CN110438182A - 一种制备新琼四糖的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种制备新琼四糖的方法，是将琼脂糖的酸处理液使用β‑琼胶酶进行酶解制备的；其中的琼胶酶为β‑琼胶酶AgWH50B，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1。本发明通过结合酸解法和酶法，实现了高效的制备新琼四糖。与单独酶法制备新琼四糖的方法相比，其产率明显提升，体现了本发明的高效性制备。

Description

一种制备新琼四糖的方法
技术领域
本发明属于寡糖制备技术领域，具体涉及一种制备新琼四糖的方法。
背景技术
琼胶是红藻细胞壁的主要成分，由琼脂糖和琼脂胶组成的聚合物。琼胶具有较强的凝胶特性，人体不能直接吸收利用，但经过水解作用形成的琼胶寡糖，水溶性好，易被人体吸收，同时琼胶寡糖具备良好的生理活性。琼胶寡糖由(1→3)－O－β－D－半乳糖残基和(1→4)－O－3，6－内醚－α－L－半乳糖残基交替组成的线形链状分子。根据琼胶寡糖非还原端的不同，可将琼胶寡糖分为非还原端为3,6-内醚-L-半乳糖的新琼寡糖以及非还原端为D-半乳糖的琼寡糖。其中，新琼四糖是一种研究较多的琼胶低聚糖，具有抗疲劳、调节肠道微生物群、抗炎、抗肥胖和抗糖尿病等多种生物活性。
目前制备琼胶寡糖的方法主要有酸解法和酶法两种，由于酸解过程中，更偏向于水解α-1,3糖苷键，生成非还原端为D-半乳糖的琼寡糖。而酶法则用以制备偶数新琼寡糖以及偶数琼寡糖。其中通过化学法即酸解法制备奇数琼寡糖具有反应迅速、处理底物浓度较大等优点，但是经酸解之后产物较杂，分离较为困难，且无法用以制备非还原端为3,6-内醚-L-半乳糖的新琼寡糖。酶解法相比于酸解法具有反应温和、产物单一、易于分离等优点，但是单独酶法由于琼胶的凝胶特性，其作用底物浓度较低，造成其产量较低。因此，开发高效率的新琼寡糖的制备技术具有重大意义。
发明内容
本发明目的是提供一种制备新琼四糖的方法，克服了单独酶法制备新琼四糖效率低，产量小的缺点；通过酸解预处理琼脂糖，利用β-琼胶酶AgWH50B水解酸解琼脂糖处理液进一步制备新琼四糖。
本发明提供一种高效制备新琼四糖的方法，是将琼脂糖的酸处理液使用β-琼胶酶进行酶解制备的；其中的琼胶酶为β-琼胶酶AgWH50B，其氨基酸序列为：
MTFTKSKIATVLSLSLLGIYGCASTTPQNEQAAAGEQVVEDMGGALPDFESDKFFSKLKAEHAKASAVTDTGVTAGSQALKIDFDSVNEANKFKFWPNVKLHPDTGNWNWNAKGSLTLDVTNPTDSTANIILKIADNVGVMGAGDNQLNYALSVPAGETVPVEMIFNGSKRKLDGYWGGEKINLRKLVEFQIFVQGPIDQQSVIVDNFALVDATGDFVEASGAEEVVTGPVPTVLAITDFEKGQDSFISAERSVATTISPVKTDDGAAIDVLFSASNSYPNITFRPDVPWDWSGQGDFNVAFDMVNKSDEPLQLFVRVDDDEHEAFGGTANGVQNSWSGYVTIAPNDEGTYYLSLMPAGDQMVSGMRGEPPKKSYKAQAISYGWGDNNLDLSNIYSMQLYLQNPTADQKLQISSVRLIPNLESDTSRYEGLLDEFGQYTGQDWAQKVKSLEDLQAAGAAELDSLEHPTQLPDRSKFGGWADGPKLEATGFFRAEKVDGKWALVDPEGYLFFVTGLDNIRMDDTVTITGVDFSNKETREGREVASELRNSMFTWLPEYDDVLAESYDYADWIHTGALKKGEVFSFYSANLQRKYQTSREEALKIWKDVTLNRMQDWGFTTLGNWADPKFYDNQQIAYAANGWIFGDHARISTGNDYWGPIHDPFDPEFAVSTRKMAEKVASEVSKDDPWLMGIFVDNEISWGNTKNEANHYGLVVNALSYDIKESPAKAAFTKHLQDKYSSIDALNQSWGTKVTSWADFEVSFDHRSRLSSSMKKDYSEMLQMLSEKYFSTVQAELKKVLPNHMYLGARFADWGVTPEIARGAAPYVDVMSYNLYAEDLNSKGDWSLLPELDKPSIIGEFHFGATDTGLFHGGIVSASNQADRAKKYTHYMQSIVDNPYFVGAHWFQYLDSPTTGRAWDGENYNVGFVSITDTPYQELIDAAKQFNRDLYNLRYKK
所述的琼脂糖的酸处理液，优选为使用柠檬酸处理琼脂糖溶液制备的；
其中柠檬酸的一种具体浓度为2.5％(w/v)的一水合柠檬酸；
所述的琼脂糖溶液，其中琼脂糖的浓度为15％。
本发明通过结合酸解法和酶法，实现了高效的制备新琼四糖。与单独酶法制备新琼四糖的方法相比，其产率明显提升，体现了本发明的高效性制备。
附图说明
图1：本发明制备新琼四糖结构图
图2：本发明的酸解条件优化结果图(a)和酸解后液相检测结果图(b)
图3：本发明的不同加酶量反应结果液相图(a)和新琼四糖最终产量图(b)
图4：本发明的最佳加酶量反应结果液相图(a)和随时间变化的新琼四糖产量变化图(b)
图5：本发明的纯化新琼四糖液相图(d)和纯化过程TLC检测图(a)、(b)和(c)。
具体实施方式
新琼四糖：琼脂糖是由D-β-半乳糖和3,6-内醚-L-α-半乳糖重复二糖单元构成，由β-1,4糖苷键和α-1,3糖苷键交替连接。新琼四糖是指非还原端为3,6-内醚-L-α-半乳糖聚合度为4的琼胶寡糖，其结构如图1所示。
β-琼胶酶AgWH50B：β-琼胶酶AgWH50B直接作用于琼脂糖时，其主要产物为新琼四糖，当采用单独β-琼胶酶AgWH50B直接作用于琼脂糖制备新琼四糖时，由于琼脂糖的凝胶特性，要求作用的底物浓度不能超过1％(w/v)。导致产量较低，单独酶法制备新琼四糖效率较低。
下面通过具体实例对本发明的方法做进一步的说明。
实施例1单独AgWH50B酶解琼脂糖
采用1000mL的制备体系，底物为1％(w/v)的琼脂糖，加入4.875U/mL的AgWH50B于37℃反应12h，煮沸10min后离心取上清，稀释十倍，过0.22μm水相滤膜，待液相进行检测。计算得到最终新琼四糖为0.19g，产率为19％。
实施例2酸解条件的优化
采用100mL的反应优化体系，底物为15％(w/v)的琼脂糖，采用2.5％、5.0％和7.5％(w/v)的一水合柠檬酸水溶液于90℃分别反应1、2、3和4h。通过DNS法测定还原糖的摩尔浓度，绘制如图2(a)的柱状图，并选定2.5％(w/v)一水合柠檬酸，于90℃反应1h为最佳酸解条件。并对最佳酸解条件下的酸解液进行了高效液相检测，结果如图2(b)所示。
实施例3 AgWH50B加酶量的优化
采用10ml的优化反应体系，底物为实施例1中得到的酸解中性糖液。制备新琼四糖分别采用4.875U/mL、9.750U/mL和14.625U/mL的AgWH50B进行加酶量的优化，反应12h煮沸十分钟终止反应，离心取上清，稀释十倍，过0.22μm水相滤膜，待液相进行检测。绘制如图3(b)曲线和如图3(a)的液相图，并根据结果得到最适加酶量为4.875U/mL。
实施例4新琼四糖的制备以及纯化
采用1000mL的制备体系，底物为15％(w/v)的琼脂糖，采用2.5％(w/v)的一水合柠檬酸在90℃条件下反应1h，冷却至室温，用1M氢氧化钠溶液调pH至中性，加入4875UAgWH50B于37℃水浴摇床中反应12h。随着反应时间的进行，取样，煮沸10min后离心取上清，稀释十倍，过0.22μm水相滤膜，待液相进行检测，绘制图4的时间曲线。反应12h结束后，煮沸10min后离心取上清，进行P2柱凝胶色谱层析，收集不同的流出组分(图5a,b,c中横坐标代表不同的流出组分)进行TLC检测，如图5(a)所示，30-50都显示有新琼四糖，进一步对处于30-50管进行TLG检测，如图5(b)所示，38-44管为纯的新琼四糖，而其他组分还存在聚合度的寡糖，进一步进行第二次凝胶色谱层析纯化，如图5(c)所示，得到纯的新琼四糖，与第一次凝胶层析得到的新琼四糖混合在一起,冻干之后，称重。复溶之后进行高效液相色谱检测及质谱检测。
结果如图5(d)所示，纯化得到的新琼四糖无其他杂糖，纯度较高。经计算可知以150g琼脂糖为底物，制备得到25.5g新琼四糖，纯度为92％，同样的反应体积体系，经过酸解结合酶解最终得到25.5g新琼四糖，得率是单独酶解的134倍。
序列表
<110> 中国海洋大学
<120> 一种制备新琼四糖的方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 955
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Thr Phe Thr Lys Ser Lys Ile Ala Thr Val Leu Ser Leu Ser Leu
1 5 10 15
Leu Gly Ile Tyr Gly Cys Ala Ser Thr Thr Pro Gln Asn Glu Gln Ala
20 25 30
Ala Ala Gly Glu Gln Val Val Glu Asp Met Gly Gly Ala Leu Pro Asp
35 40 45
Phe Glu Ser Asp Lys Phe Phe Ser Lys Leu Lys Ala Glu His Ala Lys
50 55 60
Ala Ser Ala Val Thr Asp Thr Gly Val Thr Ala Gly Ser Gln Ala Leu
65 70 75 80
Lys Ile Asp Phe Asp Ser Val Asn Glu Ala Asn Lys Phe Lys Phe Trp
85 90 95
Pro Asn Val Lys Leu His Pro Asp Thr Gly Asn Trp Asn Trp Asn Ala
100 105 110
Lys Gly Ser Leu Thr Leu Asp Val Thr Asn Pro Thr Asp Ser Thr Ala
115 120 125
Asn Ile Ile Leu Lys Ile Ala Asp Asn Val Gly Val Met Gly Ala Gly
130 135 140
Asp Asn Gln Leu Asn Tyr Ala Leu Ser Val Pro Ala Gly Glu Thr Val
145 150 155 160
Pro Val Glu Met Ile Phe Asn Gly Ser Lys Arg Lys Leu Asp Gly Tyr
165 170 175
Trp Gly Gly Glu Lys Ile Asn Leu Arg Lys Leu Val Glu Phe Gln Ile
180 185 190
Phe Val Gln Gly Pro Ile Asp Gln Gln Ser Val Ile Val Asp Asn Phe
195 200 205
Ala Leu Val Asp Ala Thr Gly Asp Phe Val Glu Ala Ser Gly Ala Glu
210 215 220
Glu Val Val Thr Gly Pro Val Pro Thr Val Leu Ala Ile Thr Asp Phe
225 230 235 240
Glu Lys Gly Gln Asp Ser Phe Ile Ser Ala Glu Arg Ser Val Ala Thr
245 250 255
Thr Ile Ser Pro Val Lys Thr Asp Asp Gly Ala Ala Ile Asp Val Leu
260 265 270
Phe Ser Ala Ser Asn Ser Tyr Pro Asn Ile Thr Phe Arg Pro Asp Val
275 280 285
Pro Trp Asp Trp Ser Gly Gln Gly Asp Phe Asn Val Ala Phe Asp Met
290 295 300
Val Asn Lys Ser Asp Glu Pro Leu Gln Leu Phe Val Arg Val Asp Asp
305 310 315 320
Asp Glu His Glu Ala Phe Gly Gly Thr Ala Asn Gly Val Gln Asn Ser
325 330 335
Trp Ser Gly Tyr Val Thr Ile Ala Pro Asn Asp Glu Gly Thr Tyr Tyr
340 345 350
Leu Ser Leu Met Pro Ala Gly Asp Gln Met Val Ser Gly Met Arg Gly
355 360 365
Glu Pro Pro Lys Lys Ser Tyr Lys Ala Gln Ala Ile Ser Tyr Gly Trp
370 375 380
Gly Asp Asn Asn Leu Asp Leu Ser Asn Ile Tyr Ser Met Gln Leu Tyr
385 390 395 400
Leu Gln Asn Pro Thr Ala Asp Gln Lys Leu Gln Ile Ser Ser Val Arg
405 410 415
Leu Ile Pro Asn Leu Glu Ser Asp Thr Ser Arg Tyr Glu Gly Leu Leu
420 425 430
Asp Glu Phe Gly Gln Tyr Thr Gly Gln Asp Trp Ala Gln Lys Val Lys
435 440 445
Ser Leu Glu Asp Leu Gln Ala Ala Gly Ala Ala Glu Leu Asp Ser Leu
450 455 460
Glu His Pro Thr Gln Leu Pro Asp Arg Ser Lys Phe Gly Gly Trp Ala
465 470 475 480
Asp Gly Pro Lys Leu Glu Ala Thr Gly Phe Phe Arg Ala Glu Lys Val
485 490 495
Asp Gly Lys Trp Ala Leu Val Asp Pro Glu Gly Tyr Leu Phe Phe Val
500 505 510
Thr Gly Leu Asp Asn Ile Arg Met Asp Asp Thr Val Thr Ile Thr Gly
515 520 525
Val Asp Phe Ser Asn Lys Glu Thr Arg Glu Gly Arg Glu Val Ala Ser
530 535 540
Glu Leu Arg Asn Ser Met Phe Thr Trp Leu Pro Glu Tyr Asp Asp Val
545 550 555 560
Leu Ala Glu Ser Tyr Asp Tyr Ala Asp Trp Ile His Thr Gly Ala Leu
565 570 575
Lys Lys Gly Glu Val Phe Ser Phe Tyr Ser Ala Asn Leu Gln Arg Lys
580 585 590
Tyr Gln Thr Ser Arg Glu Glu Ala Leu Lys Ile Trp Lys Asp Val Thr
595 600 605
Leu Asn Arg Met Gln Asp Trp Gly Phe Thr Thr Leu Gly Asn Trp Ala
610 615 620
Asp Pro Lys Phe Tyr Asp Asn Gln Gln Ile Ala Tyr Ala Ala Asn Gly
625 630 635 640
Trp Ile Phe Gly Asp His Ala Arg Ile Ser Thr Gly Asn Asp Tyr Trp
645 650 655
Gly Pro Ile His Asp Pro Phe Asp Pro Glu Phe Ala Val Ser Thr Arg
660 665 670
Lys Met Ala Glu Lys Val Ala Ser Glu Val Ser Lys Asp Asp Pro Trp
675 680 685
Leu Met Gly Ile Phe Val Asp Asn Glu Ile Ser Trp Gly Asn Thr Lys
690 695 700
Asn Glu Ala Asn His Tyr Gly Leu Val Val Asn Ala Leu Ser Tyr Asp
705 710 715 720
Ile Lys Glu Ser Pro Ala Lys Ala Ala Phe Thr Lys His Leu Gln Asp
725 730 735
Lys Tyr Ser Ser Ile Asp Ala Leu Asn Gln Ser Trp Gly Thr Lys Val
740 745 750
Thr Ser Trp Ala Asp Phe Glu Val Ser Phe Asp His Arg Ser Arg Leu
755 760 765
Ser Ser Ser Met Lys Lys Asp Tyr Ser Glu Met Leu Gln Met Leu Ser
770 775 780
Glu Lys Tyr Phe Ser Thr Val Gln Ala Glu Leu Lys Lys Val Leu Pro
785 790 795 800
Asn His Met Tyr Leu Gly Ala Arg Phe Ala Asp Trp Gly Val Thr Pro
805 810 815
Glu Ile Ala Arg Gly Ala Ala Pro Tyr Val Asp Val Met Ser Tyr Asn
820 825 830
Leu Tyr Ala Glu Asp Leu Asn Ser Lys Gly Asp Trp Ser Leu Leu Pro
835 840 845
Glu Leu Asp Lys Pro Ser Ile Ile Gly Glu Phe His Phe Gly Ala Thr
850 855 860
Asp Thr Gly Leu Phe His Gly Gly Ile Val Ser Ala Ser Asn Gln Ala
865 870 875 880
Asp Arg Ala Lys Lys Tyr Thr His Tyr Met Gln Ser Ile Val Asp Asn
885 890 895
Pro Tyr Phe Val Gly Ala His Trp Phe Gln Tyr Leu Asp Ser Pro Thr
900 905 910
Thr Gly Arg Ala Trp Asp Gly Glu Asn Tyr Asn Val Gly Phe Val Ser
915 920 925
Ile Thr Asp Thr Pro Tyr Gln Glu Leu Ile Asp Ala Ala Lys Gln Phe
930 935 940
Asn Arg Asp Leu Tyr Asn Leu Arg Tyr Lys Lys
945 950 955

Claims (4)

1.一种制备新琼四糖的方法，其特征在于，所述的方法是将琼脂糖的酸处理液使用β-琼胶酶进行酶解制备的；其中β-琼胶酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的琼脂糖的酸处理液，是使用柠檬酸处理琼脂糖溶液制备的。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的柠檬酸是浓度为2.5％的一水合柠檬酸水溶液。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的琼脂糖溶液，其中琼脂糖的浓度为15％。
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