CN103898013A - 一株海旋菌及κ-卡拉胶酶的制备 - Google Patents
一株海旋菌及κ-卡拉胶酶的制备 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103898013A CN103898013A CN201410093130.4A CN201410093130A CN103898013A CN 103898013 A CN103898013 A CN 103898013A CN 201410093130 A CN201410093130 A CN 201410093130A CN 103898013 A CN103898013 A CN 103898013A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- kappa
- enzyme
- strain
- carrageenan
- bacterium
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 9
- 241000929593 Thalassospira sp. Species 0.000 title abstract 2
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 20
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 4
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims abstract description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 47
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 47
- ZNOZWUKQPJXOIG-XSBHQQIPSA-L [(2r,3s,4r,5r,6s)-6-[[(1r,3s,4r,5r,8s)-3,4-dihydroxy-2,6-dioxabicyclo[3.2.1]octan-8-yl]oxy]-4-[[(1r,3r,4r,5r,8s)-8-[(2s,3r,4r,5r,6r)-3,4-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-5-sulfonatooxyoxan-2-yl]oxy-4-hydroxy-2,6-dioxabicyclo[3.2.1]octan-3-yl]oxy]-5-hydroxy-2-( Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](OS([O-])(=O)=O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H]2OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](CO)O[C@@H](O[C@@H]3[C@@H]4OC[C@H]3O[C@H](O)[C@@H]4O)[C@@H]1O)OS([O-])(=O)=O)[C@@H]2O ZNOZWUKQPJXOIG-XSBHQQIPSA-L 0.000 claims description 39
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 37
- 229920001525 carrageenan Polymers 0.000 claims description 27
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 20
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 16
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 14
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims description 13
- 238000013016 damping Methods 0.000 claims description 12
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 12
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 10
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims description 10
- 229910017053 inorganic salt Inorganic materials 0.000 claims description 9
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 claims description 8
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims description 8
- 239000012452 mother liquor Substances 0.000 claims description 8
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 claims description 8
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 7
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 claims description 6
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 6
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 6
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims description 6
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 6
- DPDMMXDBJGCCQC-UHFFFAOYSA-N [Na].[Cl] Chemical compound [Na].[Cl] DPDMMXDBJGCCQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 claims description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 4
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 claims description 4
- 239000012564 Q sepharose fast flow resin Substances 0.000 claims description 3
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 claims description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 3
- 238000011033 desalting Methods 0.000 claims description 3
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 claims description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 3
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 claims description 3
- 239000012535 impurity Substances 0.000 claims description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 3
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 claims description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 3
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims description 3
- 238000000825 ultraviolet detection Methods 0.000 claims description 3
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 claims 2
- 238000005303 weighing Methods 0.000 claims 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 abstract description 5
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 abstract description 5
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 abstract description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 2
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 abstract 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 abstract 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 abstract 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 abstract 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 abstract 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 abstract 1
- 238000005185 salting out Methods 0.000 abstract 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 abstract 1
- 235000010418 carrageenan Nutrition 0.000 description 20
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 6
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 6
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 5
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 5
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 4
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 4
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229940113118 carrageenan Drugs 0.000 description 2
- 239000000679 carrageenan Substances 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 238000012797 qualification Methods 0.000 description 2
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 2
- 239000013535 sea water Substances 0.000 description 2
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000000052 vinegar Substances 0.000 description 2
- 235000021419 vinegar Nutrition 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 241000206576 Chondrus Species 0.000 description 1
- 244000050510 Cunninghamia lanceolata Species 0.000 description 1
- 241000605056 Cytophaga Species 0.000 description 1
- 241001148513 Cytophaga sp. Species 0.000 description 1
- 241000900541 Delesseria sanguinea Species 0.000 description 1
- 241001428166 Eucheuma Species 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 241000801118 Lepidium Species 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 241000590033 Pseudoalteromonas carrageenovora Species 0.000 description 1
- 241001116675 Pseudoalteromonas porphyrae Species 0.000 description 1
- 241000206572 Rhodophyta Species 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 241000719329 Trentepohlia Species 0.000 description 1
- 241000607598 Vibrio Species 0.000 description 1
- 241000588902 Zymomonas mobilis Species 0.000 description 1
- 108010045649 agarase Proteins 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 230000010100 anticoagulation Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- -1 carrageenan oligosaccharide Chemical class 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 238000002144 chemical decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 125000000600 disaccharide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 125000001033 ether group Chemical group 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 229960003082 galactose Drugs 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 229910052602 gypsum Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010440 gypsum Substances 0.000 description 1
- 230000036737 immune function Effects 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 238000005498 polishing Methods 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000012882 sequential analysis Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L sulfate group Chemical group S(=O)(=O)([O-])[O-] QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- UHVMMEOXYDMDKI-JKYCWFKZSA-L zinc;1-(5-cyanopyridin-2-yl)-3-[(1s,2s)-2-(6-fluoro-2-hydroxy-3-propanoylphenyl)cyclopropyl]urea;diacetate Chemical compound [Zn+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O.CCC(=O)C1=CC=C(F)C([C@H]2[C@H](C2)NC(=O)NC=2N=CC(=CC=2)C#N)=C1O UHVMMEOXYDMDKI-JKYCWFKZSA-L 0.000 description 1
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
本发明涉及一株海旋菌（Thalassospirasp.）fjfst-332，已于2013年12月25日在中国典型培养物保藏中心登记保藏，其保藏号为CCTCCM2013706，以及用该菌株发酵制备κ-卡拉胶酶的方法。本发明以该菌株作为菌种，采用碳源、氮源、无机盐组成的发酵培养基，在优化后的培养条件下，κ-卡拉胶酶的活力达到80.6U/ml。发酵液通过硫酸铵盐析，离心收集沉淀，后进行透析，取透析液过离子交换柱及凝胶柱，冷冻干燥即可获得κ-卡拉胶酶干粉。
Description
技术领域
本发明属于生物化工领域，涉及一株海旋菌及κ-卡拉胶酶的制备方法。
背景技术
卡拉胶是由1,3-β-D-吡喃半乳糖和1,4-α-D-吡喃半乳糖作为基本骨架，交替连接而成的硫酸线性多糖,主要存在于红藻纲中的麒麟菜属、角叉菜属、杉藻属和沙菜属等的细胞壁中。根据其二糖单元上所含的硫酸基团的数量和内醚环的有无,可将卡拉胶分为κ-、ι-、γ-、λ-、ξ-、ω-和ν-卡拉胶等类型,工业生产和使用的主要为κ-卡拉胶、ι-卡拉胶和λ-卡拉胶3种。
卡拉胶是一种海藻硫酸半乳匀多糖，通过化学或生物手段降解和修饰后，获得的半乳低聚糖硫酸醋及其衍生物具有多种生物活性如抗病毒、抗肿瘤、抗凝血等，对人体的细胞免疫和体液免疫功能也具有显著的增强作用。研究显示，卡拉胶及其低聚糖的生物学活性与分子量大小和硫酸根含量密切相关，一般认为，多糖分子量在5000-60000范围具有明显的生物活性，因此经降解后得到的卡拉胶低聚糖硫酸酷有可能成为新型海洋药物的重要来源。
卡拉胶酶主要来源于假单胞菌Pseudomonas、噬纤维菌Cytophaga、弧菌Vibrio、别单胞菌Alteromonas等。目前利用卡拉胶制备半乳低聚糖硫酸醋的方法主要依赖于化学法。由于化学降解方法存在反应条件不易控制、降解产率低、目的产物不易分离等无法克服的缺点，而酶解法可以最大程度地保护反应底物的活性基团不会在降解过程中受到破坏，从而为药源开发奠定了良好的基础。因此，通过从海藻物质或海洋生物中筛选可以产生卡拉胶酶的细菌成为了国内外的科技工作者的主要方向。
用微生物法获得卡拉胶酶的研究已经有30余年的研究历史，但迄今为止，仅有为数不多的几种微生物被发现具有生物法制备卡拉胶酶的功能，包括Pseudomonas carrageenovora(MeLean M W et.Journal of Biotechnology,1979)、Cytophaga sp.lk一C783(Sarwar G et.Journal of Biotechnology,1987)、Delesseria sanguinea（Potin P et.Biotechnology and Bioengineering ,1991）、Pseudoalteromonas carrageenovora (Miehel G et.Journal of Fermentation and Bioengineering,1999)、Pseudoalteromonas porphyrae(刘光磊，等海洋微生物多糖水解酶的基因克隆和高效表达，2012)等。因此筛选新的微生物菌种进行酶解法降解卡拉胶成为研究者的新任务。
发明内容
本发明的目的是提供一株能高效降解κ-卡拉胶的菌株并用其制备κ-卡拉胶酶的方法。
本发明的技术方案：一株筛选自卡拉胶加工厂废石膏的细菌，可用于生产κ-卡拉胶降解酶，其命名为海旋菌（Thalassospira sp.）fjfst-332，已于2013年12月25日在中国典型培养物保藏中心登记保藏，其保藏号为CCTCC M 2013706，保藏地址为武汉大学。
微生物菌株的筛选及鉴定：
本发明从卡拉胶加工厂取卡拉胶废渣进行卡拉胶降解菌的筛选。将卡拉胶废渣用海水（3%海盐配置）浸泡2d，取上清液加入富集培养基中5℃，160r/min摇床培养3d后，重复操作3次，取0.1ml富集培养也涂布初筛分离培养基28℃倒置培养48h，挑取周围形成明显透明圈和凹坑的菌落划线初筛培养基，培养48h后，挑取单菌落移接传代培养基斜面，获得卡拉胶降解菌纯培养。纯种接到发酵培养液种32℃，160r/min培养2d后检测培养液中κ-卡拉胶酶的活力，最终筛选出目标菌株B-332对其进行生理生化鉴定和16s rDNA序列分析，确定其为海旋菌（Thalassospira sp.），拟命名为海旋菌（Thalassospira sp.）fjfst-332。
用所述的海旋菌（Thalassospira sp.）fjfst-332生产κ-卡拉胶酶的方法步骤包括如下：
① 将海旋菌（Thalassospira sp.）fjfst-332接种到产酶培养基中，250ml三角瓶装30ml产酶培养基，按常规方法灭菌、冷却并接种菌落，32℃、160r/min摇床培养24h后，取1ml培养液再次接种产酶培养基，32℃、160r/min摇床培养56h，发酵液离心（5000r/min,10min）去除沉淀，取上清液；
② 用250ml三角瓶装20ml只含质量分数为0.5% κ-卡拉胶底物的培养基，按常规方法灭菌、冷却并接种1ml上清发酵酶液，于32℃反应1h，得到含κ-卡拉胶酶的发酵液；
③ 将发酵培养基经过4℃，8000-10000g冷冻离心10-20min之后，取上清液；
④ 将上清液加入质量分数为60%-80%的饱和硫酸铵，加入后继续搅拌1h，放置冰箱沉降过夜，4℃，8000-10000g离心20-40min取沉淀；
⑤ 沉淀置于蒸馏水中透析48h，冷冻干燥后得到粗酶粉，-20℃保存；
⑥ 粗酶用0.02mo/L pH7.5的Tris-HCI缓冲液溶解，滤纸过滤除去不溶性杂质，经阴离子交换色谱Q-sepharose Fast Flow分离，用含有0.1~0.6mol/L NaCI的0.05mol/L pH7.2的Tris-HCI缓冲液进行连续梯度洗脱，流速为1.2ml/min，于280nm检测洗脱液中的蛋白质含量，分布收集洗脱液，4.5ml/管，测定峰位的酶活；
⑦ 将试管中有活性的部分合并进行冷冻干燥，即成κ-卡拉胶酶半成品；
⑧ 将Sephcryl S-100凝胶过滤层析柱（φ1.6cm*80cm）用缓冲液（0.02mol/L，pH7.5的Tris-HCl）平衡后，秤取κ-卡拉胶酶半成品0.05g溶于4mL平衡缓冲液中，6000g低温离心20min后取上清液上层析柱。用缓冲液（0.02mol/L，pH7.5的Tris-HCl）进行洗脱，控制流速为0.1ml/min，洗脱液经紫外检测并分部收集，4ml/管，分别测定出峰部分试管的酶活，将有活力的部分合并，经充分透析脱盐后，超滤膜浓缩，对浓缩液冷冻干燥，得到κ-卡拉胶酶成品。
所述产酶培养基：氯化钠15g、κ-卡拉胶2g、酵母膏1g、无机盐母液100ml、水900ml、pH7.5，其中无机盐母液：NaNO3 20g、MgSO4.7H2O 5g、K2HPO4 10g、CaC12 lg、蒸馏水1L。
步骤②所述培养基：κ-卡拉胶5g，蒸馏水1000ml，pH7.5。
用该方法生产的κ-卡拉胶酶的检测方法：
取步骤③得到含有κ-卡拉胶酶的发酵液上清液1mL，加入20mL的卡拉胶底物（其中含有0.5%卡拉胶），置于32℃酶解1h，后加入1.0mLDNS，沸水浴5min。冷却至室温后，用蒸馏水补齐刻度，使用分光光度计在540nm下进行检测。1U定义为1min产生1ug卡拉胶寡糖的值。
本发明的有益效果：
① 新筛选出一株能高效生产κ-卡拉胶酶的菌株，分类命名为海旋菌（Thalassospira sp.）fjfst-332。
② 本发明以该菌作为菌种，以常见碳源，氮源，无机盐组成的发酵培养基，可以在48-60h内达到最大酶产量，酶活为80.6U/ml。
具体实施方式
以下是说明本发明的具体实施例，但本发明并不限于此。
实施例1
取自卡拉胶加工厂的卡拉胶废渣进行卡拉胶降解菌的筛选。将卡拉胶废渣用海水（3%海盐配置）浸泡2d，取上清液加入富集培养基中5℃，160r/min摇床培养3d后，重复操作3次，取0.1ml富集培养也涂布初筛分离培养基28℃倒置培养48h，挑取周围形成明显透明圈和凹坑的菌落划线初筛培养基，培养48h后，挑取单菌落移接传代培养基斜面，获得卡拉胶降解菌纯培养。纯种接到发酵培养液种32℃，160r/min培养2d后检测培养液中κ-卡拉胶酶的活力，最终筛选出目标菌株B-332。
实施例2
经形态学和生理生化特性研究，B-332菌株的特征如下：
菌落形态：菌落呈现圆形，表面凹陷、粘连，边缘整齐。
细胞形态：此为革兰氏阴性菌，形态为杆状。
生理生化特征：为需氧菌，分解葡萄糖，乳糖及蔗糖，能液化明胶。
对该菌株的16S rRNA基因进行PCR扩增与序列测定，发现其16S rRNA的基因部分片断长度为1487bp，经过NCBI和核糖体数据库进行比对，鉴定为海旋菌（Thalassospira sp.），拟命名为海旋菌（Thalassospira sp.）fjfst-332，菌株的16S rRNA序列具体可见序列表。
实施例3
① 将海旋菌（Thalassospira sp.）fjfst-332接种到产酶培养基中，250ml三角瓶装30ml产酶培养基，按常规方法灭菌、冷却并接种菌落，32℃、160r/min摇床培养24h后，取1ml培养液再次接种产酶培养基，32℃、160r/min摇床培养56h。发酵液离心（5000r/min,10min）去除沉淀，取上清液。所述产酶培养基:氯化钠15g、κ-卡拉胶2g、酵母膏1g、无机盐母液100ml、水900ml、pH7.5。
② [无机盐母液:NaNO3 20g、MgSO4.7H2O 5g、K2HPO4 10g、CaC12 lg;蒸馏水1L]。
③ 用250ml三角瓶装20ml只含质量分数为0.5%κ-卡拉胶底物的培养基，按常规方法灭菌、冷却并接种1ml上清发酵酶液。于32℃反应1h，得到含κ-卡拉胶酶的发酵液并测其酶活。所述培养基：κ-卡拉胶5g，蒸馏水1000ml，pH7.5。
该实施例所得的琼胶酶的活力为80.6U/mL。
实施例4
①. 将海旋菌（Thalassospira sp）fjfst-332接种到产酶培养基中，250ml三角瓶装30ml产酶培养基，按常规方法灭菌、冷却并接种菌落，32℃、160r/min摇床培养24h后，取1ml培养液再次接种产酶培养基，32℃、160r/min摇床培养56h，发酵液离心（5000r/min,10min）去除沉淀，取上清液。所述产酶培养基:氯化钠15g、κ-卡拉胶2g、酵母膏1g、无机盐母液100ml、水900ml、pH7.5。
无机盐母液:NaNO3 20g、MgSO4.7H2O 5g、K2HPO4 10g、CaC12 lg、蒸馏水1L。
②. 用250ml三角瓶装20ml只含质量分数为0.5%κ-卡拉胶底物的培养基，按常规方法灭菌、冷却并接种1ml上清发酵酶液，于32℃反应1h，得到含κ-卡拉胶酶的发酵液，所述培养基：κ-卡拉胶5g，蒸馏水1000ml，pH7.5。
③. 将发酵培养基经过4℃，8000-10000g冷冻离心10-20min之后，取上清液。
④. 将上清液加入质量分数为60%-80%的饱和硫酸铵，加入后继续搅拌1h，放置冰箱沉降过夜，4℃，8000-10000g离心20-40min取沉淀；
⑤. 沉淀置于蒸馏水中透析48h，冷冻干燥后得到粗酶粉，-20℃保存；
⑥. 粗酶用0.02mo/L pH7.5的Tris-HCI缓冲液溶解，滤纸过滤除去不溶性杂质，经阴离子交换色谱Q-sepharose Fast Flow分离，用含有0.1~0.6mol/L NaCI的0.05mol/L pH7.2的Tris-HCI缓冲液进行连续梯度洗脱，流速为1.2ml/min，于280nm检测洗脱液中的蛋白质含量，分布收集洗脱液，4.5ml/管，测定峰位的酶活；
⑦. 将试管中有活性的部分合并进行冷冻干燥，即成κ-卡拉胶酶半成品。
⑧. 将Sephcryl S-100凝胶过滤层析柱（φ1.6cm*80cm）用缓冲液（0.02mol/L，pH7.5的Tris-HCl）平衡后，秤取κ-卡拉胶酶半成品0.05g溶于4mL平衡缓冲液中，6000g低温离心20min后取上清液上层析柱。用缓冲液（0.02mol/L，pH7.5的Tris-HCl）进行洗脱，控制流速为0.1ml/min。洗脱液经紫外检测并分部收集（4ml/管），分别测定出峰部分试管的酶活，将有活力的部分合并，经充分透析脱盐后，超滤膜浓缩，对浓缩液冷冻干燥，得到κ-卡拉胶酶成品。
SEQUENCE LISTING
<110> 福建农林大学
<120> 一株海旋菌及κ-卡拉胶酶的制备
<130> 1
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1516
<212> DNA
<213> 16s rDNA序列
<400> 1
cagagtttga tcctggctca gaacgaacgc tggcggcagg cctaacacat gcaagtcgga 60
cgagaaggtt ccttcgggaa ctggagagtg gcgcacgggt gagtaacgcg tggggaccta 120
cctcttagtg ggggataacg gttggaaacg accgctaata ccgcatacgc ccttcggggg 180
aaagatttat cgctaagaga tggacccgcg ttggattaga tagttggtga ggtaacggct 240
caccaagtca gcgatccata gctggtttga gaggatgatc agccacactg ggactgagac 300
acggcccaga ctcctacggg aggcagcagt ggggaatatt ggacaatggg ggcaaccctg 360
atccagccat gccgcgtgag tgaagaaggc cttcgggttg taaagctctt tcagatgcga 420
agatgatgac ggtaacatca gaagaagccc cggctaattt cgtgccagca gccgcggtaa 480
tacgaaaggg gctagcgttg ttcggattta ctgggcgtaa agggcacgca ggcggtcttg 540
ccagtcaggg gtgaaagccc ggggctcaac cccggaactg cctctgatac tgcaagacta 600
gagactagga gagggtggtg gaattcccag tgtagaggtg aaattcgtag atattgggag 660
gaacaccaga ggcgagggcg gccacctgga ctagatctga cgctcaggtg cgaaagcgtg 720
gggagcaaac aggattagat accctggtag tccacgccgt aaacgatgag tgctagttgt 780
cgggacttcg gtttcggtga cgcagctaac gcattaagca ctccgcctgg ggagtacggt 840
cgcaagatta aaactcaaag gaattgacgg gggcccgcac aagcggtgga gcatgtggtt 900
taattcgaag caacgcgcag aaccttacca acccttgaca tccctatcgc gattaccaga 960
gacggttttc atcagttcgg ctggataggt gacaggtgct gcatggctgt cgtcagctcg 1020
tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac ccctgttccc agttgccagc 1080
atttagctgg gcactctggg gagactgccg gtgacaagcc ggaggaaggc ggggatgacg 1140
tcaagtcctc atggccctta cgggttgggc tacacacgtg ctacaatggt aactacagag 1200
ggcagcgact tagcgataag gagccaatcc caaaaagtta tctcagttcg gattgcactc 1260
tgcaactcga gtgcatgaag ttggaatcgc tagtaatcgt ggatcagcat gccacggtga 1320
atacgttccc gggccttgta cacaccgccc gtcacaccat gggagttggt tttacccgaa 1380
gacggtgggc taacctttta ggaggcagcc ggccacggta aggtcagcga ctggggtgaa 1440
gtcgtaacaa ggtagccgta ggggaacctg cggctggatc acctccttag gggaacctgc 1500
ggctggatca cctcct 1516
Claims (6)
1.一株海旋菌，其特征在于：所述菌株为海旋菌（Thalassospira sp.）fjfst-332，已于2013年12月25日在中国典型培养物保藏中心登记保藏，其保藏号为CCTCC M 2013706。
2.根据权利要求1所述的一株海旋菌，其特征在于：所述海旋菌（Thalassospira sp.）fjfst-332的16S rRNA序列如SEQ ID NO.1所示。
3.一株如权利要求1所述的一株海旋菌的用途，其特征在于：用于制备κ-卡拉胶酶。
4.一株如权利要求1所述的一株海旋菌用于制备κ-卡拉胶酶的方法，其特征在于：包括如下步骤：
①. 将海旋菌（Thalassospira sp）fjfst-332接种到产酶培养基中，250ml三角瓶装30ml产酶培养基，按常规方法灭菌、冷却并接种菌落，32℃、160r/min摇床培养24h后，取1ml培养液再次接种产酶培养基，32℃、160r/min摇床培养56h，发酵液5000r/min离心,10min去除沉淀，取上清液；
②. 用250ml三角瓶装20ml只含质量分数为0.5%κ-卡拉胶底物的培养基，按常规方法灭菌、冷却并接种1ml上清发酵酶液，于32℃反应1h，得到含κ-卡拉胶酶的发酵液，所述培养基：κ-卡拉胶5g，蒸馏水1000ml，PH7.5；
③. 将发酵培养基经过4℃，8000-10000g冷冻离心10-20min之后，取上清液；
④. 将上清液加入质量分数为60%-80%的饱和硫酸铵，加入后继续搅拌1h，放置冰箱沉降过夜，4℃，8000-10000g离心20-40min取沉淀；
⑤. 沉淀置于蒸馏水中透析48h，冷冻干燥后得到粗酶粉，-20℃保存；
⑥. 粗酶用0.02mo/L pH7.5的Tris-HCI缓冲液溶解，滤纸过滤除去不溶性杂质，经阴离子交换色谱Q-sepharose Fast Flow分离，用含有0.1~0.6mol/L NaCI的0.05mol/L pH7.2的Tris-HCI缓冲液进行连续梯度洗脱，流速为1.2ml/min，于280nm检测洗脱液中的蛋白质含量，分布收集洗脱液，4.5ml/管，测定峰位的酶活；
⑦. 将试管中有活性的部分合并进行冷冻干燥，即成κ-卡拉胶酶半成品；
⑧. 将Sephcryl S-100凝胶过滤层析柱用0.02mol/L，pH7.5的Tris-HCl缓冲液平衡后，秤取κ-卡拉胶酶半成品0.05g溶于4mL平衡缓冲液中，6000g低温离心20min后取上清液上层析柱，用0.02mol/L，pH7.5的Tris-HCl缓冲液进行洗脱，控制流速为0.1ml/min，洗脱液经紫外检测并分部收集，4ml/管，分别测定出峰部分试管的酶活，将有活力的部分合并，经充分透析脱盐后，超滤膜浓缩，对浓缩液冷冻干燥，得到κ-卡拉胶酶成品。
5.根据权利要求4所述的一株绿脓杆菌用于制备κ-卡拉胶酶的方法，其特征在于：所述产酶培养基：氯化钠15g、κ-卡拉胶2g、酵母膏1g、无机盐母液100ml、水900ml、pH7.5，其中无机盐母液：NaNO3 20g、MgSO4.7H2O 5g、K2HPO4 10g、CaC12 lg、蒸馏水1L。
6.根据权利要求4所述的一株绿脓杆菌用于制备κ-卡拉胶酶的方法，其特征在于：步骤②所述培养基：κ-卡拉胶5g，蒸馏水1000ml，pH7.5。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410093130.4A CN103898013B (zh) | 2014-03-14 | 2014-03-14 | 一株海旋菌及κ-卡拉胶酶的制备 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410093130.4A CN103898013B (zh) | 2014-03-14 | 2014-03-14 | 一株海旋菌及κ-卡拉胶酶的制备 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103898013A true CN103898013A (zh) | 2014-07-02 |
| CN103898013B CN103898013B (zh) | 2015-12-02 |
Family
ID=50989591
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201410093130.4A Active CN103898013B (zh) | 2014-03-14 | 2014-03-14 | 一株海旋菌及κ-卡拉胶酶的制备 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103898013B (zh) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105483100A (zh) * | 2016-01-13 | 2016-04-13 | 福建农林大学 | 一种诱导海洋微生物发酵产κ-卡拉胶酶的组合诱导物 |
| CN106047855A (zh) * | 2016-08-22 | 2016-10-26 | 福建农林大学 | 一种固定化菌及其制备κ‑卡拉胶寡糖的方法 |
| CN106281966A (zh) * | 2016-08-22 | 2017-01-04 | 福建农林大学 | 一种高效生产κ‑卡拉胶低聚糖的生物反应器及其应用 |
| CN109439709A (zh) * | 2018-11-21 | 2019-03-08 | 青岛博智汇力生物科技有限公司 | 一种新Iota卡拉胶寡糖的制备方法 |
| CN113930358A (zh) * | 2021-09-29 | 2022-01-14 | 中国科学院海洋研究所 | 一种可分解海带的菌株 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101691556A (zh) * | 2009-09-25 | 2010-04-07 | 中国科学院南海海洋研究所 | 一种深海海旋菌及其应用 |
| CN101918437A (zh) * | 2007-11-21 | 2010-12-15 | 罗斯基勒大学 | 具有冰结合活性的多肽 |
| CN103555753A (zh) * | 2013-10-29 | 2014-02-05 | 中国海洋大学 | 一种胞外分泌表达κ-卡拉胶酶的重组菌构建方法及其应用 |
-
2014
- 2014-03-14 CN CN201410093130.4A patent/CN103898013B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101918437A (zh) * | 2007-11-21 | 2010-12-15 | 罗斯基勒大学 | 具有冰结合活性的多肽 |
| CN101691556A (zh) * | 2009-09-25 | 2010-04-07 | 中国科学院南海海洋研究所 | 一种深海海旋菌及其应用 |
| CN103555753A (zh) * | 2013-10-29 | 2014-02-05 | 中国海洋大学 | 一种胞外分泌表达κ-卡拉胶酶的重组菌构建方法及其应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| WEBB,H.K: "Thalassospira sp. H94 16S ribosomal RNA gene, partial sequence", 《GENBANK: FJ903195.1》, 4 May 2009 (2009-05-04) * |
| XUE SUN ET AL: "Isolation and identification of two strains of pathogenic bacteria and their effects on the volatile metabolites of Gracilariopsis lemaneiformis (Rhodophyta)", 《J APPL PHYCOL》, vol. 24, 31 December 2012 (2012-12-31), pages 277 - 284 * |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105483100A (zh) * | 2016-01-13 | 2016-04-13 | 福建农林大学 | 一种诱导海洋微生物发酵产κ-卡拉胶酶的组合诱导物 |
| CN105483100B (zh) * | 2016-01-13 | 2019-08-13 | 福建农林大学 | 一种诱导海洋微生物发酵产κ-卡拉胶酶的组合诱导物 |
| CN106047855A (zh) * | 2016-08-22 | 2016-10-26 | 福建农林大学 | 一种固定化菌及其制备κ‑卡拉胶寡糖的方法 |
| CN106281966A (zh) * | 2016-08-22 | 2017-01-04 | 福建农林大学 | 一种高效生产κ‑卡拉胶低聚糖的生物反应器及其应用 |
| CN106281966B (zh) * | 2016-08-22 | 2018-11-23 | 福建农林大学 | 一种高效生产κ-卡拉胶低聚糖的生物反应器及其应用 |
| CN109439709A (zh) * | 2018-11-21 | 2019-03-08 | 青岛博智汇力生物科技有限公司 | 一种新Iota卡拉胶寡糖的制备方法 |
| CN113930358A (zh) * | 2021-09-29 | 2022-01-14 | 中国科学院海洋研究所 | 一种可分解海带的菌株 |
| CN113930358B (zh) * | 2021-09-29 | 2023-05-30 | 中国科学院海洋研究所 | 一种可分解海带的菌株 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103898013B (zh) | 2015-12-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Zaky et al. | Marine yeast isolation and industrial application | |
| CN103898013B (zh) | 一株海旋菌及κ-卡拉胶酶的制备 | |
| CN107354188A (zh) | 大肠埃希氏菌JL‑GlcN发酵生产N‑乙酰氨基葡萄糖的工艺 | |
| CN102174433B (zh) | 一株高抗逆性贝氏梭菌及其应用 | |
| CN101591628B (zh) | 琼氏不动杆菌x8及其在制备褐藻胶裂解酶中的应用 | |
| CN104046586B (zh) | 一株基因工程菌及其在生产(2r,3r)-2,3-丁二醇中的应用 | |
| CN103305496A (zh) | 一种微生物发酵提取硫酸软骨素酶的方法 | |
| CN103923853B (zh) | 一株类芽孢杆菌及其用于κ-卡拉胶酶的制备方法 | |
| CN103865850B (zh) | 一株蝙蝠弧菌及制备琼胶酶的方法 | |
| CN103898012B (zh) | 一株海旋菌及制备琼胶酶的方法 | |
| CN105349461A (zh) | 一株产琼胶酶溶藻弧菌及应用 | |
| CN102102095B (zh) | 一种利用海洋链霉菌发酵制备溶菌酶的方法 | |
| CN111826308B (zh) | 一株海洋沉积物来源的几丁质高效降解菌及其应用 | |
| CN103865851B (zh) | 一株绿脓杆菌用于κ-卡拉胶酶的制备 | |
| CN104724883A (zh) | 一种将污水中氮磷进行资源化利用的方法 | |
| CN105274041B (zh) | 一株重组大肠杆菌及其在生产2-丁醇中的应用 | |
| CN103898014B (zh) | 一株德沃斯氏菌的筛选及κ-卡拉胶酶的制备 | |
| CN102433289B (zh) | 一株产瓜氨酸的菌株及用该菌株生物合成瓜氨酸的方法 | |
| CN112143681B (zh) | 一株可产阿魏酸酯酶的贝莱斯芽孢杆菌及其应用 | |
| CN105087450A (zh) | 一株海洋细菌及其产生的胞外多糖 | |
| CN102399823A (zh) | 一种提取生物絮凝剂的方法 | |
| CN105087427B (zh) | 产琼胶酶的需钠弧菌及其应用 | |
| CN104774794A (zh) | 一株产d-甘露糖异构酶的菌株及用其生产d-甘露糖的方法 | |
| Szymanowska-Powałowska et al. | Microbial purification of postfermentation medium after 1, 3-PD production from raw glycerol | |
| CN107988109B (zh) | 一种黄杆菌突变株及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| TR01 | Transfer of patent right | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20201119 Address after: Room 1609, Jian'an building, No. 3, Section 1, Wanjiali Middle Road, Martian street, Furong district, Changsha City, Hunan Province Patentee after: Changsha liuteng Technology Co.,Ltd. Address before: Cangshan District of Fuzhou City, Fujian province 350002 to build a new town, Jinshan District Patentee before: FUJIAN AGRICULTURE AND FORESTRY University |
|
| TR01 | Transfer of patent right | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20201204 Address after: No.25-1, Gangcheng Road, dongyinggang Economic Development Zone, Hekou District, Dongying City, Shandong Province Patentee after: Shandong Xingqiang Chemical Industry Technology Research Institute Co.,Ltd. Address before: Room 1609, Jian'an building, No. 3, Section 1, Wanjiali Middle Road, Martian street, Furong district, Changsha City, Hunan Province Patentee before: Changsha liuteng Technology Co.,Ltd. |
|
| TR01 | Transfer of patent right | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20231030 Address after: Room 707, No. 15 Gangcheng Road, Dongying Port Economic Development Zone, Dongying City, Shandong Province, 257237 Patentee after: Shandong Industry Research Institute Zhongke High-end Chemical Industry Technology Research Institute Co.,Ltd. Address before: No.25-1, Gangcheng Road, dongyinggang Economic Development Zone, Hekou District, Dongying City, Shandong Province Patentee before: Shandong Xingqiang Chemical Industry Technology Research Institute Co.,Ltd. |