CN103865851B - 一株绿脓杆菌用于κ-卡拉胶酶的制备 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一株绿脓杆菌（<i>Pseudomonas？</i>sp.）fjfst-331，已于2013年12月25日在中国典型培养物保藏中心登记保藏，其保藏号为CCTCC？M？2013705，以及用该菌株发酵制备κ-卡拉胶酶的方法。本发明以该菌株作为菌种，采用碳源、氮源、无机盐组成的发酵培养基，在优化后的培养条件下，κ-卡拉胶酶的活力达到70.39U/ml。发酵液通过硫酸铵盐析，离心收集沉淀，后进行透析，取透析液过离子交换柱及凝胶柱，冷冻干燥即可获得κ-卡拉胶酶干粉。
Description
技术领域
本发明属于生物化工领域，涉及一株绿脓杆菌用于κ-卡拉胶酶的制备方法。
背景技术
卡拉胶是由1,3-β-D-吡喃半乳糖和1,4-α-D-吡喃半乳糖作为基本骨架，交替连接而成的硫酸线性多糖，主要存在于红藻纲中的麒麟菜属、角叉菜属、杉藻属和沙菜属等的细胞壁中。根据其二糖单元上所含的硫酸基团的数量和内醚环的有无，可将卡拉胶分为κ-、ι-、γ-、λ-、ξ-、ω-和ν-卡拉胶等类型,工业生产和使用的主要为κ-卡拉胶、ι-卡拉胶和λ-卡拉胶3种。
卡拉胶是一种海藻硫酸半乳匀多糖，通过化学或生物手段降解和修饰后，获得的半乳低聚糖硫酸醋及其衍生物具有多种生物活性如抗病毒、抗肿瘤、抗凝血等，对人体的细胞免疫和体液免疫功能也具有显著的增强作用。研究显示，卡拉胶及其低聚糖的生物学活性与分子量大小和硫酸根含量密切相关，一般认为，多糖分子量在5000-60000范围具有明显的生物活性，因此经降解后得到的卡拉胶低聚糖硫酸酷有可能成为新型海洋药物的重要来源。
卡拉胶酶主要来源于假单胞菌Pseudomonas、噬纤维菌Cytophaga、弧菌Vibrio、别单胞菌Alteromonas等。目前利用卡拉胶制备半乳低聚糖硫酸醋的方法主要依赖于化学法。由于化学降解方法存在反应条件不易控制、降解产率低、目的产物不易分离等无法克服的缺点，而酶解法可以最大程度地保护反应底物的活性基团不会在降解过程中受到破坏，从而为药源开发奠定了良好的基础。因此，通过从海藻物质或海洋生物中筛选可以产生卡拉胶酶的细菌成为了国内外的科技工作者的主要方向。
用微生物法获得卡拉胶酶的研究已经有30余年的研究历史，但迄今为止，仅有为数不多的几种微生物被发现具有生物法制备卡拉胶酶的功能，包括Pseudomonascarrageenovora(MeLeanMWet.JournalofBiotechnology,1979)、Cytophagasp.lk一C783(SarwarGet.JournalofBiotechnology,1987)、Delesseriasanguinea（PotinPet.BiotechnologyandBioengineering,1991）、Pseudoalteromonascarrageenovora(MiehelGet.JournalofFermentationandBioengineering,1999)、Pseudoalteromonasporphyrae(刘光磊，等海洋微生物多糖水解酶的基因克隆和高效表达，2012)等。因此筛选新的微生物菌种进行酶解法降解卡拉胶成为研究者的新任务。
发明内容
本发明的目的是提供一株能高效降解κ-卡拉胶的新菌株并用其制备κ-卡拉胶酶的方法。
本发明的技术方案：一株筛选自卡拉胶加工厂废石膏的细菌，可用于生产κ-卡拉胶降解酶，其命名为绿脓杆菌（Pseudomonassp.）fjfst-331，已于2013年12月25日在中国典型培养物保藏中心登记保藏，其保藏号为CCTCCM2013705，保藏地址为武汉大学。
微生物菌株的筛选及鉴定：
本发明从卡拉胶加工厂取卡拉胶废渣进行卡拉胶降解菌的筛选。将卡拉胶废渣用海水（3%海盐配置）浸泡2d，取上清液加入富集培养基中5℃，160r/min摇床培养3d后，重复操作3次，取0.1ml富集培养也涂布初筛分离培养基28℃倒置培养48h，挑取周围形成明显透明圈和凹坑的菌落划线初筛培养基，培养48h后，挑取单菌落移接传代培养基斜面，获得卡拉胶降解菌纯培养。纯种接到发酵培养液种32℃，160r/min培养2d后检测培养液中κ-卡拉胶酶的活力，最终筛选出目标菌株B-331对其进行生理生化鉴定和16srDNA序列分析，确定其为绿脓杆菌（Pseudomonassp.），拟命名为绿脓杆菌（Pseudomonassp.）fjfst-331。
用所述的绿脓杆菌（Pseudomonassp.）fjfst-331生产κ-卡拉胶酶的方法步骤如下：
① 将绿脓杆菌（Pseudomonassp.）fjfst-331接种到产酶培养基中，250ml三角瓶装30ml产酶培养基，按常规方法灭菌、冷却并接种菌落，32℃、160r/min摇床培养24h后，取1ml培养液再次接种产酶培养基，32℃、160r/min摇床培养56h，发酵液离心（5000r/min,10min）去除沉淀，取上清液；
② 用250ml三角瓶装20ml只含0.5%κ-卡拉胶底物的培养基，按常规方法灭菌、冷却并接种1ml上清发酵酶液，于32℃反应1h，得到含κ-卡拉胶酶的发酵液；
③ 将发酵培养基经过4℃，8000-10000g冷冻离心10-20min之后，取上清液；
④ 将上清液加入质量分数为60%-80%的饱和硫酸铵，加入后继续搅拌1h，放置冰箱沉降过夜，4℃，8000-10000g离心20-40min取沉淀；
⑤ 沉淀置于蒸馏水中透析48h，冷冻干燥后得到粗酶粉，-20℃保存；
⑥ 粗酶用0.02mo/LpH7.5的Tris-HCI缓冲液溶解，滤纸过滤除去不溶性杂质，经阴离子交换色谱Q-sepharoseFastFlow分离，用含有0.1~0.6mol/LNaCI的0.05mol/LpH7.2的Tris-HCI缓冲液进行连续梯度洗脱，流速为1.2ml/min，于280nm检测洗脱液中的蛋白质含量，分布收集洗脱液，4.5ml/管，测定峰位的酶活；
⑦ 将试管中有活性的部分合并进行冷冻干燥，即成κ-卡拉胶酶半成品；
⑧ 将SephcrylS-100凝胶过滤层析柱（φ1.6cm*80cm）用缓冲液（0.02mol/L，pH7.5的Tris-HCl）平衡后，秤取κ-卡拉胶酶半成品0.05g溶于4mL平衡缓冲液中，6000g低温离心20min后取上清液上层析柱。用缓冲液（0.02mol/L，pH7.5的Tris-HCl）进行洗脱，控制流速为0.1ml/min。洗脱液经紫外检测并分部收集（4ml/管），分别测定出峰部分试管的酶活，将有活力的部分合并，经充分透析脱盐后，超滤膜浓缩，对浓缩液冷冻干燥，得到κ-卡拉胶酶成品。
所述产酶培养基：氯化钠15g、κ-卡拉胶2g、酵母膏1g、无机盐母液100ml、水900ml、PH7.5，其中无机盐母液：NaNO320g、MgSO4.7H2O5g、K2HPO410g、CaC12lg、蒸馏水1L。
步骤②所述培养基：κ-卡拉胶5g，蒸馏水1000ml，PH7.5。
用该方法生产的κ-卡拉胶酶的检测方法：
取步骤③得到含有κ-卡拉胶酶的发酵液上清液1mL，加入20mL的卡拉胶底物（其中含有0.5%卡拉胶），置于32℃酶解1h，后加入1.0mLDNS，沸水浴5min。冷却至室温后，用蒸馏水补齐刻度，使用分光光度计在540nm下进行检测。1U定义为1min产生1ug卡拉胶寡糖的值。
本发明的有益效果：
① 新筛选出一株能高效生产κ-卡拉胶酶的菌株，分类命名为绿脓杆菌（Pseudomonassp.）fjfst-331。
② 本发明以该菌作为菌种，以常见碳源，氮源，无机盐组成的发酵培养基，可以在48-60h内达到最大酶产量，酶活为70.39U/ml。
具体实施方式
以下是说明本发明的具体实施例，但本发明并不限于此。
实施例1
取自卡拉胶加工厂的卡拉胶废渣进行κ-卡拉胶降解菌的筛选。将卡拉胶废渣用海水（3%海盐配置）浸泡2d，取上清液加入富集培养基中5℃，160r/min摇床培养3d后，重复操作3次，取0.1ml富集培养也涂布初筛分离培养基28℃倒置培养48h，挑取周围形成明显透明圈和凹坑的菌落划线初筛培养基，培养48h后，挑取单菌落移接传代培养基斜面，获得卡拉胶降解菌纯培养。纯种接到发酵培养液种32℃，160r/min培养2d后检测培养液中κ-卡拉胶酶的活力，最终筛选出目标菌株B-331。
实施例2
经形态学和生理生化特性研究，B-331菌株的特征如下：
菌落形态：菌落呈现圆形，表面凹陷、粘连，边缘整齐。
细胞形态：此为革兰氏阴性菌，形态为杆状。
生理生化特征：为兼性厌氧菌，分解葡萄糖，伯胶糖，单奶糖，甘露糖产酸不产气，不分解麦芽糖，菊糖和棉籽糖，甘露醇、乳糖及蔗糖，能液化明胶。
对该菌株的16SrRNA基因进行PCR扩增与序列测定，发现其16SrRNA的基因部分片断长度为1529bp，经过NCBI和核糖体数据库进行比对，鉴定为绿脓杆菌（Pseudomonassp.），拟命名为绿脓杆菌（Pseudomonassp.）fjfst-331，菌株的16SrRNA序列具体可见序列表。
实施例3
①将绿脓杆菌（Pseudomonassp.）fjfst-331接种到产酶培养基中，250ml三角瓶装30ml产酶培养基，按常规方法灭菌、冷却并接种菌落，32℃、160r/min摇床培养24h后，取1ml培养液再次接种产酶培养基，32℃、160r/min摇床培养56h。发酵液离心（5000r/min,10min）去除沉淀，取上清液。所述产酶培养基:氯化钠15g、κ-卡拉胶2g、酵母膏1g、无机盐母液100ml、水900ml、PH7.5。
② 无机盐母液:NaNO320g、MgSO4.7H2O5g、K2HPO410g、CaC12lg、蒸馏水1L。
③ 用250ml三角瓶装20ml只含0.5%κ-卡拉胶底物的培养基，按常规方法灭菌、冷却并接种1ml上清发酵酶液。于32℃反应1h，得到含κ-卡拉胶酶的发酵液并测其酶活。所述培养基：κ-卡拉胶5g，蒸馏水1000ml，PH7.5。
该实施例所得的琼胶酶的活力为70.39U/mL。
实施例4
①.将绿脓杆菌（Pseudomonassp.）fjfst-331接种到产酶培养基中，250ml三角瓶装30ml产酶培养基，按常规方法灭菌、冷却并接种菌落，32℃、160r/min摇床培养24h后，取1ml培养液再次接种产酶培养基，32℃、160r/min摇床培养56h，发酵液离心（5000r/min,10min）去除沉淀，取上清液。所述产酶培养基:氯化钠15g、κ-卡拉胶2g、酵母膏1g、无机盐母液100ml、水900ml、PH7.5。无机盐母液:NaNO320g、MgSO4.7H2O5g、K2HPO410g、CaC12lg、蒸馏水1L。
②.用250ml三角瓶装20ml只含0.5%κ-卡拉胶底物的培养基，按常规方法灭菌、冷却并接种1ml上清发酵酶液，于32℃反应1h，得到含κ-卡拉胶酶的发酵液，所述培养基：κ-卡拉胶5g，蒸馏水1000ml，PH7.5。
③.将发酵培养基经过4℃，10000g冷冻离心20min之后，取上清液。
④.将上清液加入质量分数为60%-80%的饱和硫酸铵，加入后继续搅拌1h，放置冰箱沉降过夜，4℃，10000g离心40min取沉淀；
⑤.沉淀置于蒸馏水中透析48h，冷冻干燥后得到粗酶粉，-20℃保存；
⑥.粗酶用0.02mo/LpH7.5的Tris-HCI缓冲液溶解，滤纸过滤除去不溶性杂质，经阴离子交换色谱Q-sepharoseFastFlow分离，用含有0.1~0.6mol/LNaCI的0.05mol/LpH7.2的Tris-HCI缓冲液进行连续梯度洗脱，流速为1.2ml/min，于280nm检测洗脱液中的蛋白质含量，分布收集洗脱液，4.5ml/管，测定峰位的酶活；
⑦.将试管中有活性的部分合并进行冷冻干燥，即成κ-卡拉胶酶半成品。
⑧.将SephcrylS-100凝胶过滤层析柱（φ1.6cm*80cm）用缓冲液（0.02mol/L，pH7.5的Tris-HCl）平衡后，秤取κ-卡拉胶酶半成品0.05g溶于4mL平衡缓冲液中，6000g低温离心20min后取上清液上层析柱。用缓冲液（0.02mol/L，pH7.5的Tris-HCl）进行洗脱，控制流速为0.1ml/min。洗脱液经紫外检测并分部收集（4ml/管），分别测定出峰部分试管的酶活，将有活力的部分合并，经充分透析脱盐后，超滤膜浓缩，对浓缩液冷冻干燥，得到κ-卡拉胶酶成品。
SEQUENCELISTING
<110>福建农林大学
<120>一株绿脓杆菌用于κ-卡拉胶酶的制备
<130>1
<160>1
<170>PatentInversion3.3
<210>1
<211>1529
<212>DNA
<213>16srDNA序列
<400>1
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taggggaacctgcggctggatcacctcct1529
Claims (6)
1.一株绿脓杆菌，其特征在于：所述绿脓杆菌为绿脓杆菌fjfst-331，已于2013年12月25日在中国典型培养物保藏中心登记保藏，其保藏号为CCTCCM2013705。
2.根据权利要求1所述的一株绿脓杆菌，其特征在于：所述绿脓杆菌fjfst-331的16SrRNA序列如SEQIDNO.1所示。
3.一种如权利要求1所述的一株绿脓杆菌的用途，其特征在于：用于制备κ-卡拉胶酶。
4.一株如权利要求1所述的一株绿脓杆菌用于制备κ-卡拉胶酶的方法，其特征在于：包括如下步骤：
①将绿脓杆菌fjfst-331接种到产酶培养基中，250ml三角瓶装30ml产酶培养基，按常规方法灭菌、冷却并接种菌落，32℃、160r/min摇床培养24h后，取1ml培养液再次接种产酶培养基，32℃、160r/min摇床培养56h，发酵液5000r/min离心10min，去除沉淀，取上清液；
②用250ml三角瓶装20ml只含质量分数为0.5%κ-卡拉胶底物的培养基，按常规方法灭菌、冷却并接种1ml上清发酵酶液，于32℃反应1h，得到含κ-卡拉胶酶的发酵液；
③将发酵培养基经过4℃，8000-10000g冷冻离心10-20min之后，取上清液；
④将上清液加入质量分数为60%-80%的饱和硫酸铵，加入后继续搅拌1h，放置冰箱沉降过夜，4℃，8000-10000g离心20-40min取沉淀；
⑤沉淀置于蒸馏水中透析48h，冷冻干燥后得到粗酶粉，-20℃保存；
⑥粗酶用0.02mo/LpH7.5的Tris-HCI缓冲液溶解，滤纸过滤除去不溶性杂质，经阴离子交换色谱Q-sepharoseFastFlow分离，用含有0.1~0.6mol/LNaCI的0.05mol/LpH7.2的Tris-HCI缓冲液进行连续梯度洗脱，流速为1.2ml/min，于280nm检测洗脱液中的蛋白质含量，分布收集洗脱液，4.5ml/管，测定峰位的酶活；
⑦将试管中有活性的部分合并进行冷冻干燥，即成κ-卡拉胶酶半成品；
⑧将SephcrylS-100凝胶过滤层析柱用0.02mol/L，pH7.5的Tris-HCl缓冲液平衡后，秤取κ-卡拉胶酶半成品0.05g溶于4mL平衡缓冲液中，6000g低温离心20min后取上清液上层析柱，用0.02mol/L，pH7.5的Tris-HCl缓冲液进行洗脱，控制流速为0.1ml/min；
洗脱液经紫外检测并分部收集，4ml/管，分别测定出峰部分试管的酶活，将有活力的部分合并，经充分透析脱盐后，超滤膜浓缩，对浓缩液冷冻干燥，得到κ-卡拉胶酶成品。
5.根据权利要求4所述的一株绿脓杆菌用于制备κ-卡拉胶酶的方法，其特征在于：所述产酶培养基：氯化钠15g、κ-卡拉胶2g、酵母膏1g、无机盐母液100ml、水900ml、PH7.5，其中无机盐母液：NaNO320g、MgSO4.7H2O5g、K2HPO410g、CaC12lg、蒸馏水1L。
6.根据权利要求4所述的一株绿脓杆菌用于制备κ-卡拉胶酶的方法，其特征在于：步骤②所述培养基：κ-卡拉胶5g，蒸馏水1000ml，pH7.5。
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| 海洋细菌QY202产κ-卡拉胶酶的分离纯化和性质研究;段高飞等;《中国海洋大学学报》;20100331;第40卷(第3期);095-100 * |
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