CN109593744B

CN109593744B - 一种琼胶酶及其制备方法

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Publication number: CN109593744B
Application number: CN201910097793.6A
Authority: CN
Inventors: 李仁宽; 叶秀云
Original assignee: Fuzhou University
Current assignee: Fuzhou University
Priority date: 2019-01-31
Filing date: 2019-01-31
Publication date: 2021-10-29
Anticipated expiration: 2039-01-31
Also published as: CN109593744A

Abstract

本发明提供一种细菌来源的Agarase‑MS基因，以及将其在大肠杆菌和酵母细胞中克隆表达的方法，所述琼胶酶Agarase‑MS的氨基酸序列如SEQ NO.1所示；琼胶酶Agarase‑MS的核苷酸序列如SEQ NO.2所示；核苷酸分子的载体是大肠杆菌质粒或酵母质粒；核苷酸分子的细胞由所述载体转化而得；所述琼胶酶的核苷酸分子的细胞是包含所述核苷酸分子或用所述载体转化的大肠杆菌或包含所述核酸分子或用所述载体转化的毕氏酵母。本发明制备出能够高效表达并分泌琼胶酶Agarase‑MS的重组生产株，实现Agarase‑MS的生产产业化，对琼胶有良好的水解能力。

Description

一种琼胶酶及其制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种琼胶酶、其编码序列、含有该序列的重组质粒和菌株，以及由所述序列编码的琼胶酶在大肠杆菌中的表达和在酵母细胞中的发酵生产。

背景技术

琼胶酶(Agarase)是能够催化水解琼胶多糖(oligosaccharide)，形成聚合度为2~10的琼胶寡糖的一类多糖降解酶的总称。在自然环境中，琼胶酶的分布比较广泛，很多微生物和一些海洋软体动物都能产生琼胶酶。目前，研究者所研究的琼胶酶大部都是分来自于海洋细菌。据报道，海洋细菌中的琼胶降解菌是目前产生琼胶酶最多的一类微生物。已报道的琼胶降解菌在海洋动植物表面、海水及海洋沉积物中均有分布。目前已知的琼胶降解菌主要来自于几个菌属，包括：Vibrio（弧菌属），Pseudomonas（假单胞菌属），Pseudoalteromonsa（假交替单胞菌属），Alteromonas （交替单胞菌属），Agarivorans（食琼脂菌属），Saccharophagus（噬糖菌属），Microscilla （微颤菌属）和 Pseudozobellia（假佐贝尔氏菌属）等。另外，从土壤和淡水中也发现了一些能够产生琼胶酶的细菌，如Cellvibrio（纤维弧菌属），Acinetobacter（不动杆菌属），Bacillus（芽孢杆菌属），Cytophaga(噬细胞菌属) 等。

根据琼胶酶降解琼脂糖作用方式的不同，可以把琼胶酶分为两大类：α-琼胶酶和β-琼胶酶。α-琼胶酶裂解琼脂糖的α-1,3糖苷键，生成以β-D-半乳糖作为非还原性末端和以3,6-内醚-α-L-半乳糖作为还原性末端的琼寡糖系列；而β-琼胶酶则裂解琼脂糖的β-1,4糖苷键，生成以β-D-半乳糖作为作还原性末端和以3,6-内醚-α-L-半乳糖作为非还原性末端的新琼寡糖系列。在文献报道中，已确认的β–琼胶酶比α–琼胶酶更为丰富。

根据氨基酸序列相似性来划分，在CAZY数据库将糖苷水解酶(Glycosidehydrolases)分为130个家族，琼胶酶也属于糖苷水解酶家族，其中α-琼胶酶被划分在GH96家族，β-琼胶酶则划分在GH16、GH50、GH86、GH118四个家族。大部分β-琼胶酶都分布在GH16家族，该家族有一个共同的特征，在酶催化机制反应中，发生了两步置换反应，产物异头碳的构型与底物一致，即保持型催化反应；GH-50家族中仅有个别琼胶酶的性质被报道，既有外切酶也有内切酶，并且主产物均为新琼二糖；较少的β-琼胶酶划分在GH86家族。

琼胶酶是能降解琼胶的一类糖苷水解酶，其降解产物琼胶寡糖，在食品、医药等工业领域都具有重要的应用价值。同时，在养殖产业、分子生物学研究等方向，琼胶酶也有非常重要的应用价值。在分子生物学试验中，利用琼胶酶能够降解琼脂糖的能力，对DNA和RNA割胶回收，回收得到核酸结构不被破坏；在遗传学研究方面，琼胶酶作为工具酶，用于原生质体的制备以及单细胞分离。

琼胶酶的纯化大多数将煤业后通过中空纤维柱、硫酸铵沉淀、透析、阴阳离子交换柱、凝胶柱等分离手段对酶液进行纯化。Young等，利用硫酸铵盐析、透析、DEAE-Cellulose层析等分离手段，第一次纯化一株海洋来源的α-琼胶酶。中国学者刘丹等，从青海海域筛选出一株产琼胶酶的菌株，通过离子交换层析、疏水作用层析、凝胶层析等方法纯化发酵液得到纯化琼胶酶。据报道，通过羟磷灰石层析进行柱净化，离子交换层析和凝胶过滤层析，已经成功纯化出来自于Thalassomonassp.JAMB-A33的琼胶酶。除此之外，疏水层析也已经用于从Vibriosp.PO303克隆的rAgaA的纯化重组琼胶酶都属于β–琼胶酶。在重组酶的研究中，大肠杆菌通常被用于重组琼胶酶的宿主，而枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）用于重组β–琼胶酶在胞外的表达，这些重组的β–琼胶酶主要来源于Microbulbifer-likeJAMB-A94，Agarivoranssp.JAMB-A11，Microbulbifer thermotoleransJAMB-A94和Microbulbifersp.JAMB-A7。在大多数情况下，重组琼胶酶产生于大肠杆菌的胞内，然而一些琼胶酶在自身信号肽的控制下能够分泌到培养基中。据报道，从Vibrio sp.V134和Agarivoranssp.LQ48克隆的琼胶酶存在于培养基和细胞沉淀中。并且，为了保持琼胶酶的生物活性，是从发酵液上清中在非变性的条件下分离纯化的重组琼胶酶。目前，已有不少β–琼胶酶进行了克隆表达，克隆的β–琼胶酶的分子量从30 kDa到147 kDa不等。通过比较SDS-PAGE结果和预测的蛋白分子量，发现二者是一致的，这证明这些重组的琼胶酶都是单一的多肽。此外，这些琼胶酶的酶的比活大小不一，其中从来自海水的假交替单胞菌Pseudoalteromonassp.CY24中克隆的rAgaB降解琼脂糖的酶比活最大，为5,000 U/mg。

琼胶酶降解琼脂生成琼胶寡糖，而琼胶寡糖又分为琼寡糖和新琼寡糖。大量的报道证明，琼胶寡糖由于其特有的生理和生化特性而具有很高的经济价值。寡糖的混合物能够清除羟自由基、超氧化阴离子自由基，抑制脂质过氧化，从而表现出各种抗氧化特性。研究表明，具有硫酸基团的或高分子量的寡糖比没有硫酸基团、低分子量的寡糖的抗氧化能力强。此外，菌株MA103产生的琼胶酶粗酶液降解红藻多糖而产生的新琼四糖和新琼六糖的混合物具有很强的抗氧化特性。这个结果表明，新琼寡糖在保健食品方面具有潜在的应用价值。除此之外，新琼寡糖还能抑制细菌的生长，减缓淀粉的降解，作为低能量的添加剂提高食品的品质。低聚合度的产物，如新琼二糖，对皮肤有保湿的作用，并且能够抑制黑色素瘤细胞的产生，具有美白功效。研究表明，与新琼四糖和新琼二糖相比，新琼六糖的粘度较高，因而表现出更有效的保湿作用。因此，由于新琼寡糖具有以上这些特性，使其在食品、制药和化妆品行业具有潜在的应用价值。琼胶酶能够用于降解红藻细胞壁，以便从海藻中提取易分解的生物活性物质，例如不饱和脂肪酸、维生素和类胡萝卜素等。Yaphe等将来自于Pseudomonasatlantic的琼胶酶用于海藻（红藻科）中是否产生琼脂的鉴定。琼胶酶还用于原生质体的制备。从海藻中分离的原生质体是生理和细胞研究上非常有用的实验材料，还是通过细胞融合和基因操作技术进行植物繁殖的有力工具。Araki等利用三种酶从Bangiaatropurpurea（红藻门）中成功地完成了原生质体的分离，这三种酶分别是来自于Vibrio sp.MA-138的β-1,4-甘露聚糖酶，来自于Alcaligenessp.XY-234的β-1,3-木聚糖酶和来自于Vibrio sp.PO-303的琼胶酶。从Vibriosp.PO303克隆的琼胶酶rAgaA，rAgaC和rAgaD不仅能够降解琼脂糖和琼脂，还能够降解存在于紫菜细胞壁中的紫菜聚糖。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种海洋微生物来源的琼胶酶基因，以及将其在大肠杆菌和酵母细胞中克隆表达的方法，解决上述现有技术的不足之处，制备出能够高效表达并分泌琼胶酶的重组生产株，实现琼胶酶的生产产业化。

本发明首先提供一种琼胶酶，所述述琼胶酶的氨基酸序列的如SEQ NO.1所示。

本发明还提供一种琼胶酶基因，编码所述的琼胶酶；其核苷酸序列如 SEQ NO.2所示。

本发明保护一种包含琼胶酶基因的重组载体。

所述重组载体是是大肠杆菌质粒pET28a(+)-Agarase-MS或酵母质粒pPIC9k-Agarase-MS。

本发明还保护一种细胞，所述细胞含有所述的琼胶酶基因的核苷酸序列，或所述细胞由包含琼胶酶基因的重组载体经转化宿主细胞而得；所述宿主细胞为大肠杆菌细胞或毕赤酵母细胞。

本发明还提供了所述琼胶酶基因的克隆方法，所述克隆方法包括以下步骤：Agarase-MS基因的获得：利用琼胶酶氨基酸保守片段设计简并引物，通过PCR技术获得微泡菌（Microbulbifersp.）一段琼胶酶的编码基因；再通过genome walking获得其全长，并在NCBI数据库中进行比对分析，得到琼胶酶基因Agarase-MS。

以及，一种所述重组载体的制备方法，所述Agarase-MS基因的重组载体的制备方法为：采用权利要求2所述琼胶酶基因编码核苷酸序列经EcoR I和Not I双酶切后与EcoR I和Not I双酶切的pET28a(+)载体连接，得到大肠重组表达载pET28a(+)-Agarase-MS或采用权利要求2所述琼胶酶基因编码核苷酸序列经EcoR I和 Not I双酶切后与EcoR I和Not I双酶切的pPIC9k载体连接，得到酵母重组表达载体pPIC9k- Agarase-MS。

另外，本发明还保护所述的琼胶酶的制备方法，培养所述包含琼胶酶编码序列的细胞或所述经转化的细胞，诱导其表达，收获表达产物：通过包含琼胶酶编码序列的酵母发酵来生产琼胶酶，并通过硫酸铵沉降和离子交换色谱纯化得到了纯酶形式的目的蛋白。

以及，所述琼胶酶的应用，利用本发明的琼胶酶降解富含琼胶的底物。

详述

本发明涉及从Microbulbifersp.中克隆琼胶酶基因。实施方式之一，本发明提取经16s rDNA鉴定为Microbulbifersp.基因组DNA，利用琼胶酶氨基酸保守片段的简并引物，获取一段琼胶酶的编码基因；再通过 genome walking 技术获得全长，并在NCBI数据库中进行比对分析，得到琼胶酶基因。实施方式之一中，所述编码序列包含如SEQ NO.2所示的核酸序列，称之为Agarase-MS。实施方式之一中，所述编码序列是SEQ NO.2 中的核苷酸1至2259所示的核苷酸序列。

本发明还涉及包含所述Agarase-MS编码序列的重组载体，例如由各种本领域常用的表达载体制备的重组载体，其中，所述编码序列不包含其来源微生物的内源性信号肽序列。实施方式之一中，将不带内源性信号肽编码序列的本发明Agarase-MS编码序列经EcoRI和Not I双酶切后与EcoR I和Not I双酶切的pET28a(+)载体连接，得到大肠重组表达载pET28a(+)-Agarase-MS。另一实施方式中，将不带内源性信号肽编码序列的本发明Agarase-MS编码序列经EcoRI和 NotI双酶切后与EcoR I和Not I双酶切的pPIC9k载体连接，得到酵母重组表达载体pPIC9k-Agarase-MS。

本发明还制备包含本发明Agarase-MS编码序列的细胞。实施方式之一中，所述细胞是用上述本发明重组载体转化来构建的。所述细胞优选各种利于基因产物表达或发酵生产的细胞，此类细胞已为本领域熟知并常用，例如各种大肠杆菌细胞和酵母细胞。在本发明的实施方式之一中，选用大肠杆菌BL21(DE3)和的毕氏酵母GS115 构建表达Agarase-MS的重组细胞。

本发明还提供了表达Agarase-MS的方法，包括：培养前文所述本发明包含Agarase-MS编码序列的细胞或所述经转化的细胞，诱导其表达，收获表达产物，还可以可行性地包括纯化表达产物的步骤。实施方式之一中，本发明通过包含本发明Agarase-MS编码序列的酵母(例如毕氏酵母(GS115)发酵来生产琼胶酶，并通过硫酸铵沉降和离子交换层析纯化得到了纯酶形式的目的蛋白。

本发明利用基因工程手段制备了能够高效表达并分泌Agarase-MS的重组生产株，实现了Agarase-MS的生产产业化，并获得了优质的琼胶酶产品。本发明通过酶活测定和底物特异性的分析，证明本发明的Agarase-MS对琼胶有很好的分解能力。

附图说明

图1为 Microbulbifersp.来源琼胶酶与其他来源琼胶酶的氨基酸序列的比较。

图2 为Microbulbifersp.来源的琼胶酶Agarase-MS在质粒pMD-18T、pET28a(+)和pPIC9k上的重组子结构图。

图3为毕氏酵母表达Microbulbifersp.来源的琼胶酶Agarase-MS的SDS-PAGE图谱；其中1为发酵96h样品；M为protein marker。

图4为毕氏酵母表达Microbulbifersp.来源的琼胶酶Agarase-MS的发酵过程中产酶曲线图。

图5为毕氏酵母表达Microbulbifersp.来源的琼胶酶Agarase-MS纯化过程中样品的SDS-PAGE图谱。

图6为毕氏酵母表达Microbulbifersp.来源的琼胶酶Agarase-MS对琼胶分解的薄层层析图谱；其中A: 1、2、3、4、5、6分别表示底物与酶反应时间为1 min、5 min、10 min、15min、30 min、1 h；B: 1、2、3、4分别表示底物与酶反应时间为1 h、2 h、6 h和36 h；M-糖标准品，包括二糖、四糖、六糖和八糖。

具体实施方式

以下根据具体的实施例充分说明本发明。

实施例

实验材料和试剂

1.菌株和载体：

大肠杆菌BL21（DE3）、JM109、DH5α及表达载体pET28a(+)购自Novagen公司，毕氏酵母GS115及表达载体pPIC9k均购自Invitrogen公司（Carlsbad，CA，USA）。

2.酶类及其他生化试剂：

限制性内切酶、DNA Maker、Protein Maker均购自Fermentas（MBI），genomewalking kit购自TaKaRa公司，琼胶购自Invitrogen公司（Carlsbad，CA，USA），其他常规试剂为上海生工或进口。

3.培养基：

使用的培养基：LB培养基，YPD，YPAD，BMDY，BNNY，MM，MD培养基均参照Invitrogen毕氏酵母操作手册。

4.本发明中所用到的生物化学技术均为本领域中的常规技术。在以下实施例中，除非特殊说明，所有实验操作均按照以下实验手册或文献中的相关章节或部分进行，包括：[美]J.莎姆布鲁克等，分子克隆实验指南；赵永芳等，生物化学技术原理及其应用（第二版）；朱检等，生物化学实验[M]。

5.本发明中所有相关的酶活、酶活力、酶活性均是指琼胶酶酶活性，均采用DNS法并按照所述的方法进行测定及计算。

实施例1 琼胶酶基因Agarase-MS的获得

根据genome walking kit进行操作。

（1）Microbulbifersp.基因组DNA的分离提取：

取1.5 mL菌体培养物于一灭菌Ep管中，12000 rpm离心1 min，丢去上清液，收集菌体。

加入400 μL裂解液（40 mM Tris-醋酸，20 mM醋酸钠，1 mM EDTA，1% SDS，pH7.8）混匀，置于37 ℃水浴1 h。

然后加入200 μL l5 mol/L的氯化钠溶液，混匀后于13000 rpm离心15 min。

取上清液，用苯酚抽提2次，氯仿抽提1次。

加两倍体积无水乙醇，1/10体积醋酸钾(3 M，pH8.0)，-20℃保存1 h后，13000 rpm离心15 min，弃上清液，沉淀用70%乙醇洗2次；置于室温干燥后，溶于50 μL TE溶液中，置4℃保存备用。

（2）琼胶酶Agarase-MS保守序列的获取

对NCBI已有的琼胶酶基因进行分析，设计简并引物以扩增Agarase-MS基因保守序列。

本研究PCR程序为： 94 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，循环扩增30次；最后72 ℃延伸10 min。扩增结束后取PCR产物进行电泳检测,并回收凝胶中的目标基因。

（3）genome walking 获取目的基因

以获得的Agarase-MS保守序列为模板，根据genome walking kit进行操作。扩增结束后取PCR产物进行电泳检测,并回收凝胶中的目标基因。

（4） PCR获取目的基因

以由genome walking扩增得到的最终序列为模板，设计上下游引物M1和M2。上、下游引物分别含有EcoRⅠ和NotⅠ酶切位点，由上海生工合成，引物序列如下：

M1：5' TTGAATTCCTATGTGTTGCCGGTGTGCT 3'

M2：5' TAGCGGCCGCATCATTTTTTTTGCCCATAT 3'

本研究PCR程序为： 94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，循环扩增30次；最后72 ℃延伸10 min。扩增结束后取PCR产物进行电泳检测,并回收凝胶中的目标基因。

（4）cDNA亚克隆：

制备好的双链cDNA插入到载体系统pMD18-T上，得到重组质粒pMD18-Agarase-MS（如图3所示），用化学转化法转化受体菌DH 5α，在含有100 mg/mL Amp的LB平板上37 ℃培养过夜。挑取的单克隆菌落接种到2 mL含有100 mg/mLAmp的LB液体培养基中，37 ℃ 200rpm培养6-10 h，10000 rpm离心10 min收集菌体，提取质粒，酶切回收目的基因备用（质粒提取和胶回收分别用OMEGA公司的E.Z.N.A. Plasmid Mini Kit I和E.Z.N.A. GelExtraction Kit试剂盒）。将所得目的基因进行DNA序列测定（Invitrogen公司），并在NCBI数据库中进行比对分析，结果分别如图1所示。

由此所得到的Agarase-MS的编码序列共有2259 bp（SEQ NO.2），其中第2257-2259位为终止密码子TGA、第1-2256位编码不含信号肽的成熟蛋白（图1），该成熟蛋白含有752个氨基酸（SEQ NO.1）。根据在NCBI数据库里同源性比对的结果确定所得到的基因片段Agarase-MS为琼胶酶。

实施例2 Agarase编码基因在大肠杆菌中的表达和扩增

将实施例1-(4)中所得到的目的基因，与经过到EcoR I 和Not I双酶切的pET28a(+)质粒连接，得到重组质粒pET28a(+)-Agarase-MS（如图2所示）。

取10 μL构建好的质粒DNA，加入到100 μL制备好的感受态细大肠杆菌BL21(DE3)中，摇匀置于冰上，冰浴30 min；置于42 ℃水浴中热击90 s；将离心管快速移至冰水混合物中冰浴2 min；每管加入400 μL SOC培养基(2％蛋白胨，0.5％酵母粉，10 mM NaCl，2.5 mMKCl，10 mM MgCl₂，10 mM MgSO₄，20 mM 葡萄糖，pH7.0～7.2)，用移液器轻吸打散后于37℃摇床上复苏1 h（80 rpm～200 rpm）；离心，4000 rpm× 5min，除去400 μL上清，剩余部分混匀；涂平板（LB-agar平板，含100 μg/mL Amp），37 ℃正置1 h后，倒置培养过夜，在抗性平板上生长的为含有重组质粒的阳性克隆子。

取重组大肠杆菌菌株BL21(DE3)，接种于50 mL LB培养液中（250 mL三角瓶，100 μg/mL Amp），37 ℃ 250 rpm振荡培养1-1.5 h，加入IPTG诱导（终浓度为2μmol/mL），37 ℃250 rpm再振荡培养3-3.5 h。取培养液10000 rpm离心10 min，收集菌体，再加入等体积的无菌水重新悬浮菌体，12000 rpm离心10 min，取沉淀用1/5体积pH6.0，50 mM的PBS悬浮菌体，进行超声波破碎，破碎条件为：60%功率，间隔5 s破碎10 min，停止1 0min，再破碎10min。12000 rpm离心，收集上清液分析Agarase-MS活力，并通过SDS-PAGE电泳分析目的蛋白的表达量，结果表明Agarase-MS的编码基因所编码的琼胶酶可在大肠杆菌中表达，且有一定的琼胶酶活性，测得酶活力为21 U/mL。

取重组大肠杆菌菌株pMD18-T，接种于50 mL LB培养液中（250 mL三角瓶，含100 μg/mL Amp），37 ℃ 250 rpm振荡培养6-10 h，取培养液10000 rpm离心10 min，收集菌体，提取质粒，酶切回收目的基因备用（质粒提取和胶回收分别用OMEGA公司的E.Z.N.A. PlasmidMini Kit I和E.Z.N.A. Gel Extraction Kit试剂盒）。

实施例3 酵母重组表达载体的构建

将实施例2中所得到的目的基因，与经过到EcoR I 和Not I双酶切的pPIC9k质粒连接，得到重组质粒pPIC9k-Agarase-MS（如图2所示）。

以所得pPIC9k 重组质粒为模板，以引物M1和引物M2构成的引物对进行PCR，同时，以实施例2制备的pET28a(+)重组质粒与引物M1和引物M2所构成的引物对做PCR，从DNA 水平上验证外源基因插入是否正确。PCR 所得到产物序列长度约为2259 bp，与实施例1中从Microbulbifer sp.中所得到的Agarase-MS原始基因的序列以及其他特征一致，由此可知目的基因的插入位点、方向和序列正确。

实施例4 毕氏酵母发酵生产重组Agarase-MS

将实施例3 制备的重组质粒经Sac I酶切，得到线性化质粒pPIC9k-Agarase-MS。

取构建好的线性重组质粒DNA 50 μg，直接加入到仍在0℃以下的感受态细胞中(毕氏酵母GS115)；加入1.0 mL 含5 μg/mL 的鲑鱼精DNA 的溶液II(40%(w/v)聚乙二醇1000，0.2 M N,N-二羟乙基甘氨酸，pH8.35)，或先加入1.0 mL的溶液II，然后加入5 μL 1mg/mL 的鲑鱼精DNA 并尽量的将两者完全混匀；30℃水浴保温1 h 以上，每隔15 min 轻轻的混匀一次；42 ℃保温10 min；室温3000×g 离心5 min，弃去上清，用1.0 mL 的溶液III(0.15 M NaCl，10 mM N,N-二羟乙基甘氨酸，pH8.35)重新悬浮菌体；室温3000×g 离心5min，移去800 μL 上清，用剩余的200 uL上清重新悬浮菌体；将200 μL 菌液涂YPD 平板(YP和20%D 单独灭菌，倒平板之前按1:9 向YP 中加入20%D；筛选抗性为80 ug/mL Amp)，30℃倒置培养3-4 天，在抗性平板上生长的为含有重组质粒的阳性克隆子。

取重组质粒pPIC9k-Agarase-MS转化的毕氏酵母GS115菌株阳性克隆子，接种于150 mL YPD培养液中，30 ℃ 250 rpm振荡培养至OD₆₀₀＝0.3～0.5(约20 h)，然后接种于3L发酵基本培养基(26.2 mL/L磷酸，0.80 g/L硫酸钙，18.7 g/L硫酸钾,15.5 g/L硫酸镁，4.17 g/L氢氧化钾，Glucose 40 g/L葡萄糖)中，于5L发酵罐中进行发酵。

在起始阶段——菌体生长阶段，发酵过程中用25wt％的氨水调节pH，使其维持在6.5，并且以4.0 mL/h的速度流加PTM1 (30 mM硫酸铜，0.54 mM碘化钠，17.6 mM硫酸锰，0.80 mM钼酸钠，0.32 mM硼酸，2.4 mM氯化钴，0.18 mM氯化锌，0.24 mM硫酸亚铁，1.6 mM生物素，0.19 M硫酸)，进行连续流加补料。搅拌并通气培养20-24 h，在菌体生长过程中溶氧逐渐下降至低于100％，直至碳源耗尽，溶氧又逐渐上升至高于80％，此时菌湿重可达到90g/L。

进入碳源饲喂阶段，以25 mL/h的速度流加用蒸馏水配置的含有25％(w/v)葡萄糖和12 mL/L PTM1的溶液，持续流加4-6 h，并调节通气量，使溶氧维持在20％上下，到代该阶段的末期，菌湿重可达到160 g/L。

在诱导阶段，以20-30 mL/h的速度流加含有12 mL/L PTM1的甲醇，使培养基中甲醇的终浓度最高不要超过0.3％(v/v)，并调节通气量，使溶氧维持在20％上下。在诱导96 h时取样10 mL，10000 rpm离心5 min，收集上清液测定Agarase-MS活力并进行SDS-PAGE分析，结果分别如图3、4所示。发酵168 h时，菌湿重可达到280.98 g/L，Agarase-MS的表达水平(以发酵液上清的酶活力表示)可达到2648 U/mL，这说明Microbulbifer sp.来源的琼胶酶基因Agarase-MS能在毕氏酵母中得到了很好的表达和积累。

实施例5 重组琼胶酶Agarase-MS的纯化

将实施例4所制备的发酵培养液10000 rpm离心10 min去除菌体，取上清液作为粗酶液，用中空纤维超滤膜进行超滤，以去除粗酶液中小分子的杂质，并将其浓缩3-5倍。

将上面所得粗酶液的浓缩液置于冰浴中，边搅拌边缓慢加入硫酸铵至45％，13000rpm离心15 min，取沉淀，用缓冲液重新溶解。溶解上清用脱盐柱进行脱盐，脱盐后的样品置于-20 ℃的低温冰箱中保存待用。

取以上脱盐样品，采用GE公司生产的DEAE-阴离子交换柱进行分离纯化，型号为DEAE FF (HiTrap^TM，5 mL)，配置pH为7.0的Tris-HCl缓冲液，透析后的样品经过高速离心（13000 r/ min），并过0.22 μm水膜。上样前，先用20 mM pH 7.0的Tris-HCl缓冲液平衡柱子，再用处理过的样品上样于DEAE-阴离子交换柱，用20 mM pH 7.0的Tris-HCl缓冲液冲洗3~4个柱体积后，再进行梯度洗脱。以1 mL/min的流速泵入平衡液和洗脱液，洗脱液为含有0~1 M NaCl的20 mM pH 7.0的Tris-HCl缓冲液，洗脱时间200 min，收集出峰时间段的洗脱液，每2 mL收集一管，然后对收集管中的溶液测定琼胶酶活力及蛋白电泳分析。

纯化完成后，Microbulbifer sp.来源的琼胶酶Agarase-MS比活性从粗酶液的36.53 U/mg提高到纯酶的208.2 U/mg，纯化倍数为5.7，得率为45.7%。纯化后样品S的SDS-PAGE结果（图5）。

实施例6 重组Agarase酶解琼胶分析

琼胶能够用于制备琼胶寡糖，琼胶寡糖因在抗炎、抗氧化、抗病毒、抗癌、抑菌等众多方面具有生理活性而备受关注。然而，作为一种天然多糖，琼胶的分子量大、粘度高、溶解性低，因此难以被人体分解吸收，不能发挥琼胶寡糖的生理活性。因此，通过降解琼胶制备能够被人体直接吸收的琼胶寡糖，就成为一个极为有意义的研究。本发明中利用生产的重组琼胶酶Agarase-MS来探讨其降解琼胶的效果。

（1）材料：发酵得到的琼胶酶酶液，0.6%琼胶底物，层析纸，层析液（正丁醇:乙醇:水=2:1:1），染色液（苯胺-二苯胺），糖标准品等。

（2）实验过程：①将0.5 mL的琼胶酶液与4.5 mL的底物在混合液40 ℃下保温，分别保温1 min、5 min、10 min、15 min、30 min、1 h、2 h、6 h和36 h。

②将保温后的混合液在层析纸中上样，各加50 μL，上样过程中要保证层析纸一直保持干燥状态。糖标准品（二糖、四糖、六糖和八糖）也在层析纸中上样3 μL。

③上样完成后，将层析纸放入层析液中，3-4 h。

④将层析纸层析液中拿出，用吹风机吹干。再用染色液对层析纸染色，保证染色均匀。染完色后，放入70 ℃烘箱烘干，15 min后观察实验结果。结果由图可知，琼胶酶与底物的最终产物主要是二糖和四糖。实验结果如图6所示。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福州大学

<120> 一种琼胶酶及其制备方法

<130> 7

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 752

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Leu Cys Val Ala Gly Val Leu Leu Ala Ala Cys Gly Lys Pro Ala Gly

1 5 10 15

Glu Leu Gly Gly Glu Ser Ala Gly Glu Gly Ile Glu Gln Ser Thr Ile

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Ile Pro Ala Gly Val Glu Gly Tyr Gly Val Ser Leu Ser Arg Leu Pro

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Tyr Glu Pro Arg Leu Asp Leu Val Pro Glu Ser Gly Trp Asp Trp Ser

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Gly Ala Gly Asp Ser Ile Gly Leu Ser Leu Ser Val Ala Asn Pro Ser

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Asp His Ser Val Gln Leu Phe Val Thr Val Tyr Asp Asp Lys Ser Phe

115 120 125

Gly Thr Arg Ser Leu Asn Val Pro Ala Gly Gly Ala Gly Thr Tyr Tyr

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Phe Asp Leu Asn Gly Pro Ala Leu Ala Leu Asp Ala Gly Met Arg Asp

145 150 155 160

Ala Pro Ala Leu Tyr Gln Asn Ala Ala Thr Ala Met Thr Trp Met Trp

165 170 175

Gly Ser Lys Ser Leu Asp Leu Ser Ser Ile Arg Arg Val Glu Leu Asn

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Met Arg Ser Ile Leu Ser Asp Arg Thr Leu Val Leu Glu Asp Ile Ala

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Leu Ala Thr Asn Gly Glu Phe Gln Pro Gln Asn Leu Gln Gly Ile Phe

210 215 220

Asp Gln Tyr Gly Gln Tyr Ala Pro Gln Asp Tyr Pro Glu Lys Ile His

225 230 235 240

Ser Asp Asp Ala Leu Arg Ala Ser Ala Gln Arg Glu Ala Glu Gln Phe

245 250 255

Ser Ala Gln Ser Ile Phe Ala Asp Arg Ser Arg Phe Gly Gly Trp Ala

260 265 270

Lys Gly Pro Gln Tyr Glu Ala Thr Gly Tyr Phe Arg Thr Gln Lys Ile

275 280 285

Asp Gly Gln Trp Ala Leu Ile Asp Pro Glu Gly Tyr Leu Phe Phe Ala

290 295 300

Thr Gly Val Asp Asn Met Arg Met Asp Asn Thr Val Thr Met Thr Gly

305 310 315 320

Val Asp Phe Ala Glu Pro Asp Ile Arg Lys Gly Pro Val Val Ala Ser

325 330 335

Glu Leu Arg Lys Asn Leu Phe Gln Trp Leu Pro Glu Glu Gln Gly Ala

340 345 350

Leu Ser Ser His Tyr Val Tyr Arg Pro Val Val His Thr Gly Pro Val

355 360 365

Glu Lys Gly Glu Gly Phe Ser Phe Tyr Arg Ala Asn Leu Glu Arg Lys

370 375 380

Tyr Gly Pro Asp Tyr Leu Gln Arg Trp Arg Glu Val Thr Ile Asp Arg

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Gln Leu Asp Trp Gly Phe Thr Thr Leu Gly Asn Trp Ala Asp Pro Ser

405 410 415

Leu Tyr Asp Asn Gly Lys Val Ala Tyr Val Ala Asn Gly Trp Ile Arg

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Gly Asp His Lys Arg Val Ser Ser Gly Asp Asp Tyr Trp Gly Pro Leu

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His Asp Pro Phe Asp Pro Glu Phe Val Arg Ser Val Lys Arg Thr Val

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Ala Gln Val Ala Ala Glu Val Gln Asn Asp Pro Trp Cys Met Gly Val

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Tyr Ile Glu Asn Glu Leu Ser Trp Gly Asn Thr Lys Ser Asp Ala Gly

485 490 495

His Phe Gly Leu Ile Ile His Thr Leu Thr Arg Asp Ala Val Glu Ser

500 505 510

Pro Ala Lys Ala Ala Phe Val Glu Leu Leu Gln Asp Arg Tyr Thr Ser

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Val Glu Asn Leu Ser Arg Ala Trp Ser Leu Pro Leu Ala Ala Thr Asp

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Ile Ser Thr Gly Ser Ser Ala Val Thr Ser Trp Glu Ala Phe Ser Arg

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Gly Phe Ala Leu Pro Ala Ser Ala Asn Gly Lys Pro Leu Ile Glu Gly

565 570 575

Ala Leu Arg Glu Asp Phe Ser Leu Leu Leu Glu Ser Leu Ser Ala Gln

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Phe Phe Ser Val Val Gln His Glu Leu Ala Ala Val Met Pro Asn His

595 600 605

Leu Phe Leu Gly Ala Arg Phe Ala Asp Trp Gly Met Thr Pro Glu Val

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Val Arg Gly Ala Ala Ala His Val Asp Val Val Ser Tyr Asn Leu Tyr

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Thr Glu Gly Leu Ala Ala Gly Asn Trp Asp Phe Leu Ala Glu Ile Asp

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Ser Gln Gln Glu Arg Gly Glu Met Phe Arg Asp Tyr Met His Thr Ile

675 680 685

Ile Asp Asn Pro Trp Phe Val Gly Ala Gln Trp Phe Gln Tyr Ile Asp

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Ser Pro Ala Ser Gly Arg Ala Trp Asp Gly Glu Asn Tyr Asn Val Gly

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Phe Val Thr Val Ala Asp Glu Pro Tyr Gly Pro Leu Val Ala Ala Ala

725 730 735

Gln Ala Leu Asn Arg Glu Leu Tyr Pro Arg Arg Tyr Gly Gln Lys Lys

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<210> 2

<211> 2259

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ctatgtgttg ccggtgtgct gctggcggct tgtggcaaac ctgccggcga actgggtggt 60

gagtcggcgg gtgaggggat tgagcaatcg accattgttg cctacaaaga aaccctgcag 120

ccgattctta tcgcaggtaa tggaattcca gccggggttg agggatacgg tgtttcccta 180

tcccgattac cagcagaagg cggctcagcg ccgctgaagg ctgtgttctc caaagatacc 240

tacgagccgc gactggatct cgtgccggag tctggctggg actggagcgg cgcgggggac 300

agtattggtt tgtcgctgag cgtcgccaac ccgagcgatc actcggtgca gttgtttgtc 360

acggtttacg atgacaagtc gttcggaacc cgttcgttaa atgtgcccgc cggtggcgca 420

ggcacttact actttgacct gaatggcccg gcgctggcgt tggacgccgg tatgcgcgac 480

gcgccggcgc tgtatcaaaa cgccgcaacg gcgatgacct ggatgtgggg cagtaagtcc 540

ctggatctgt ccagcattcg tcgtgtcgag ttgaatatga gaagtatcct cagcgaccgc 600

accctggtgc tcgaggatat tgccctcgcc actaacgggg aattccagcc gcaaaatctt 660

cagggaatct ttgaccagta cggtcagtac gccccccagg actatcctga aaaaattcac 720

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atatttgccg atcgctcccg ctttggcggc tgggctaaag gtccgcaata tgaagcgacc 840

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aatctgttcc agtggttgcc ggaagagcaa ggtgcacttt ccagccacta tgtttaccgt 1080

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accccggaag tagtgcgcgg cgcggcggcc cacgtggatg tggtcagtta caacctctat 1920

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attggcagct tccacgcggg gctggtgtcc gccgagagcc agcaggagcg gggcgagatg 2040

ttccgcgact atatgcacac catcatcgac aacccctggt ttgtgggcgc ccagtggttc 2100

cagtacatcg attcgccggc ctccggccgc gcctgggatg gcgaaaacta taacgtcggc 2160

tttgtcaccg tggcggatga gccctacggg ccgctggtgg cggccgcgca ggcgctgaac 2220

cgggagctgt acccgcgccg atatgggcaa aaaaaatga 2259

<210> 3

<211> 685

<212> PRT

<213> 人工序列

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Met His Ala Val Phe Ser Lys Asn Ile Tyr Glu Pro Arg Leu Asp Leu

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Ala Pro Asp Ser Gly Trp Asp Trp Arg Gly Ala Gly Glu Asn Ile Gly

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Leu Ser Leu Lys Val Thr Asn Pro Gly Asp His Ser Ala Gln Leu Phe

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Met Asp Asn Thr Val Thr Met Thr Gly Val Asp Phe Ala Asp Pro Asp

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Gln Trp Leu Pro Glu Lys Gly Asp Pro Leu Ala Ala His Tyr Phe Tyr

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Gln Gly Asp Pro Trp Cys Met Gly Val Tyr Ile Glu Asn Glu Leu Ser

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<211> 775

<212> PRT

<213> 人工序列

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<212> PRT

<213> 人工序列

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Trp Ile Phe Gly Asp His Ala Arg Ile Ser Thr Gly Asn Asp Tyr Trp

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770 775 780

Glu Lys Tyr Phe Ser Thr Val Gln Ala Glu Leu Lys Lys Val Leu Pro

785 790 795 800

Asn His Met Tyr Leu Gly Ala Arg Phe Ala Asp Trp Gly Val Thr Pro

805 810 815

Glu Ile Ala Arg Gly Ala Ala Pro Tyr Val Asp Val Met Ser Tyr Asn

820 825 830

Leu Tyr Ala Glu Asp Leu Asn Ser Lys Gly Asp Trp Ser Leu Leu Pro

835 840 845

Glu Leu Asp Lys Pro Ser Ile Ile Gly Glu Phe His Phe Gly Ala Thr

850 855 860

Asp Thr Gly Leu Phe His Gly Gly Ile Val Ser Ala Ser Asn Gln Ala

865 870 875 880

Asp Arg Ala Lys Lys Tyr Thr His Tyr Met Gln Ser Ile Val Asp Asn

885 890 895

Pro Tyr Phe Val Gly Ala His Trp Phe Gln Tyr Leu Asp Ser Pro Thr

900 905 910

Thr Gly Arg Ala Trp Asp Gly Glu Asn Tyr Asn Val Gly Phe Val Ser

915 920 925

Ile Thr Asp Thr Pro Tyr Gln Glu Leu Ile Asp Ala Ala Lys Gln Phe

930 935 940

Asn Arg Asp Leu Tyr Asn Leu Arg Tyr Lys Lys

945 950 955

<210> 6

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ttgaattcct atgtgttgcc ggtgtgct 28

<210> 7

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tagcggccgc atcatttttt ttgcccatat 30

Claims

1.一种琼胶酶，其特征在于：所述琼胶酶的氨基酸序列如SEQ NO.1所示。

2.一种琼胶酶基因，其特征在于：编码权利要求1所述的琼胶酶；其核苷酸序列如 SEQNO.2所示。

3.包含如权利要求2所述的琼胶酶基因的重组载体。

4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体是大肠杆菌质粒pET28a(+)-Agarase-MS或酵母质粒pPIC9k-Agarase-MS。

5.一种细胞，其特征在于：所述细胞含有权利要求2所述的琼胶酶基因的核苷酸序列，或所述细胞由包含权利要求2所述的琼胶酶基因的重组载体经转化宿主细胞而得；所述宿主细胞为大肠杆菌细胞或毕赤酵母细胞。

6.一种如权利要求2所述的琼胶酶基因的克隆方法，其特征在于：所述克隆方法包括以下步骤：Agarase-MS基因的获得：利用琼胶酶氨基酸保守片段设计简并引物，通过PCR技术获得微泡菌（Microbulbifer sp.）一段琼胶酶的编码基因；再通过genome walking获得其全长，并在NCBI数据库中进行比对分析，得到琼胶酶基因Agarase-MS。

7.一种如权利要求4所述的琼胶酶的核苷酸分子的重组载体的制备方法，其特征在于：所述Agarase-MS基因的重组载体的制备方法为：采用权利要求2所述琼胶酶基因编码核苷酸序列经EcoRI和NotI双酶切后与EcoRI和NotI双酶切的pET28a(+)载体连接，得到大肠重组表达载pET28a(+)-Agarase-MS或采用权利要求2所述琼胶酶基因编码核苷酸序列经EcoRI和 Not I双酶切后与EcoRI和NotI双酶切的pPIC9k载体连接，得到酵母重组表达载体pPIC9k- Agarase-MS。

8.一种如权利要求1所述的琼胶酶的制备方法，其特征在于：培养包含所述琼胶酶编码序列的细胞，诱导其表达，收获表达产物；通过包含琼胶酶编码序列的酵母发酵来生产琼胶酶，并通过硫酸铵沉降和离子交换色谱纯化得到了纯酶形式的目的蛋白。

9.一种如权利要求1所述的琼胶酶的应用，其特征在于：利用所述琼胶酶降解富含琼胶的底物。