CN108004178A - 一株产海藻胶降解酶的海洋细菌及应用 - Google Patents

一株产海藻胶降解酶的海洋细菌及应用 Download PDF

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Abstract

一株产海藻胶降解酶的海洋细菌及应用，涉及海藻胶。产海藻胶降解酶的海洋细菌(Maribacter sp.)T28，保藏号为CGMCC 1.15788。产海藻胶降解酶的海洋细菌在制备海藻胶中应用。海藻胶的制备方法：将表层海水水样涂布于RO种子培养基培养，得到形态各异的单菌落，并纯化后保存；将初筛后得到的保种细菌纯化接入海藻酸钠液体培养基中，摇床培养，分离能降解海藻酸钠的海洋细菌。海藻胶降解酶的制备方法：从保种管中取出菌株涂布于2216E培养基平板上，纯化后接入RO种子培养基中，摇床培养至对数生长期，得种子液；将种子液转接发酵培养基，摇床培养得发酵液；将发酵液经离心得上清液，即为海藻胶降解酶。

Description

一株产海藻胶降解酶的海洋细菌及应用
技术领域
本发明涉及海藻胶，尤其是涉及一株产海藻胶降解酶的海洋细菌及应用。
背景技术
海藻胶是一类常从褐藻类细胞壁中提取出来的天然多糖，其本质是由β-D-甘露糖醛酸(M区)和α-L-古洛糖醛酸(G区)通过糖苷键连接而成的线性天然高分子。近年来，随着海藻寡糖多种生理活性的发现，目前获取海藻寡糖的方法已有诸如物理降解法、酸降解法、氧化降解法和酶降解法；其中，酶降解法反应条件温和、底物特异性高，在寡糖制备的各个方面均优于物理和化学方法，从不同的途径寻找和生产具有高活性的海藻胶降解酶已成为当前的研究热点。该海洋细菌产生的海藻胶降解酶，不仅丰富了酶资源库，而且对研究开发海洋生物资源具有重要意义。
发明内容
本发明的第一目的是提供产海藻胶降解酶的海洋细菌(Maribacter sp.)T28。
本发明的第二目的是提供产海藻胶降解酶的海洋细菌(Maribacter sp.)T28在制备海藻胶的应用。
本发明的第三目的是提供海藻胶的制备方法。
本发明的第四目的是提供海藻胶降解酶的制备方法。
所述产海藻胶降解酶的海洋细菌(Maribacter sp.)T28，已于2017年06月22日保藏至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC 1.15788，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101。
T28为革兰氏阴性、好氧、杆状的海洋细菌，其基因组中编码的数个海藻胶降解酶，隶属碳水化合物活性酶(CAZyme)中的多糖裂解酶(Polysaccharide Lyase，PL)家族，通过其裂解机制将海藻胶降解为具有多种生理活性的海藻寡糖。
所述产海藻胶降解酶的海洋细菌(Maribacter sp.)T28可在制备海藻胶中应用。
所述海藻胶的制备方法包括以下步骤：
1)初筛：将表层海水水样涂布于RO种子培养基培养，得到形态各异的单菌落，并纯化后保存；
在步骤1)中，所述表层海水可由台湾龟山岛浅滩热液采集的表层海水水样；所述RO种子培养基的组成可为：蛋白胨1.0g，酵母膏1.0g，乙酸钠1.0g，氯化钠20.0g，氯化钾0.3g，七水合硫酸镁0.5g，氯化铵0.3g，磷酸氢二钾0.3g，二水合氯化钙38.0mg，蒸馏水1000g，pH 8.0；所述培养可在30℃下培养14d；所述纯化后保存可采用体积百分比30％的甘油，甘油与菌液的体积比可为1︰1；保存的温度可为-80℃。
2)复筛：将步骤1)初筛后得到的保种细菌纯化接入海藻酸钠液体培养基中，摇床培养，分离能降解海藻酸钠的海洋细菌。
在步骤2)中，所述海藻酸钠液体培养基可采用30ml海藻酸钠液体培养基，所述海藻酸钠液体培养基的组成可为海藻酸钠2.0g，酵母膏1.0g，乙酸钠1.0g，氯化铵0.5g，氯化钠20.0g，氯化钾0.3g，七水合硫酸镁0.5g，二水合氯化钙0.05g，蒸馏水1000g,pH 7.6；所述摇床培养可在28℃下160rpm摇床培养。
海藻胶降解酶的制备方法包括以下步骤：
1)从保种管中取出菌株涂布于2216E培养基平板上，纯化后接入RO种子培养基中，摇床培养至对数生长期，得种子液；
在步骤1)中，所述纯化可经过2～3次，所述2216E培养基的组成可为：蛋白胨5.0g，酵母膏1.0g，柠檬酸铁0.1g，氯化钠19.45g，氯化镁5.98g，硫酸钠3.24g，氯化钙1.8g，氯化钾0.55g，碳酸钠0.16g，溴化钾0.08g，氯化锶34.0mg，硼酸22.0mg，硅酸钠4.0mg，氟化钠2.40mg，硝酸铵1.60mg，磷酸氢二钠8.0mg，蒸馏水1000g，pH7.6；所述RO种子培养基的配方可为：蛋白胨1.0g，酵母膏1.0g，乙酸钠1.0g，氯化钠20.0g，氯化钾0.3g，七水合硫酸镁0.5g，氯化铵0.3g，磷酸氢二钾0.3g，二水合氯化钙38.0mg，蒸馏水1000g，pH8.0；所述摇床培养条件可在28℃下160rpm摇床培养24h。
2)将步骤1)得到的种子液转接发酵培养基，摇床培养，得发酵液；
在步骤2)中，所述种子液的接种量可为0.2％；所述发酵培养基的配方可为：海藻酸钠2.0g，酵母膏0.5g，氯化铵0.5g，海盐23.0g，Tris-HCl 50mM，蒸馏水1000g，pH 7.8；所述摇床培养的条件可在28℃，160rpm摇床培养48h。
3)将步骤2)得到的发酵液经高速离心，得上清液，即为海藻胶降解酶。
在步骤3)中，所述高速离心的条件可为：12000g×10min。
本发明筛选的具有海藻胶降解酶生产能力的细菌，其在培养48h后，发酵液的海藻胶降解酶的酶活力可以达到65-90U/ml，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为产海藻胶降解酶的海洋细菌(Maribacter sp.)T28的透射电子显微镜形态图。
图2为产海藻胶降解酶的海洋细菌(Maribacter sp.)T28基于16s rRNA序列，利用MEGA6中的neighbour-joining,maximum-likelihood,即T28和其亲缘关系相近菌株之间的系统发育树图。
具体实施方式
以下为对本发明的详细描述。
1)目标菌的筛选
对来源于中国台湾龟山岛浅滩热液采集的表层海水样品进行微生物富集，初筛，复筛，筛选产海藻胶降解酶菌。
具体技术方案如下：
初筛：将台湾龟山岛浅滩热液采集的表层海水水样涂布于RO(蛋白胨1.0g，酵母膏1.0g，乙酸钠1.0g，氯化钠20.0g，氯化钾0.3g，七水合硫酸镁0.5g，氯化铵0.3g，磷酸氢二钾0.3g，二水合氯化钙38.0mg，蒸馏水1000g，pH 8.0)。在30℃下培养14d，得到形态各异的单菌落，并纯化，用30％(v/v)甘油(1:1；甘油：菌液)保存在-80℃。
复筛：将上述保种的细菌纯化接入30ml海藻酸钠液体培养基(海藻酸钠2.0g，酵母膏1.0g，乙酸钠1.0g，氯化铵0.5g，氯化钠20.0g，氯化钾0.3g，七水合硫酸镁0.5g，二水合氯化钙0.05g，蒸馏水1000g,pH 7.6)中,在28℃，160rpm摇床培养。分离能降解海藻酸钠的海洋细菌。
2)形态特征，生长条件以及系统发育树分析研究表明，菌株T28具有以下特点：
菌株形态特征：革兰氏阴性菌，在2216E平板上培养3d后形成黄色、凸起、表面光滑、直径约为1-1.5mm的圆形菌落。在透射电子显微镜下观察，菌体呈杆状。
生长条件：严格好氧，最适生长温度为30℃，最适生长pH5-8，最适生长盐度0-5％。
系统发育树分析：菌株T28的16s序列和全基因组已上传至NCBI，收录号分别为KX022625和CP018760；根据16s系统发育进化树分析T28与Maribacter arcticus的相似性最高，为97.7％。
3)产海藻胶裂解酶细菌菌液的制备
将T28接种于液体培养基(海藻酸钠2.0g，酵母膏0.5g，氯化铵0.5g，海盐23.0g，Tris-HCl 50mM，蒸馏水1000g，pH 7.8)中，在28℃，160rpm摇床培养24h，获得种子培养液，将种子培养液按2％接种量接种于新鲜的液体培养基，于28℃，160rpm摇床培养48h，即可制得产海藻胶裂解酶的细菌菌液。
4)海藻胶降解酶的制备
将上述的发酵菌液经高速离心获取上清液，此即为海藻胶降解酶酶液。
海藻胶裂解酶活性的测定
取0.9ml 3g/L海藻酸钠(3g海藻酸钠溶于1L 100mmol/L pH6.0磷酸盐缓冲液)，加入0.1ml酶液，40℃保温15min，以灭活酶液作空白，测定上述反应体系在235nm的光吸收值。酶活力单位(U)定义为：在以上条件下，使每分钟光吸收值增加0.1的酶量为1个酶活力单位。
产海藻胶降解酶的海洋细菌(Maribacter sp.)T28的透射电子显微镜形态图参见图1，产海藻胶降解酶的海洋细菌(Maribacter sp.)T28基于16s rRNA序列，利用MEGA 6中的neighbour-joining,maximum-likelihood,即T28和其亲缘关系相近菌株之间的系统发育树图参见图2。
结果表明，48h测得的酶活力为65～90U/ml。

Claims (10)

1.产海藻胶降解酶的海洋细菌(Maribacter sp.)T28，已于2017年06月22日保藏至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC 1.15788。
2.如权利要求1所述产海藻胶降解酶的海洋细菌(Maribacter sp.)T28在制备海藻胶中应用。
3.如权利要求1所述海藻胶的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1)初筛：将表层海水水样涂布于RO种子培养基培养，得到形态各异的单菌落，并纯化后保存；
2)复筛：将步骤1)初筛后得到的保种细菌纯化接入海藻酸钠液体培养基中，摇床培养，分离能降解海藻酸钠的海洋细菌。
4.如权利要求3所述海藻胶的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述表层海水由台湾龟山岛浅滩热液采集的表层海水水样。
5.如权利要求3所述海藻胶的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述RO种子培养基的组成为蛋白胨1.0g，酵母膏1.0g，乙酸钠1.0g，氯化钠20.0g，氯化钾0.3g，七水合硫酸镁0.5g，氯化铵0.3g，磷酸氢二钾0.3g，二水合氯化钙38.0mg，蒸馏水1000g，pH 8.0；所述培养可在30℃下培养14d；所述纯化后保存可采用体积百分比30％的甘油，甘油与菌液的体积比可为1︰1；保存的温度可为-80℃。
6.如权利要求3所述海藻胶的制备方法，其特征在于在步骤2)中，所述海藻酸钠液体培养基采用30ml海藻酸钠液体培养基，所述海藻酸钠液体培养基的组成为海藻酸钠2.0g，酵母膏1.0g，乙酸钠1.0g，氯化铵0.5g，氯化钠20.0g，氯化钾0.3g，七水合硫酸镁0.5g，二水合氯化钙0.05g，蒸馏水1000g,pH 7.6；所述摇床培养可在28℃下160rpm摇床培养。
7.海藻胶降解酶的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1)从保种管中取出菌株涂布于2216E培养基平板上，纯化后接入RO种子培养基中，摇床培养至对数生长期，得种子液；
2)将步骤1)得到的种子液转接发酵培养基，摇床培养，得发酵液；
3)将步骤2)得到的发酵液经高速离心，得上清液，即为海藻胶降解酶。
8.如权利要求7所述海藻胶降解酶的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述纯化经过2～3次，所述2216E培养基的组成为：蛋白胨5.0g，酵母膏1.0g，柠檬酸铁0.1g，氯化钠19.45g，氯化镁5.98g，硫酸钠3.24g，氯化钙1.8g，氯化钾0.55g，碳酸钠0.16g，溴化钾0.08g，氯化锶34.0mg，硼酸22.0mg，硅酸钠4.0mg，氟化钠2.40mg，硝酸铵1.60mg，磷酸氢二钠8.0mg，蒸馏水1000g，pH7.6；所述RO种子培养基的配方可为：蛋白胨1.0g，酵母膏1.0g，乙酸钠1.0g，氯化钠20.0g，氯化钾0.3g，七水合硫酸镁0.5g，氯化铵0.3g，磷酸氢二钾0.3g，二水合氯化钙38.0mg，蒸馏水1000g，pH8.0；所述摇床培养条件可在28℃下160rpm摇床培养24h。
9.如权利要求7所述海藻胶降解酶的制备方法，其特征在于在步骤2)中，所述种子液的接种量为0.2％；所述发酵培养基的配方为：海藻酸钠2.0g，酵母膏0.5g，氯化铵0.5g，海盐23.0g，Tris-HCl 50mM，蒸馏水1000g，pH 7.8；所述摇床培养的条件可在28℃，160rpm摇床培养48h。
10.如权利要求7所述海藻胶降解酶的制备方法，其特征在于在步骤3)中，所述离心的条件为12000g×10min。
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