U/mg。

7.根据权利要求6所述的用途，其中，所述蛋白质作为褐藻胶裂解酶的酶活力为125.7U/mg。

8.一种由褐藻酸盐酶解制备褐藻寡糖的方法，包括以下步骤：使包含作为褐藻胶裂解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的蛋白质和褐藻酸盐的反应体系在45℃至65℃的温度反应至少3小时，其中，所述反应体系被调节至pH为7至9。

9.根据权利要求8所述的方法，其中，使所述反应体系在45℃至65℃的温度反应至少5小时。

10.根据权利要求9所述的方法，其中，使所述反应体系45℃至65℃的温度反应6-8小时。

11.根据权利要求8所述的方法，其中，使所述反应体系在50℃至60℃的温度反应至少3小时。

12.根据权利要求8所述的方法，其中，使所述反应体系在45℃至55℃的温度反应至少3小时。

13.根据权利要求8所述的方法，其中，所述褐藻胶裂解酶在反应体系中的浓度为3 μg/mL至5 μg/mL；并且其中，所述褐藻酸盐在反应体系中的浓度以重量计为0.3%至0.4%。

14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述褐藻胶裂解酶在反应体系中的浓度为4 μg/mL。

15.根据权利要求13所述的方法，其中，所述褐藻酸盐在反应体系中的浓度以重量计为0.35%。

16.根据权利要求8-15中任一项所述的方法，其中，所述反应体系被调节至pH为7至8。

17.根据权利要求16所述的方法，其中，所述反应体系被调节至pH为7.5。

18.根据权利要求8-15中任一项所述的方法，其中，采用Tris-HCl缓冲液来调节所述反应体系的pH。

19.根据权利要求8-15中任一项所述的方法，其中，所述蛋白质由SEQ ID NO:2所示的核酸序列编码。

20.根据权利要求19所述的方法，其中，所述蛋白质通过重组表达获得。

21.根据权利要求20所述的方法，其中，所述蛋白质为存在于重组细菌的全细胞培养液中的形式。

22.根据权利要求21所述的方法，其中，所述蛋白质为存在于大肠杆菌的全细胞培养液中的形式。

23.根据权利要求8-15中任一项所述的方法，其中，所述蛋白质作为褐藻胶裂解酶的酶活力为120 U/mg至130 U/mg。

24.根据权利要求23所述的方法，其中，所述蛋白质作为褐藻胶裂解酶的酶活力为125.7 U/mg。

25.根据权利要求8-15中任一项所述的方法，其中，所述褐藻酸盐是褐藻酸钠、褐藻酸钾和/或褐藻酸钙。

26.根据权利要求25所述的方法，其中，所述褐藻酸盐为褐藻酸钠。

27.根据权利要求25所述的方法，其中，所述褐藻酸盐来源于海带加工用水。

28.根据权利要求8-15中任一项所述的方法，其中，通过所述方法能够获得聚合度为2-4的褐藻寡糖。