CN111849949B

CN111849949B - 一种甘露糖醛酸c-5差向异构酶/海藻酸裂解酶编码基因及酶和制备与应用

Info

Publication number: CN111849949B
Application number: CN201910340709.9A
Authority: CN
Inventors: 尹恒; 孙明
Original assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Current assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Priority date: 2019-04-25
Filing date: 2019-04-25
Publication date: 2022-03-11
Anticipated expiration: 2039-04-25
Also published as: CN111849949A

Abstract

本发明公开了一种甘露糖醛酸C‑5差向异构酶/海藻酸裂解酶编码基因及酶和制备与应用，属于基因工程领域。具体公开了一种来源于门多萨假单胞菌Pseudomonas mendocina的具有将甘露糖醛酸C‑5差向异构和裂解褐藻胶两种功能的酶基因及其酶的制备方法与应用，即利用基因工程的技术方法，将该酶的基因克隆到大肠杆菌表达载体上，获得可异源表达该酶的大肠杆菌重组菌株，该菌株异源表达制备的酶，能高效的将β‑D‑甘露糖醛酸(M)转化为α‑L‑古罗糖醛酸(G)以及将褐藻胶裂解为低聚糖。本发明提供的双功能酶可广泛应用于农业、食品、饲料添加剂、医药等领域。

Description

一种甘露糖醛酸C-5差向异构酶/海藻酸裂解酶编码基因及酶和制备与应用

技术领域

本发明涉及一种甘露糖醛酸C-5差向异构酶/海藻酸裂解酶编码基因及酶和制备与应用，属于基因工程领域。

背景技术

褐藻是海洋中含量丰富的经济类海藻植物，它含有褐藻胶、褐藻糖胶及海带淀粉等多种多糖。其中褐藻胶含量相对较高，占藻体干重的20％-40％。在藻体中，褐藻胶主要以褐藻酸、碱金属盐类(钠盐、钾盐)和二价盐类(钙盐、镁盐)等形式存在。褐藻胶作为褐藻细胞壁的填充物质，为藻体提供硬度和韧性，该生理特性类似于陆生植物中的纤维素。

褐藻胶具有多糖所共有的特性，如保水性及可变的溶液粘度，但褐藻胶作为一种聚合电解质，比中性多糖更容易受离子强度和PH影响。可溶性、粘性、稳定性、离子结合、凝胶性等都是褐藻胶的重要属性。

褐藻多糖是由β-D-甘露糖醛酸(Mannuronate,M)和它的C-5差向异构体α-L-古罗糖醛酸(Guluronate,G)两种单体组成的线性聚合物。在褐藻多糖中M与G的存在形式有3种：聚甘露糖醛酸片段(Poly-mannuronate,PM)、聚古罗糖醛酸片段(Poly-guluronate,PG)和甘露糖醛酸-古罗糖醛酸混合嵌段(MG block)。如下结构式所示：

因为褐藻是大型多细胞真核生物，探索其细胞内生物合成途径相较于原核细胞更为困难一些。目前对于褐藻胶生物合成的认识主要来源于对铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)和棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)的研究。目前铜绿假单胞菌聚合、修饰与运输褐藻胶的模型已经推演出来了，根据模型，褐藻胶聚合酶是由多个亚基蛋白(推测的亚基为Alg8、Alg44、AlgX)组成的一个蛋白质复合物，它定位于细胞质膜上。褐藻胶聚合酶将细胞质中的GDP-甘露糖醛酸聚合成初态褐藻胶链，然后存在于周质的褐藻胶修饰酶对初态褐藻胶链进行加工，如差向异构酶(AlgG)将甘露糖醛酸异构为古罗糖醛酸。在棕色固氮菌中也发现了与上述基因同源或是功能相同的基因序列，比如与铜绿假单胞菌的AlgE相似的基因以及异构酶algE1-algE5。

目前海藻多糖及其低聚糖已经广泛的应用于食品、制药、化工等多个领域，获得低聚糖的方法目前主要有化学法、物理法以及生物酶法，其中化学法反应条件苛刻并且反应时间较长；物理法需要多种仪器以及方法联用，操作繁琐，而且产物很难达到要求；生物酶法较为简单，且酶来自于生物，对自然环境污染较小，具有反应条件温和反应高效等优势，成为目前的研究重点。具有广泛的应用前景褐藻多糖和寡糖分子中的M/G比决定其生物活性，如富含M的褐藻多糖和寡糖具有抗肿瘤、免疫调节等作用，而富含G的褐藻多糖具有抗艾滋病等重要应用价值。对于M/G比例为0.5-0.7的海藻酸盐市场需求量大，但是大多数的藻酸盐M/G比值为1.2-1.6，M/G比值为0.4的藻酸盐仅存在于海带中(Laminaria hyperborea和Lessonia trabeculata)。

目前尚无大量工业生产α-L-古罗糖醛酸含量较高的海藻酸钠的报道，其生产尚停留在实验室研究期间，获得α-L-古罗糖醛酸含量较高的海藻酸钠的方法主要有以下几种：(1)从天然海带中(Laminaria hyperborea和Lessonia trabeculata)提取，但提取工艺复杂，且产率极低；(2)通过人工化学合成的方法获得，但此法步骤繁琐，成本太高；(3)利用酸分离海藻酸钠的方法获得，但这样生产过程中高温容易导致聚合物解聚，低温时又难以将催化剂去除；(4)利用物理方法差向异构得到，但此方法要利用现代化的生产设备，实验设备要求太高，不利于大量生产；(5)利用酶差向海藻酸钠获得，酶的反应效率高，方法简单、易控制，后期分离也容易，且酶作为一种生物制剂，不会带来化学试剂产生的不利因素。所以利用酶差向异构海藻酸钠的方法生产α-L-古罗糖醛酸含量较高的海藻酸钠是一条相对简单，容易研究的生产方法。

甘露糖醛酸C-5差向异构酶(Mannuronan C-5epimerase)是一种可以将β-D-甘露糖醛酸(Mannuronate,M)转化为它的C-5差向异构体α-L-古罗糖醛酸(Guluronate,G)的酶，一般来源于海藻、假单胞菌属以及棕色固氮菌属。经研究发现，P.aeruginosa的基因组中仅含有一个甘露糖醛酸C-5差向异构酶基因，其编码的甘露糖醛酸C-5差向异构酶位于周质，在不依赖Ca²⁺的情况下即可发生作用，将甘露糖醛酸转变为古罗糖醛酸。最近的研究表明P.aeruginosa甘露糖醛酸C-5差向异构酶除了C-5差向异构作用外，还具有保护褐藻胶不被褐藻胶裂解酶降解的作用。Sumita等的研究中，非极性敲除P.aeruginosa的AlgG基因后，该基因不仅失去了甘露糖醛酸C-5差向异构作用，仅产生聚甘露糖醛酸，同时不再产生大分子的褐藻胶片段，而是分泌被降解的小片段褐藻胶。

在A.vinlandii中，除了AlgG外，染色体上还存在一个甘露糖醛酸差向异构酶的基因家族(gene family),目前发现了7个编码框，每个编码框都由两种不同的模块，A和R组成。其中A模块主要起到催化作用，R模块主要负责与底物的结合，单独的R模块不具有差向异构化的活性。编码的蛋白质分别对甘露糖醛酸嵌段具有不同的修饰作用，例如AlgE4可以产生交替结构的海藻酸，AlgE6可以形成较长的G嵌段，而AlgE7同时具有差向异构和裂解两种活性；但是该家族的酶发挥作用时依赖于Ca²⁺的存在，因为该基因家族中含有许多带有负电荷的氨基酸，需要Ca²⁺作为阳离子稳定蛋白的结构。

海藻酸钠具有因M/G比例不同而具有广泛的应用，但是天然海藻酸钠分子量较大，溶解性差，因此对海藻酸钠的降解一度成为研究的热点。研究中发现海藻酸裂解酶，作为一种反应条件温和、效率高的生物酶引起了大家的重视，但是在裂解的过程中，M/G的比例会不受控制的发生变化，因此寻找特定比例或者序列排布的海藻酸钠寡糖成为一大难题。本研究的酶PmC5A同时具有差向异构和裂解两种功能，同AlgE7相比，它的活性不依赖于Ca²⁺的存在。PmC5A作为异构酶可以将G含量提高至47％左右，并且差向异构酶引入的G同时刺激了裂解酶的酶活性，其只断裂特定结构的糖苷键，因此保证了M/G比例在一定范围内变化，从而很大程度上解决了目前面临的难题。目前还没有关于来自假单胞菌属的甘露糖醛酸C-5差向异构酶具有此两种功能特性的报道。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种来源于门多萨假单胞菌(Pseudomonasmendocina)的双功能酶PmC5A及其编码基因，其可以在保持M/G比例在可控的范围内对海藻酸钠进行降解。

本发明的第二个目的是提供含有所述的双功能酶PmC5A基因重组表达质粒和重组基因工程菌株。

本发明的第三个目的是提供一种制备新型双功能酶PmC5A的方法。

本发明的第四个目的是提供一种双功能酶PmC5A在断裂褐藻胶的糖苷键和/或差向甘露糖醛酸C-5键中的应用。

本发明所提供的甘露糖醛酸C-5差向异构酶/海藻酸裂解酶双功能酶PmC5A，来源于海胆肠胃中分离纯化的门多萨假单胞菌Pseudomonas mendocina，从中扩增出的甘露糖醛酸C-5差向异构酶/海藻酸裂解酶双功能酶PmC5A编码基因(命名为PmC5A)，具有下述核苷酸序列特征中的一种或几种：

1)具有SEQ ID NO.1的脱氧核糖核酸(DNA)序列；

2)编码序列表中SEQ ID NO.2氨基酸序列的脱氧核糖核酸(DNA)序列；

3)对SEQ ID NO.1的脱氧核糖核酸(DNA)序列进行一个、两个或两个以上核苷酸取代和/或缺失和/或添加而得到的编码具有甘露糖醛酸C-5差向异构酶/海藻酸裂解酶双功能酶活性的核苷酸序列；

4)与SEQ ID NO.1限定的脱氧核糖核酸(DNA)序列的同源性达到80％及以上，且能编码差向甘露糖醛酸以及断裂褐藻胶的编码蛋白质的脱氧核糖核酸(DNA)序列。

本发明还提供了甘露糖醛酸C-5差向异构酶/海藻酸裂解酶双功能酶PmC5A的氨基酸序列，具有如下特征中的一种或几种：

1)具有SEQ ID NO.2的氨基酸序列；

2)具有如SEQ ID NO.2从氨基端开始的第1-475位氨基酸残基序列，其中1-475位为具有双功能酶PmC5A活性的氨基酸序列；

3)对SEQ ID NO.2所示的氨基端序列进行一个、两个或两个以上氨基酸取代和/或缺失和/或添加而形成具有甘露糖醛酸C-5差向异构酶/海藻酸裂解酶双功能酶活性氨基酸序列。

本发明提供了一种含有甘露糖醛酸C-5差向异构酶/海藻酸裂解酶双功能酶基因的重组表达质粒。

本发明提供了一种含有甘露糖醛酸C-5差向异构酶/海藻酸裂解酶双功能酶基因的重组基因工程菌株。

本发明的双功能酶PmC5A的氨基酸序列及其核苷酸编码序列也可以根据预测的双功能酶PmC5A的氨基酸序列及其核苷酸编码序列人工合成获得。

制备重组酶PmC5A的方法，是将甘露糖醛酸C-5差向异构酶/海藻酸裂解酶双功能酶基因克隆入重组表达载体，将重组表达载体导入宿主细胞，获得重组表达的甘露糖醛酸C-5差向异构酶/海藻酸裂解酶双功能酶。

上述双功能酶基因，其核苷酸序列具有如下特征中的一种或几种：1)具有序列表中SEQ ID NO.1的脱氧核糖核酸(DNA)序列；

2)编码SEQ ID NO.2氨基酸序列的脱氧核糖核酸(DNA)序列；

3)对序列表中SEQ ID NO.1的脱氧核糖核酸(DNA)序列进行一个、两个或两个以上核苷酸取代和/或缺失和/或添加而得到的编码具有甘露糖醛酸C-5差向异构酶/海藻酸裂解酶双功能酶活性的核苷酸序列；

所述的重组表达双功能酶PmC5A的重组表达载体是大肠杆菌表达载体、酵母表达载体、枯草杆菌表达载体、乳酸菌表达载体、链霉菌表达载体、噬菌体载体、丝状真菌表达载体、植物表达载体、昆虫表达载体、或哺乳动物细胞表达载体中的一种或几种。

用于重组表达双功能酶PmC5A的宿主细胞，是大肠杆菌宿主细胞、酵母菌宿主细胞、枯草杆菌宿主细胞、乳酸菌宿主细胞、放线菌宿主细胞、丝状真菌宿主细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。

本发明的双功能酶PmC5A的基因序列是通过PCR技术从门多萨假单胞菌中克隆得到。该基因编码区长1428bp，包含多个结构域，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。PmC5A编码467个氨基酸和一个终止密码子，其氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示，蛋白质理论分子量为52.39kDa，预测等电点为5.61。

本发明提供的甘露糖醛酸C-5差向异构酶/海藻酸裂解酶双功能酶在断裂褐藻胶和差向甘露糖醛酸中的应用。

进一步地，上述应用具体在断裂褐藻胶的糖苷键，获得单糖或褐藻胶寡糖中的应用；

进一步地，上述应用具体在差向甘露糖醛酸C-5键，获得不同结构的褐藻胶中的应用。

本发明从大肠杆菌重组表达获得的双功能酶，可以在保持M/G比例不发生变化的情况下对褐藻胶进行降解，以海藻酸钠为底物时，在30℃、pH9.0的条件下具有较好活性，从而在农业、食品、饲料、医药等领域更具有应用价值。。

附图说明

图1：双功能酶基因PmC5A琼脂糖凝胶电泳检测。泳道1：核酸标准；泳道2-3：PmC5A扩增产物。

图2：双功能酶PmC5A表达及纯化的SDS-PAGE图。各泳道加入的样品分别是：泳道1-蛋白分子量标准，泳道2-PmC5A未加诱导剂，泳道3-PmC5A粗酶液，泳道4-PmC5A流穿液，泳道5-60mM咪唑洗脱流穿液。

图3：双功能酶PmC5A裂解酶的相关酶学性质。

图4：双功能酶PmC5A对海藻多糖作用产物的¹H NMR图谱。

具体实施方式

下述非限定性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例1双功能酶全长基因克隆

参照基因组DNA纯化试剂盒(Thermo，LOT 00105781)操作步骤提取门多萨假单胞菌的基因组DNA。对The National Center for Biotechnology Information(NCBI)数据库中双功能酶基因序列进行多序列比对分析后，设计简并引物PmC5A-F:5’-ATACATATGAACCCGMHGSARSACCAGTTC-3’；PmC5A-R:5’-TATCTCGAGRTTGGTCAKYKKCTCGG-3’，以提取的门多萨假单胞菌的基因组DNA为模板，扩增编码双功能酶成熟蛋白的基因序列(不包括信号肽基因)。PCR反应条件为：98℃2min，1个循环；98℃10s，62℃30s，72℃2min，30个循环；72℃5min，1个循环。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析后(见图1)，对目的基因进行切胶回收，经双酶切的方法连接到原核表达载体pET21a上后测序。

实施例2双功能酶基因序列分析

测序结果采用GenBank数据库中的Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)分析，DNAMAN软件进行多序列比对，Vector NTI分析序列信息。

获得的褐藻胶裂解酶基因(命名为PmC5A)编码区长1428bp，其核苷酸序列如SEQID NO 1所示。PmC5A编码467个氨基酸和一个终止密码子，其氨基酸序列如SEQID NO 2所示，蛋白质理论分子量为52.39kDa，预测等电点为5.61。

实施例3 PmC5A基因在大肠杆菌中的重组表达及纯化

为了便于基因的重组表达，在设计的上下游引物中分别引入NdeI和XhoI酶切位点。将PCR清洁产物PmC5A和表达载体pET21a分别用NdeI和XhoI进行双酶切，酶切产物经清洁回收后，用T₄DNA连接酶连接(连接体系：(5μLT₄DNA Ligase 0.5μL，10×T₄DNA LigaseBuffer 0.5μL，pET21a 2μL，PCR产物2μL)，连接条件：室温过夜连接。)。取5μL连接产物转化E.coli TOP10感受态细胞，涂布在含100μg/mL氨苄青霉素的固体Luria-Bertani培养基上，37℃培养12-16h。挑取单克隆，使用简并引物进行菌落PCR验证，将扩增正确的单克隆接入含有100μg/mL氨苄青霉素的液体Luria-Bertani培养基中培养，提取质粒；使用内切酶NdeI和XhoI对提取的质粒进行双酶切，结果正确的重组质粒送华大基因测序。测序结果表明，在pET21a的NdeI和XhoI酶切位点之间插入了SEQ ID NO 1所示的PmC5A基因，且插入方向正确，证明重组质粒构建成功，将该重组质粒命名为pET21a-PmC5A。

将pET21a-PmC5A转化E.coli BL21(DE3)，对其进行诱导表达及纯化。用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测双功能酶PmC5A的表达及纯化情况，结果如图2所示，纯化后的双功能酶PmC5A在电泳胶上呈单一条带，且位置与预测的分子量相吻合。

实施例4双功能酶PmC5A的裂解酶活性测定

以1000μL 0.5％(w/v)的褐藻胶为底物，加入500μL重组酶PmC5A，反应30min，采用3,5-二硝基水杨酸(DNS)法测定其活性。酶活力单位定义为:每分钟释放1μmol还原糖(以甘露糖计)所需的酶量为一个酶活力单位(U)。蛋白浓度使用碧云天BCA蛋白浓度测定试剂盒进行测定。

如图3所示，在最适温度和最适pH条件下，按标准方法测得PmC5A作为裂解酶的比活为60U/mg；并探究了金属离子对该双功能酶裂解活性的影响。

实施例5重组酶PmC5A双功能酶活性测定

将0.5％(w/v)海藻多糖与重组酶PmC5A按2:1(体积比)的比例混合后，在30℃条件下反应2h，通过高分辨核磁共振(NMR)对其产物进行分析。如图4所示，PmC5A作为差向异构酶可以引入G残基，同时该G残基的引入更加有利于裂解酶对底物的降解。对NMR谱图进行深入分析，发现PmC5A在最初反应过程中提高了底物的G含量从32％提高至47％，随后尽管裂解反应一直进行，但是该G含量稳定在一定范围。对端基结构进行进一步解析，可以发现G作为主要的还原端，并且产生的双键结构的糖环主要临近M，可知裂解酶只断裂特定结构的糖苷键。因此，PmC5A可用于海藻酸低聚糖的制备以及与海藻酸改性相关方面的研究，包括农业、食品、饲料添加、医药及海藻酸低聚糖制备等领域。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院大连化学物理研究所

<120> 一种甘露糖醛酸C-5差向异构酶/海藻酸裂解酶编码基因及酶和制备与应用

<130> 2019

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1404

<212> DNA

<213> 核苷酸序列

<400> 1

atggaagcgc ccaagctgcc ggacctgtcc ggctacacca aggaggccgt gctggccaag 60

attccgcgtg acaaacgcgg caaggtagtg gtgcggcgca tgctgcgcca ggacgcgctg 120

aaggacttca ccggcggcaa cgaacgcctg cgcgaatgga tcaagcgcca gcagggcatg 180

ccccaggcga tcttcatcga aggtggcctg gtcaccgccc aggatctggc caaggcgctg 240

cccgacagcc agttcgccga acaggaacct ggcgtgtacc tcgctcgcct gcccatcgtc 300

gtcgccgagg gcgccgcgct gcatgtcggc aaggaaaccc gcgaactgcg cctgtcgcag 360

gagcgcggtt cgttcctggt caacgacggc ctgatgttcc tcaccgacac ccgcgtcacc 420

gcctggcgcg aggccgacaa cggcccggcg accatgcgcg acaacggcaa ggaattccgc 480

ccgttcctgg tctcctgggg cggcagcgag ctgtatatcg cgggcagcgt gatcaccagc 540

ctgggctacg acaactccaa gtcctacggg gtgtcgatca cccagtacac gccgaacatg 600

cacgaacgcc tcaagcgcga cgagccgacc ggctggctga tcgactccga gttcgtcgac 660

cactggtacg gtttctactg ctacgaagcg cagaacgtgg tgatcaaggg caacacctac 720

cgcgacaaca tcgtctacgg catcgacccg cacgaccgct cccacggcct gatcatcgcc 780

gagaacaccg tgttcggcac caagaagaag cacggcatca tcatctcgcg cgaggtcaac 840

gacagctgga tcatcaacaa cgagagctac gacaacaagc tctccggcgt ggtcatcgac 900

cgtaacagcg aacgcaacct aatcgcctac aaccgcgtgc acggcaatca ctccgacggc 960

atcaccctgt acgagagcgg cgacaacctg ctgtggggca accatgtact gggcaaccag 1020

cgccacggca ttcgcatccg cagcagcgag aacattcgcc tctacgacaa cgtctcggcg 1080

atgaaccagc tcaccggtgt gtacggccac atcaaggacc tgtccgacac cgaccgcgac 1140

ctggacctcg acccgttcga taccaagatc tcgatgatca tcgtcggcgg caccctggcc 1200

ggcaacggct ccagcccgat caacatcgac tcgccgctgt cggtcgagct gtaccgcgtg 1260

aagatgctcg cgccgcgcaa gagcagcggc atccagctcg ccggcatcct cggcgagaaa 1320

caggacgaaa tccttgacct catggtgcgc cagcgcctgc ccgtgctgat cgatccgatc 1380

gagcccgaga cgcagaccaa ctga 1404

<210> 2

<211> 467

<212> PRT

<213> 氨基酸序列

<400> 2

Met Glu Ala Pro Lys Leu Pro Asp Leu Ser Gly Tyr Thr Lys Glu Ala

1 5 10 15

Val Leu Ala Lys Ile Pro Arg Asp Lys Arg Gly Lys Val Val Val Arg

20 25 30

Arg Met Leu Arg Gln Asp Ala Leu Lys Asp Phe Thr Gly Gly Asn Glu

35 40 45

Arg Leu Arg Glu Trp Ile Lys Arg Gln Gln Gly Met Pro Gln Ala Ile

50 55 60

Phe Ile Glu Gly Gly Leu Val Thr Ala Gln Asp Leu Ala Lys Ala Leu

65 70 75 80

Pro Asp Ser Gln Phe Ala Glu Gln Glu Pro Gly Val Tyr Leu Ala Arg

85 90 95

Leu Pro Ile Val Val Ala Glu Gly Ala Ala Leu His Val Gly Lys Glu

100 105 110

Thr Arg Glu Leu Arg Leu Ser Gln Glu Arg Gly Ser Phe Leu Val Asn

115 120 125

Asp Gly Leu Met Phe Leu Thr Asp Thr Arg Val Thr Ala Trp Arg Glu

130 135 140

Ala Asp Asn Gly Pro Ala Thr Met Arg Asp Asn Gly Lys Glu Phe Arg

145 150 155 160

Pro Phe Leu Val Ser Trp Gly Gly Ser Glu Leu Tyr Ile Ala Gly Ser

165 170 175

Val Ile Thr Ser Leu Gly Tyr Asp Asn Ser Lys Ser Tyr Gly Val Ser

180 185 190

Ile Thr Gln Tyr Thr Pro Asn Met His Glu Arg Leu Lys Arg Asp Glu

195 200 205

Pro Thr Gly Trp Leu Ile Asp Ser Glu Phe Val Asp His Trp Tyr Gly

210 215 220

Phe Tyr Cys Tyr Glu Ala Gln Asn Val Val Ile Lys Gly Asn Thr Tyr

225 230 235 240

Arg Asp Asn Ile Val Tyr Gly Ile Asp Pro His Asp Arg Ser His Gly

245 250 255

Leu Ile Ile Ala Glu Asn Thr Val Phe Gly Thr Lys Lys Lys His Gly

260 265 270

Ile Ile Ile Ser Arg Glu Val Asn Asp Ser Trp Ile Ile Asn Asn Glu

275 280 285

Ser Tyr Asp Asn Lys Leu Ser Gly Val Val Ile Asp Arg Asn Ser Glu

290 295 300

Arg Asn Leu Ile Ala Tyr Asn Arg Val His Gly Asn His Ser Asp Gly

305 310 315 320

Ile Thr Leu Tyr Glu Ser Gly Asp Asn Leu Leu Trp Gly Asn His Val

325 330 335

Leu Gly Asn Gln Arg His Gly Ile Arg Ile Arg Ser Ser Glu Asn Ile

340 345 350

Arg Leu Tyr Asp Asn Val Ser Ala Met Asn Gln Leu Thr Gly Val Tyr

355 360 365

Gly His Ile Lys Asp Leu Ser Asp Thr Asp Arg Asp Leu Asp Leu Asp

370 375 380

Pro Phe Asp Thr Lys Ile Ser Met Ile Ile Val Gly Gly Thr Leu Ala

385 390 395 400

Gly Asn Gly Ser Ser Pro Ile Asn Ile Asp Ser Pro Leu Ser Val Glu

405 410 415

Leu Tyr Arg Val Lys Met Leu Ala Pro Arg Lys Ser Ser Gly Ile Gln

420 425 430

Leu Ala Gly Ile Leu Gly Glu Lys Gln Asp Glu Ile Leu Asp Leu Met

435 440 445

Val Arg Gln Arg Leu Pro Val Leu Ile Asp Pro Ile Glu Pro Glu Thr

450 455 460

Leu Thr Asn

465

Claims

1.一种甘露糖醛酸C-5差向异构酶/海藻酸裂解酶双功能酶基因，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的甘露糖醛酸C-5差向异构酶/海藻酸裂解酶双功能酶基因编码的甘露糖醛酸C-5差向异构酶/海藻酸裂解酶双功能酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种含有权利要求1所述的甘露糖醛酸C-5差向异构酶/海藻酸裂解酶双功能酶基因的重组表达质粒。

4.一种含有权利要求1所述的甘露糖醛酸C-5差向异构酶/海藻酸裂解酶双功能酶基因的重组基因工程菌株。

5.一种权利要求2所述的甘露糖醛酸C-5差向异构酶/海藻酸裂解酶双功能酶的制备方法，其特征在于：将权利要求1所述的甘露糖醛酸C-5差向异构酶/海藻酸裂解酶双功能酶基因克隆入重组表达载体，将重组表达载体导入宿主细胞，获得重组表达的甘露糖醛酸C-5差向异构酶/海藻酸裂解酶双功能酶。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述的重组表达载体，是指大肠杆菌表达载体、酵母表达载体、枯草杆菌表达载体、乳酸菌表达载体、链霉菌表达载体、噬菌体载体、丝状真菌表达载体、植物表达载体、昆虫表达载体或哺乳动物细胞表达载体中的一种或几种。

7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述宿主细胞，是指大肠杆菌宿主细胞、酵母菌宿主细胞、枯草杆菌宿主细胞、乳酸菌宿主细胞、放线菌宿主细胞、丝状真菌宿主细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。

8.根据权利要求2所述的甘露糖醛酸C-5差向异构酶/海藻酸裂解酶双功能酶在断裂褐藻胶和差向甘露糖醛酸中的应用。

9.按照权利要求8所述的应用，其特征在于：在断裂褐藻胶的糖苷键，获得单糖或褐藻胶寡糖中的应用。

10.按照权利要求8所述的应用，其特征在于：在差向甘露糖醛酸C-5键，获得不同结构的褐藻胶中的应用。