CN109439709A - 一种新Iota卡拉胶寡糖的制备方法 - Google Patents

一种新Iota卡拉胶寡糖的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种新Iota卡拉胶寡糖的制备方法，属于海藻寡糖提取技术领域。该方法包括以下步骤：（1）Cellulophaga sp.QY201菌种发酵制备粗酶液；（2）丙酮沉淀粗分离；（3）离子交换层析：（4）凝胶过滤层析制备卡拉胶酶；（5）用水将Iota卡拉胶溶解；（6）Iota卡拉胶的酶解；（7）酶解液灭活、离心、冻干，制备出新Iota卡拉胶寡糖。本发明能够快速、大量的制备新Iota卡拉胶寡糖，且制备的新Iota卡拉胶寡糖产物分布均一，主要含有新Iota卡拉胶2糖、新Iota卡拉胶4糖、新Iota卡拉胶6糖和新Iota卡拉胶8糖，纯度高，生物活性强；采用酶法降解，使得制备过程简单快捷、条件温和、质量稳定，能够规模化制备新Iota卡拉胶寡糖，可为医药、农业、食品等领域研究与开发提供高纯度卡拉胶寡糖产品。

Description

一种新Iota卡拉胶寡糖的制备方法
技术领域
本发明涉及一种新Iota卡拉胶寡糖的制备方法，属于海藻寡糖提取技术领域。
背景技术
卡拉胶作为一种结构独特的天然海洋硫酸多糖，被称为类肝素多糖，其生物活性已经成为当前多糖研究领域中的一个热点。近年来，卡拉胶在生理学和病理学研究中所显出来的生物活性已相继被人们发现。实验研究显示，卡拉胶具有抗血管新生、抗肿瘤、免疫调节、抗氧化、抗菌、抗病毒、降血糖等生物学活性。但由于卡拉胶多糖分子量较大，溶解性和吸收性较差，结构复杂等原因，限制了其应用。而卡拉胶寡糖分子量较小，溶解性增强，结构简化，易于吸收，稳定性和安全性都有所增加，多糖链经过不同形式的断裂后活性基团充分暴露，其活性较卡拉胶有显著提高，同时寡糖还具有低毒性的特征，因此拓宽了卡拉胶的应用范围，目前卡拉胶寡糖活性的研究已日益受到关注。
卡拉胶寡糖是从红藻细胞壁中提取得到的一种水溶性硫酸寡糖，主要存在于红藻纲的角叉菜属（Chondrus）、杉藻属（Gigartina）、麒麟菜属（Eucheuma）和沙菜属中。卡拉胶寡糖的基本结构是由β(1→3)-D-吡喃半乳糖（G）和α(1→4)-D-吡喃半乳糖(D)为基本骨架交替连接形成的硫酸线性寡糖。根据是否含有 3，6-内醚半乳糖以及半乳糖上的硫酸基团的含量和分子中半乳糖所连接的位置不同，卡拉胶寡糖可分为八种类型：κ-卡拉胶寡糖、γ-卡拉胶寡糖、Iota卡拉胶寡糖、ω-卡拉胶寡糖、λ-卡拉胶寡糖、υ-卡拉胶寡糖、ψ-卡拉胶寡糖、ξ-卡拉胶寡糖。常用的卡拉胶寡糖主要有 κ-、ι-、λ-型。
专利技术200810016108.4公开了一种OTA-卡拉胶偶数寡糖单体的制备方法，制备时将iota－卡拉胶用酸或氢型强阳离子交换树脂于50－100℃加热降解30－480分钟，过滤，滤液用碱中和，经浓缩，醇沉，再经Superdex 30或者BioGel P10柱色谱分离，以碳酸氢铵水溶液为流动相，采用示差检测器检测，按洗脱峰合并收集，浓缩，冷冻干燥。但现有技术中并没有酶解制备新Iota卡拉胶寡糖的报道，而酶降解法可以最大程度地保护反应底物的活性基团不会在降解过程中受到破坏，降解产物均一，反应条件温和，产物活性较高，因此开发酶解法制备Iota卡拉胶寡糖技术，实现其高活性、规模化制备及推广应用成为该领域亟待解决的技术问题。
发明内容
为了克服上述现有技术中的不足，本发明提供一种新Iota卡拉胶寡糖的制备方法，实现新Iota卡拉胶寡糖快速大量的制备，且制备的新Iota卡拉胶寡糖产物分布均一，纯度高，生物活性强。
本发明通过下述技术方案实现上述技术效果：
一种新Iota卡拉胶寡糖的制备方法，具体包括以下步骤：
（1）Iota卡拉胶的溶解：用水将Iota卡拉胶配置为浓度为1%的溶液，45℃加热搅拌使之完全溶解；
（2）Iota卡拉胶的酶解，将制备好的Iota卡拉胶酶与步骤1溶解的Iota卡拉胶溶液按照体积比1:30-1:50的比例混合，45℃水浴加热搅拌10-30min；
（3）酶解液灭活，将酶解后的液体100℃灭活15min；
（4）酶解液离心，酶解的产物8000r/min，高速离心10min；
（5）酶解液冻干，酶解液真空冷冻干燥后的Iota卡拉胶寡糖粉末。
优选的，Iota卡拉胶酶与步骤1溶解的Iota卡拉胶溶液体积比为1:42。
上述Iota卡拉胶酶通过如下步骤制备：
（1）培养活化：将筛选的Cellulophaga sp.QY201菌种先接种于液体培养基中，接种量为1%-3%，于20-30℃、60-100rpm/min摇床培养30-40h，进行培养活化，得到粗酶液；
（2）丙酮沉淀粗分离：在粗酶液中缓慢加入2-3倍体积的丙酮，静置3-5min，4℃下8000-10000r/min冷冻离心20-30min，弃去上清，沉淀溶于20mmol/L pH10的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液，透析过夜，4℃下8000-10000r/min冷冻离心20-30min，取上清液；
（3）离子交换层析：将步骤（2）得到的上清液于DEAE Sepharose Fast Flow柱进行离子交换层析，流动相为NaCl，收集活性组分；
（4）凝胶过滤层析：将离子交换层析得到的活性成分进行凝胶过滤层析，凝胶柱为Superdex 75，流动相为20mmol/L pH10的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液，收集活性组分，浓缩为高活性Iota卡拉胶酶液。
上述液体培养基由以下质量百分比的组分组成：3%NaCl、0.5% MgSO4·7H2O、0.02%CaCl2、0.01%KCl、0.002%FeSO4、0.25%CaSein、0.15%NaH2PO4、0.2%NaNO3、0.25%Iota卡拉胶。
本发明提供一种新Iota卡拉胶寡糖的制备方法，与现有技术相比，具有以下显著优势：
（1）本发明能够快速、大量的制备新Iota卡拉胶寡糖，且制备的新Iota卡拉胶寡糖产物分布均一，主要含有新Iota卡拉胶2糖、新Iota卡拉胶4糖、新Iota卡拉胶6糖和新Iota卡拉胶8糖，纯度高，生物活性强；
（2）本发明采用酶法降解，使得制备过程简单快捷、条件温和、质量稳定，能够规模化制备新Iota卡拉胶寡糖，可为医药、农业、食品等领域研究与开发提供了高科技的产品；
（3）本发明创新性的在制备卡拉胶寡糖的过程中采用先将酶解液进行离子交换和凝胶过滤层析然后进行生物酶解制备工艺，提高了卡拉胶寡糖的产率，与将卡拉胶寡糖离子交换和凝胶过滤层析工艺相比降低了生产成本，利于工业化推广应用。
附图说明
图1为新Iota卡拉胶寡糖HPLC检测图；
图2为新Iota卡拉胶四糖质谱图。
具体实施方式
实施例1
一种新Iota卡拉胶寡糖的制备方法，包括以下步骤：
（1）培养活化：将筛选的Cellulophaga sp.QY201菌种先接种于液体培养基中，接种量为2%，于20-30℃、60-100rpm/min摇床培养35h，进行培养活化，得到粗酶液；所述液体培养基由以下质量百分比的组分组成：3%NaCl、0.5% MgSO4·7H2O、0.02%CaCl2、0.01%KCl、0.002%FeSO4、0.25%CaSein、0.15%NaH2PO4、0.2%NaNO3、0.25%Iota卡拉胶；
（2）丙酮沉淀粗分离：在粗酶液中缓慢加入2.5倍体积的丙酮，静置4min，4℃下8000-10000r/min冷冻离心20-30min，弃去上清，沉淀溶于20mmol/L pH10的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液，透析过夜，4℃下8000-10000r/min冷冻离心20-30min，取上清液；
（3）离子交换层析：将步骤（2）得到的上清液于DEAE Sepharose Fast Flow柱进行离子交换层析，流动相为NaCl，收集活性组分；
（4）凝胶过滤层析：将离子交换层析得到的活性成分进行凝胶过滤层析，凝胶柱为Superdex 75，流动相为20mmol/L pH10的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液，收集活性组分，浓缩为高活性Iota卡拉胶酶液；
（5）Iota卡拉胶的溶解：用水将Iota卡拉胶配置为浓度为1%的溶液，45℃加热搅拌使之完全溶解；
（6）Iota卡拉胶的酶解，将制备好的Iota卡拉胶酶与步骤5溶解的Iota卡拉胶溶液按照体积比1:42的比例混合，45℃水浴加热搅拌10-30min；
（7）酶解液灭活，将酶解后的液体100℃灭活15min；
（8）酶解液离心，酶解的产物8000r/min，高速离心10min；
（9）酶解液冻干，酶解液真空冷冻干燥后的Iota卡拉胶寡糖粉末。
实施例2 新Iota卡拉胶寡糖检测结果及分析
（1）高效液相色谱(HPLC)分析
检测仪器：美国戴安Dionex UltiMate 3000液相色谱仪，色谱条件：色谱柱KromasilC18 (4.6mm×150mm，5μm)；流动相：磷酸盐缓冲液/乙腈(83:17，V/V)；检测器：二极管阵列紫外检测器(DAD)；
试验结果如图1、表1所示：
表1 新Iota卡拉胶寡糖HPLC检测图结果
Pk # Area Area %
新Iota卡拉胶2糖 9297.21875 19.43
新Iota卡拉胶4糖 1.31647e4 27.47
新Iota卡拉胶6糖 1.28427e4 26.80
新Iota卡拉胶8糖 7962.98730 16.65
新Iota卡拉胶10糖 2664.70020 5.64
新Iota卡拉胶12糖 1035.83716 2.25
新Iota卡拉胶14糖 822.82520 1.76
Totals 4.81023e4 100.00
由图1、表1可见新Iota卡拉胶寡糖主要含有新Iota卡拉胶2糖、新Iota卡拉胶4糖、新Iota卡拉胶6糖和新Iota卡拉胶8糖；
（2）将新Iota卡拉胶寡糖用凝胶柱分离纯化后得到新Iota卡拉胶四糖，进行电喷雾质谱（ESI-MS）分析，结果如图2所示；
（3）结果分析：Cellulophaga sp.QY201 Iota卡拉胶酶属于糖苷水解酶82家族，该酶主要降解Iota卡拉胶，对κ-卡拉胶、λ-卡拉胶、琼胶具有很微弱的降解作用。Iota卡拉胶酶作用于α-2-硫酸-3,6内醚-D-半乳糖和β-4-硫酸-D-半乳糖之间的β-1,4糖苷键，生产以ι-硫酸新卡拉胶寡糖为主的终产物。
以上实施例仅用于说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对被发明进行了详细的说明，但对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而对这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

Claims (5)

1.一种新Iota卡拉胶寡糖的制备方法，其特征在于具体包括以下步骤：
（1）Iota卡拉胶的溶解：用水将Iota卡拉胶配置为浓度为1%的溶液，45℃加热搅拌使之完全溶解；
（2）Iota卡拉胶的酶解，将制备好的Iota卡拉胶酶与步骤1溶解的Iota卡拉胶溶液按照体积比1:30-1:50的比例混合，45℃水浴加热搅拌10-30min；
（3）酶解液灭活，将酶解后的液体100℃灭活15min；
（4）酶解液离心，酶解的产物8000r/min，高速离心10min；
（5）酶解液冻干，酶解液真空冷冻干燥后的Iota卡拉胶寡糖粉末。
2.根据权利要求1所述的一种新Iota卡拉胶寡糖的制备方法，其特征在于所述的Iota卡拉胶酶与步骤1溶解的Iota卡拉胶溶液体积比为1:42。
3.根据权利要求1所述的一种新Iota卡拉胶寡糖的制备方法，其特征在于所述Iota卡拉胶酶通过如下步骤制备：
（1）培养活化：将筛选的Cellulophaga sp.QY201菌种先接种于液体培养基中，接种量为1%-3%，于20-30℃、60-100rpm/min摇床培养30-40h，进行培养活化，得到粗酶液；
（2）丙酮沉淀粗分离：在粗酶液中缓慢加入2-3倍体积的丙酮，静置3-5min，4℃下8000-10000r/min冷冻离心20-30min，弃去上清，沉淀溶于20mmol/L pH10的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液，透析过夜，4℃下8000-10000r/min冷冻离心20-30min，取上清液；
（3）离子交换层析：将步骤（2）得到的上清液于DEAE Sepharose Fast Flow柱进行离子交换层析，流动相为NaCl，收集活性组分；
（4）凝胶过滤层析：将离子交换层析得到的活性成分进行凝胶过滤层析，凝胶柱为Superdex 75，流动相为20mmol/L pH10的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液，收集活性组分，浓缩为高活性Iota卡拉胶酶液。
4.根据权利要求3所述的一种新Iota卡拉胶寡糖的制备方法，其特征在于所述液体培养基由以下质量百分比的组分组成：3%NaCl、0.5% MgSO4·7H2O、0.02%CaCl2、0.01%KCl、0.002%FeSO4、0.25%CaSein、0.15%NaH2PO4、0.2%NaNO3、0.25%Iota卡拉胶。
5.按权利要求1-4所述工艺制备的新Iota卡拉胶寡糖。
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