CN108220189A - 一株产木聚糖酶的海洋细菌及应用 - Google Patents

一株产木聚糖酶的海洋细菌及应用 Download PDF

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Abstract

一株产木聚糖酶的海洋细菌及应用，涉及海洋微生物。产木聚糖酶的海洋细菌(Maribacter sp.)T28，已保藏至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC 1.15788。产木聚糖酶的海洋细菌在制备木聚糖酶中应用。从保种管中取出菌株涂布于2216E培养基平板上，纯化，接入RO种子培养基中，摇床培养至对数生长期，得种子液；将得到的种子液转接发酵培养基，摇床培养，得发酵液；将得到的发酵液经高速离心，得上清液，即为木聚糖酶液。筛选的具有木聚糖酶生产能力的细菌，其在培养96h后，发酵液的木聚糖酶的酶活力可以达到72～96U/ml，具有良好的应用前景。

Description

一株产木聚糖酶的海洋细菌及应用
技术领域
本发明涉及海洋微生物，尤其是涉及一株产木聚糖酶的海洋细菌及应用。
背景技术
木聚糖是一种存在于植物细胞壁中的异质多糖，约占植物细胞干重的15％～35％，是植物半纤维素的主要成分。大多数木聚糖是一种结构复杂、具有高度分枝的异质多糖，含有许多不同的取代基。木聚糖的生物降解也因此需要一个复杂的酶系统，通过其中各组分的相互协同作用来降解木聚糖。木聚糖酶包括有β-1,4-内切木聚糖酶、β-木糖苷酶、α-L-阿拉伯糖苷酶、乙酰基木聚糖酶和酚酸酯酶；其中β-1,4-内切木聚糖酶是最为关键的水解酶，它通过水解木聚糖中的β-1,4-糖苷键，将木聚糖水解为小寡糖和木二糖等低聚木糖，其它参与彻底水解木聚糖的木聚糖降解酶则作用于木糖与侧链取代基之间的糖苷键，协同主链水解酶的作用。木聚糖酶在自然界中分布广泛，可从动物、植物和微生物中获得。该海洋细菌所能产生的木聚糖酶在酿造、饲料等工艺上用途广泛，并对研究开发海洋生物资源具有重大意义。
发明内容
本发明的第一目的是提供产木聚糖酶的海洋细菌(Maribacter sp.)T28。
本发明的第二目的是提供产木聚糖酶的海洋细菌(Maribacter sp.)T28在制备木聚糖酶的应用。
本发明的第三目的是提供木聚糖酶的制备方法。
所述产木聚糖酶的海洋细菌(Maribacter sp.)T28，已于2017年06月22日保藏至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101，保藏号为：CGMCC 1.15788。所述产木聚糖酶的海洋细菌Maribacter sp.T28为革兰氏阴性、好氧、杆状的海洋细菌。其基因组中编码的一个果胶裂解酶PL9，隶属碳水化合物活性酶(CAZyme)家族，起着将果胶裂解为寡聚糖的作用；降解蛋白KdgF更是在随后的一系列转化到关键代谢物KDG的过程中起着重要作用。
所述产木聚糖酶的海洋细菌(Maribacter sp.)T28可在制备木聚糖酶中应用。
所述木聚糖酶的制备方法包括以下步骤：
1)从保种管中取出菌株涂布于2216E培养基平板上，纯化，接入RO种子培养基中，摇床培养至对数生长期，得种子液；
在步骤1)中，所述2216E培养基的配方可为：蛋白胨5.0g，酵母膏1.0g，柠檬酸铁0.1g，氯化钠19.45g，氯化镁5.98g，硫酸钠3.24g，氯化钙1.8g，氯化钾0.55g，碳酸钠0.16g，溴化钾0.08g，氯化锶34.0mg，硼酸22.0mg，硅酸钠4.0mg，氟化钠2.40mg，硝酸铵1.60mg，磷酸氢二钠8.0mg，蒸馏水1000g，pH7.6；所述纯化的次数可为2～3次；所述RO种子培养基的配方可为:蛋白胨1.0g，酵母膏1.0g，乙酸钠1.0g，氯化钠20.0g，氯化钾0.3g，七水合硫酸镁0.5g，氯化铵0.3g，磷酸氢二钾0.3g，二水合氯化钙38.0mg，蒸馏水1000g，pH8.0；所述摇床培养的条件可在28℃，160rpm下摇床培养24h。
2)将步骤1)得到的种子液转接发酵培养基，摇床培养，得发酵液；
在步骤2)中，所述种子液的接种量可为0.2％；所述发酵培养基的配方可为：木聚糖2.0g，酵母膏0.5g，氯化铵0.5g，海盐23.0g，Tris-HCl 50mM，蒸馏水1000g，pH 7.8；所述摇床培养的条件可在28℃，160rpm下摇床培养96h。
3)将步骤2)得到的发酵液经高速离心，得上清液，即为木聚糖酶液。
在步骤3)中，所述高速离心的条件可为12000g×10min。
本发明筛选的具有木聚糖酶生产能力的细菌，其在培养96h后，发酵液的木聚糖酶的酶活力可以达到72～96U/ml，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为产木聚糖酶的海洋细菌Maribacter sp.T28的透射电子显微镜形态图。
图2为产木聚糖酶的海洋细菌Maribacter sp.T28基于16s rRNA序列，利用MEGA 6中的neighbour-joining,maximum-likelihood，即T28和其亲缘关系相近菌株之间的系统发育树图。
具体实施方式
以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。
以下为对本发明的详细描述。
①目标菌的筛选
对来源于中国台湾龟山岛浅滩热液采集的表层海水样品进行微生物富集，初筛，复筛，筛选产木聚糖酶菌。
具体技术方案如下：
初筛：将台湾龟山岛浅滩热液采集的表层海水水样涂布于RO种子培养基(蛋白胨1.0g，酵母膏1.0g，乙酸钠1.0g，氯化钠20.0g，氯化钾0.3g，七水合硫酸镁0.5g，氯化铵0.3g，磷酸氢二钾0.3g，二水合氯化钙38.0mg，蒸馏水1000g，pH 8.0)。在30℃下培养14d，得到形态各异的单菌落，并纯化，用30％(v/v)甘油(1︰1；甘油：菌液)保存在-80℃。
复筛：将上述保种的细菌纯化接入30ml木聚糖液体培养基(木聚糖2.0g，酵母膏1.0g，乙酸钠1.0g，氯化铵0.5g，氯化钠20.0g，氯化钾0.3g，七水合硫酸镁0.5g，二水合氯化钙0.05g，蒸馏水1000g,pH 7.6)中,在28℃，160rpm摇床培养。分离能降解木聚糖的海洋细菌。
②形态特征，生长条件以及系统发育树分析研究表明，菌株T28具有以下特点：
菌株形态特征：革兰氏阴性菌，在2216E平板上培养3d后形成黄色、凸起、表面光滑、直径约为1-1.5mm的圆形菌落。在透射电子显微镜下观察，菌体呈杆状。
生长条件：严格好氧，最适生长温度为30℃，最适生长pH5-8，最适生长盐度0-5％。
系统发育树分析：菌株T28的16s序列和全基因组已上传至NCBI，收录号分别为KX022625和CP018760；根据16s系统发育进化树分析T28与Maribacter arcticus的相似性最高，为97.7％。
③产木聚糖酶细菌菌液的制备
将T28接种于液体培养基(木聚糖2.0g，酵母膏0.5g，氯化铵0.5g，海盐23.0g，Tris-HCl50mM，蒸馏水1000g，pH 7.8)中，在28℃，160rpm摇床培养24h，获得种子培养液，将种子培养液按2％接种量接种于新鲜的液体培养基，于28℃，160rpm摇床培养96h，即可制得产木聚糖酶的细菌菌液。
④木聚糖酶的制备
将上述的发酵菌液经高速离心获取上清液，此即为木聚糖酶酶液。
⑤木聚糖酶活性的测定
木聚糖酶活单位：在55℃、pH5.0的条件下，以每分钟催化木聚糖水解生成1μmol木糖所需要的酶量定义为一个酶活单位。
酶活测定采用3,5-二硝基水杨酸(DNS)比色法。酶反应体系为：含底物1％的木聚糖溶液4ml+酶液1ml(50℃预热3min)。酶活测定过程：将反应体系混合均匀立即在50℃水浴中准确反应10min；加入2ml DNS试剂混匀后立即放入沸水水浴10min,取出，立即用流动冷水冷却并定容；以木糖的标准曲线为对照，于540nm处测定吸光值。经沸水浴预处理10min的失活酶液作为酶活测定的阴性对照。
产木聚糖酶的海洋细菌Maribacter sp.T28的透射电子显微镜形态图参见图1，产木聚糖酶的海洋细菌Maribacter sp.T28基于16s rRNA序列，利用MEGA 6中的neighbour-joining,maximum-likelihood，即T28和其亲缘关系相近菌株之间的系统发育树图参见图2。
结果表明96h测得的酶活力为72～96U/ml。
本发明从其基因组信息发现，其具有数个木聚糖降解酶。本发明提供作为微生物发酵的海洋细菌的木聚糖酶，该海洋细菌属于Maribacter属。

Claims (10)

1.产木聚糖酶的海洋细菌(Maribacter sp.)T28，已于2017年06月22日保藏至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏号为：CGMCC 1.15788。
2.产木聚糖酶的海洋细菌(Maribacter sp.)T28在制备木聚糖酶中应用。
3.如权利要求1所述木聚糖酶的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1)从保种管中取出菌株涂布于2216E培养基平板上，纯化，接入RO种子培养基中，摇床培养至对数生长期，得种子液；
2)将步骤1)得到的种子液转接发酵培养基，摇床培养，得发酵液；
3)将步骤2)得到的发酵液经高速离心，得上清液，即为木聚糖酶液。
4.如权利要求3所述木聚糖酶的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述2216E培养基的配方为：蛋白胨5.0g，酵母膏1.0g，柠檬酸铁0.1g，氯化钠19.45g，氯化镁5.98g，硫酸钠3.24g，氯化钙1.8g，氯化钾0.55g，碳酸钠0.16g，溴化钾0.08g，氯化锶34.0mg，硼酸22.0mg，硅酸钠4.0mg，氟化钠2.40mg，硝酸铵1.60mg，磷酸氢二钠8.0mg，蒸馏水1000g，pH7.6。
5.如权利要求3所述木聚糖酶的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述纯化的次数为2～3次。
6.如权利要求3所述木聚糖酶的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述RO种子培养基的配方为:蛋白胨1.0g，酵母膏1.0g，乙酸钠1.0g，氯化钠20.0g，氯化钾0.3g，七水合硫酸镁0.5g，氯化铵0.3g，磷酸氢二钾0.3g，二水合氯化钙38.0mg，蒸馏水1000g，pH8.0。
7.如权利要求3所述木聚糖酶的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述摇床培养的条件是在28℃，160rpm下摇床培养24h。
8.如权利要求3所述木聚糖酶的制备方法，其特征在于在步骤2)中，所述种子液的接种量为0.2％；所述发酵培养基的配方为：木聚糖2.0g，酵母膏0.5g，氯化铵0.5g，海盐23.0g，Tris-HCl 50mM，蒸馏水1000g，pH 7.8。
9.如权利要求3所述木聚糖酶的制备方法，其特征在于在步骤2)中，所述摇床培养的条件是在28℃，160rpm下摇床培养96h。
10.如权利要求3所述木聚糖酶的制备方法，其特征在于在步骤3)中，所述高速离心的条件为12000g×10min。
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