CN111876453A - 一种海藻寡糖的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种海藻寡糖的制备方法，具体包括以下步骤：(1)将保存于斜面培养基中的保藏菌种接种3环到种子罐中扩大培养，得到一级种子液；(2)将一级种子液接入摇瓶培养基中摇瓶培养，得到二级种子液；(3)将二级种子液接入发酵罐培养基中发酵培养，得到发酵液；(4)将新鲜的海藻洗净、除杂并剪碎，然后加热除菌，冷却，得到待酶解的海藻；(5)向待酶解的海藻中加入发酵液和氯化钠，反应，过滤，得到降解液；(6)依次进行超滤分离、真空浓缩和微波真空干燥，即得。本发明能够制备出多种具有生理活性的海藻寡糖，并且克服了物理法、化学法制备海藻寡糖的缺点，具有高效、环保和产物专一的特点，具有产业化应用前景。

Description

一种海藻寡糖的制备方法
技术领域
本发明涉及生物酶解技术领域，更具体的说是涉及一种海藻寡糖的制备方法。
背景技术
海藻产业是我国海洋经济的重要组成部分，产业体量巨大，但是主要集中在产业链上游的养殖环节，海藻产业链中游的加工环节存在短板，加工产品的附加值低，这样严重影响了下游企业产品的开发水平，同时也限制了上游养殖企业的进一步可持续发展，形成了一个头大尾小、可持续性差、规模大、效益低的产业现状。
海藻的主要成分是的海藻胶，现有科学研究表明，多数海藻胶结构独特，理论上具有多种生理活性，但是由于海藻胶分子量大、溶解性差、难以吸收等特点，限制了其在生物医药、保健食品等领域的开发和应用。目前，海藻胶主要应用于食品添加剂、增稠剂和化工原料等领域，产品附加值低，且加工环节低效、有污染。
而以海藻胶为原料制备系列的海藻寡糖由于分子量小、溶解性高、结构独特、活性基团充分暴露等特点从而表现出更强生理活性，在生物医药、功能食品等领域具有应用的前景。但是，目前利用物理、化学等方法降解海藻胶，不仅耗能高、污染大，而且无法达到特异性降解，不能实现产业化生产。
近几年先进的生物酶解技术在海藻深加工业中得到应用，产品摆脱了“碘、醇、胶”老三样，能够制备出多种具有生理活性的海藻寡糖，具有高效、环保和产物专一的特点，高活性海藻寡糖的产业化制备，有利于海藻下游高附加值产品的开发和产业的升级改造，从而带动海藻上下游产业的发展，改变海藻产业头大尾小的现状，提升海藻产业链中每一个环节的利润。
因此，如何建立高效温和、绿色环保、产物专一的海藻寡糖制备方法是实现海藻寡糖产业化生产的关键。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种海藻寡糖的制备方法，以解决现有技术中的不足。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种海藻寡糖的制备方法，具体包括以下步骤：
(1)将保存于斜面培养基中的保藏菌种接种3环到种子罐中扩大培养12-18h，温度为18-24℃，转速为150-200rpm，得到一级种子液；
(2)将一级种子液按1％-3％的接种量接入摇瓶培养基中摇瓶培养12-18h，温度为28-32℃，转速为140-160rpm，得到二级种子液；
(3)将二级种子液按1％-3％的接种量接入发酵罐培养基中发酵培养6-10h，温度为28-32℃，转速为150-180rpm，通气量为4-6L/min，气压为0.04-0.06MPa，溶氧量为30％-50％，得到发酵液，备用；
(4)将新鲜的海藻洗净、除杂并剪碎至1-2cm2大小，然后加热除菌，冷却，得到待酶解的海藻，备用；
(5)向待酶解的海藻中加入发酵液和氯化钠，控制温度为18-22℃，转速为150-200rpm，反应22-26h，过滤，得到降解液；
(6)将降解液进行超滤分离，收集分离液，然后进行真空浓缩，得到浓缩液，最后进行微波真空干燥，即得海藻寡糖成品。
优选的，一种海藻寡糖的制备方法，具体包括以下步骤：
(1)将保存于斜面培养基中的保藏菌种接种3环到种子罐中扩大培养为16h，温度为20℃，转速为180rpm，得到一级种子液；
(2)将一级种子液按2％的接种量接入摇瓶培养基中摇瓶培养16h，温度为30℃，转速为150rpm，得到二级种子液；
(3)将二级种子液按2％的接种量接入发酵罐培养基中发酵培养8h，温度为30℃，转速为160rpm，通气量为5L/min，气压为0.05MPa，溶氧量为40％，得到发酵液，备用；
(4)将新鲜的海藻洗净、除杂并剪碎至1cm2大小，然后加热除菌，冷却，得到待酶解的海藻，备用；
(5)向待酶解的海藻中加入发酵液和氯化钠，控制温度为20℃，转速为180rpm，反应24h，过滤，得到降解液；
(6)将降解液进行超滤分离，收集分离液，然后进行真空浓缩，得到浓缩液，最后进行微波真空干燥，即得海藻寡糖成品。
本发明的有益效果在于：
本发明利用丰富价廉的海藻作为原料，建立生物酶解法降解海藻的生产工艺，生产过程中不添加任何化学物质；发酵和酶解过程温度为18-22℃，除了冬天几乎不需要加热，因此整个生产工艺绿色、环保、低能，易于控制和操作；酶解产物和上清液都被充分利用，不产生废水和废弃物，达到了对海藻综合利用的目的。
进一步，上述步骤(1)中，保藏菌种为土地杆菌、cellulophaga lytica和枯草芽孢杆菌的混合菌种；
土地杆菌的保藏编号为CGMCC No.10828，保藏时间为2015年06月16日，保藏机构为中国微生物菌种管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮政编码为100101，电话为010-64807355；
cellulophagalytica的保藏编号为CGMCC No.10829，保藏时间为2015年06月16日，保藏机构为中国微生物菌种管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮政编码为100101，电话为010-64807355；
枯草芽孢杆菌的保藏编号为CCTCC：M 2018650，保藏时间为2018年10月08日，保藏机构为中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，邮政编码为430072，电话为027-68754052。
更进一步，上述土地杆菌、cellulophagalytica和枯草芽孢杆菌的质量比为1-5:1-3:1-2，优选为1:1:1。
采用上述进一步的有益效果在于，本发明通过筛选具有降解海藻作用的海洋微生物，从而获得高活性、高专一性的海藻降解酶，建立发酵生产海藻降解酶的发酵工艺。
进一步，上述步骤(1)中，以质量百分比计，斜面培养基的配方为：海藻酸钠0.7％，蛋白胨0.3％，琼脂1.5％，NaNO30.025％，NaCl 0.5％，KH2PO4 0.05％，MgSO4·7H2O0.025％，FeSO4·7H2O 0.001％，余量为水，pH值为7.2。
采用上述进一步的有益效果在于，本发明斜面培养基营养丰富，时间长些也不容易干燥、开裂，特别适合保藏菌种的保存。
进一步，上述步骤(2)中，以质量百分比计，摇瓶培养基的配方为：海藻酸钠0.7％，蛋白胨0.3％，诱导剂0.1％，NaNO30.025％，NaCl 0.5％，KH2PO4 0.05％，MgSO4·7H2O0.025％，FeSO4·7H2O 0.02％，余量为陈海水，pH值为7.95。
采用上述进一步的有益效果在于，本发明摇瓶培养基能够完成菌种的筛选培养。
进一步，上述步骤(3)中，以质量百分比计，发酵罐培养基的配方为：海藻酸钠0.7％，蛋白胨0.3％，诱导剂0.1％，NaNO30.025％，NaCl 0.5％，KH2PO40.05％，MgSO4·7H2O0.025％，FeSO4·7H2O 0.002％，余量为陈海水，pH值为7.0。
采用上述进一步的有益效果在于，本发明发酵罐培养基资源丰富，性能稳定，专一性强。
进一步，上述步骤(4)中，加热除菌的温度为50-60℃，优选为55℃；时间为10-20min，优选为15min。
采用上述进一步的有益效果在于，本发明通过加热除菌，能够除去海藻中的细菌等微生物，从而避免酶解过程中的杂菌污染。
进一步，上述步骤(5)中，待酶解的海藻、发酵液和氯化钠的质量比为(18-22):(8-12):(0.4-0.6)，优选为20:10:0.5。
采用上述进一步的有益效果在于，采用本发明以上质量比的原料，能保证酶解完全，并且保证产品质量。
进一步，上述步骤(6)中，超滤分离的膜孔径为0.05-1nm，优选为0.1nm，压力为0.1-0.5Mpa，优选为0.3Mpa；真空浓缩的温度为45-55℃，优选为50℃，压力为82.7-90.6KPa，优选为85.0KPa，时间为2-4h，优选为3h；微波真空干燥的温度为60-80℃，优选为70℃，压力为88.2-99.2KPa，优选为85.2KPa，时间为4-6h，优选为5h。
采用上述进一步的有益效果在于，通过超滤分离，能够截留去除降解液中的悬浮物、胶体、微粒、细菌和病毒等大分子物质，收集分离液，该过程没有相转移，无需添加任何强烈化学物质，可以在低温下操作，过滤速率较快，且避免了海藻寡糖的活力损失和变性；通过真空浓缩，能尽快除去分离液中的大量水分，减轻了重量，减小了体积，提高了海藻寡糖的浓度，得到浓缩液；通过微波真空干燥，能够除去浓缩液中的剩余水分，从而得到干燥的海藻寡糖产品，且干燥速度快、效率高、能耗低，易于控制。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
1、通过本发明制备方法，能够制备出多种具有生理活性的海藻寡糖，并且克服了物理法、化学法制备海藻寡糖的缺点，具有高效、环保和产物专一的特点，具有产业化应用前景，而且，高活性海藻寡糖的产业化制备，有利于海藻下游高附加值产品的开发和产业的升级改造，从而带动海藻上下游产业的发展，改变海藻产业头大尾小的现状，极大提升海藻产业链中每一个环节的利润；
2、通过筛选具有降解海藻作用的海洋微生物，获得高活性、高专一性的海藻降解酶，建立发酵生产海藻降解酶的发酵工艺，利用海藻降解酶作为工具，解决在温和条件下对海藻进行可控降解的关键技术，建立基于生物酶解法制备系列海藻寡糖的生产工艺；
3、通过对海藻降解产物进行分离和纯化，获得系列具有生理活性的海藻寡糖，建立海藻寡糖的质量标准，以海藻寡糖为原料开发出功效明确海洋功能食品和具有提高海珍品抗病能力的饵料添加剂等高附加值的海藻生物制品，从而延伸海藻产业链，提高海藻加工产品的附加值和科技含量，从而达到高值化综合利用海藻资源的目的；
4、因为不同海藻的多糖组成成分不同，直接影响后期海藻降解产物的组成，因此本发明首先明确了不同海藻的营养成分，尤其是不同海藻多糖的含量区别，为后期海藻酶解提供符合生产需求的海藻原料；
5、因为不同微生物对海藻的降解程度和降解产物不同，所以海藻降解微生物的筛选是本项目的关键，本发明通过广泛筛选常温下对海藻具有降解作用的海洋微生物，明确其对海藻的降解作用，分析海藻降解产物，构建海藻降解微生物的种质资源库，为后续海藻降解酶的生产提供资源；
6、本发明针对影响海洋微生物生长和产酶的关键因素和条件，优化海洋微生物发酵产酶条件，通过小试、中试和放大试验，最终确定海藻寡糖降解酶发酵生产条件，建立海藻寡糖降解酶产业化发酵生产技术，达到年产200吨酶制剂的生产规模；
7、本发明利用海藻降解酶作为生产工具，在温和条件下对海藻进行降解，根据海藻原料种类、降解酶的类型、降解时间、降解条件来控制降解酶对海藻的降解程度，以满足生产对酶解产物的要求，从而建立温和可控的海藻寡糖酶解技术，并实现产业化生产，达到年产100吨海藻寡糖的生产规模；
8、本发明通过分析海藻寡糖的结构特点，建立海藻寡糖分离纯化技术，获得系列海藻寡糖产品，制备海藻寡糖的标准品，制定海藻寡糖的质量标准；建立生物活性筛选体系平台，明确不同海藻寡糖的生物活性，为海藻寡糖的开发奠定基础；
9、本发明针对不同海藻寡糖的生物活性，研究海藻寡糖的活性机理，以寡糖为原料，开发具有确切功效的海洋功能性食品(或新资源食品)，获得国家批准文号；针对海珍品(海参)养殖过程中出现抗生素滥用的问题，开发具有提高海珍品抗病能力、促进海珍品快速生长的功能性饵料添加剂，获得国家生产批准文号。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
以下实施例中，
土地杆菌的保藏编号为CGMCC No.10828，保藏时间为2015年06月16日，保藏机构为中国微生物菌种管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮政编码为100101，电话为010-64807355；
cellulophaga lytica的保藏编号为CGMCC No.10829，保藏时间为2015年06月16日，保藏机构为中国微生物菌种管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮政编码为100101，电话为010-64807355；
枯草芽孢杆菌的保藏编号为CCTCC：M 2018650，保藏时间为2018年10月08日，保藏机构为中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，邮政编码为430072，电话为027-68754052。
100g斜面培养基中：海藻酸钠0.7g，蛋白胨0.3g，琼脂1.5g，NaNO30.025g，NaCl0.5g，KH2PO40.05g，MgSO4·7H2O 0.025g，FeSO4·7H2O 0.001g，余量为水，pH值为7.2；
100g摇瓶培养基中：海藻酸钠0.7g，蛋白胨0.3g，诱导剂0.1g，NaNO3 0.025g，NaCl0.5g，KH2PO40.05g，MgSO4·7H2O 0.025g，FeSO4·7H2O 0.02g，余量为陈海水，pH值为7.95；
100g发酵罐培养基中：海藻酸钠0.7g，蛋白胨0.3g，诱导剂0.1g，NaNO3 0.025g，NaCl 0.5g，KH2PO40.05g，MgSO4·7H2O 0.025g，FeSO4·7H2O 0.002g，余量为陈海水，pH值为7.0。
实施例1
海藻寡糖的制备方法，具体包括以下步骤：
(1)将保存于斜面培养基中的保藏菌种(土地杆菌、cellulophaga lytica和枯草芽孢杆菌的质量比为5:3:2)接种3环到种子罐中，控制温度为18℃，转速为150rpm，扩大培养12h，得到一级种子液；
(2)将一级种子液按1％的接种量接入摇瓶培养基(液体发酵培养基)中，摇瓶培养基的装液量为100mL/250mL，控制温度为28℃，转速为140rpm，摇瓶培养12h，得到二级种子液；
(3)将二级种子液按1％的接种量接入发酵罐培养基中，控制温度为28℃，转速为150rpm，通气量为4L/min，气压为0.04MPa，溶氧量为30％，发酵培养6h，得到发酵液，备用；
(4)将新鲜的海藻洗净、除杂并剪碎至1cm2大小，然后加热除菌，温度为50℃，时间为10min，冷却，得到待酶解的海藻，备用；
(5)取待酶解的海藻100kg，加入发酵液55kg和氯化钠2.8kg，控制温度为18℃，转速为150rpm，反应22h，过滤，得到降解液；
(6)采用超滤技术对降解液进行分离，膜孔径为0.05nm，压力为0.1Mpa，收集分离液，然后进行真空浓缩，温度为45℃，压力为82.7KPa，时间为2h，得到浓缩液，最后进行微波真空干燥，温度为60℃，压力为88.2KPa，时间为4h，即得海藻寡糖成品。
实施例2
海藻寡糖的制备方法，具体包括以下步骤：
(1)将保存于斜面培养基中的保藏菌种(土地杆菌、cellulophaga lytica和枯草芽孢杆菌的质量比为5:3:1)接种3环到种子罐中，控制温度为24℃，转速为200rpm，扩大培养18h，得到一级种子液；
(2)将一级种子液按3％的接种量接入摇瓶培养基(液体发酵培养基)中，摇瓶培养基的装液量为100mL/250mL，控制温度为32℃，转速为160rpm，摇瓶培养18h，得到二级种子液；
(3)将二级种子液按3％的接种量接入发酵罐培养基中，控制温度为32℃，转速为180rpm，通气量为6L/min气压为0.06MPa，溶氧量为50％，发酵培养10h，得到发酵液，备用；
(4)将新鲜的海藻洗净、除杂并剪碎至2cm2大小，然后加热除菌，温度为60℃，时间为20min，冷却，得到待酶解的海藻，备用；
(5)取待酶解的海藻100kg，加入发酵液45kg和氯化钠2.2kg，控制温度为22℃转速为200rpm，反应26h，过滤，得到降解液；
(6)采用超滤技术对降解液进行分离，膜孔径为1nm，压力为0.5Mpa，收集分离液，然后进行真空浓缩，温度为55℃，压力为90.6KPa，时间为4h，得到浓缩液，最后进行微波真空干燥，温度为80℃，压力为99.2KPa，时间为6h，即得海藻寡糖成品。
实施例3
海藻寡糖的制备方法，具体包括以下步骤：
(1)将保存于斜面培养基中的保藏菌种(土地杆菌、cellulophaga lytica和枯草芽孢杆菌的质量比为1:1:1)接种3环到种子罐中，控制温度为20℃，转速为180rpm，扩大培养16h，得到一级种子液；
(2)将一级种子液按2％的接种量接入摇瓶培养基(液体发酵培养基)中，摇瓶培养基的装液量为100mL/250mL，控制温度为30℃，转速为150rpm，摇瓶培养16h，得到二级种子液；
(3)将二级种子液按2％的接种量接入发酵罐培养基中，控制温度为30℃，转速为160rpm，通气量为5L/min，气压为0.05MPa，溶氧量为40％，发酵培养8h，得到发酵液，备用；
(4)将新鲜的海藻洗净、除杂并剪碎至1cm2大小，然后加热除菌，温度为55℃，时间为15min，冷却，得到待酶解的海藻，备用；
(5)取待酶解的海藻100kg，加入发酵液50kg和氯化钠2.5kg，控制温度为20℃，转速为180rpm，反应24h，过滤，得到降解液；
(6)采用超滤技术对降解液进行分离，膜孔径为0.1nm，压力为0.3Mpa，收集分离液，然后进行真空浓缩，温度为50℃，压力为85.0KPa，时间为3h，得到浓缩液，最后进行微波真空干燥，温度为70℃，压力为85.2KPa，时间为5h，即得海藻寡糖成品。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (10)

1.一种海藻寡糖的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
(1)将保存于斜面培养基中的保藏菌种接种3环到种子罐中扩大培养12-18h，温度为18-24℃，转速为150-200rpm，得到一级种子液；
(2)将一级种子液按1％-3％的接种量接入摇瓶培养基中摇瓶培养12-18h，温度为28-32℃，转速为140-160rpm，得到二级种子液；
(3)将二级种子液按1％-3％的接种量接入发酵罐培养基中发酵培养6-10h，温度为28-32℃，转速为150-180rpm，通气量为4-6L/min，气压为0.04-0.06MPa，溶氧量为30％-50％，得到发酵液，备用；
(4)将新鲜的海藻洗净、除杂并剪碎至1-2cm2大小，然后加热除菌，冷却，得到待酶解的海藻，备用；
(5)向待酶解的海藻中加入发酵液和氯化钠，控制温度为18-22℃，转速为150-200rpm，反应22-26h，过滤，得到降解液；
(6)将降解液进行超滤分离，收集分离液，然后进行真空浓缩，得到浓缩液，最后进行微波真空干燥，即得所述海藻寡糖成品。
2.根据权利要求1所述的一种海藻寡糖的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述保藏菌种为土地杆菌、cellulophaga lytica和枯草芽孢杆菌的混合菌种；
所述土地杆菌的保藏编号为CGMCC No.10828；
所述cellulophaga lytica的保藏编号为CGMCC No.10829；
所述枯草芽孢杆菌的保藏编号为CCTCC：M 2018650。
3.根据权利要求2所述的一种海藻寡糖的制备方法，其特征在于，所述土地杆菌、cellulophaga lytica和枯草芽孢杆菌的质量比为1-5:1-3:1-2。
4.根据权利要求1所述的一种海藻寡糖的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，以质量百分比计，所述斜面培养基的配方为：海藻酸钠0.7％，蛋白胨0.3％，琼脂1.5％，NaNO30.025％，NaCl 0.5％，KH2PO4 0.05％，MgSO4·7H2O 0.025％，FeSO4·7H2O 0.001％，余量为水，pH值为7.2。
5.根据权利要求1所述的一种海藻寡糖的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，以质量百分比计，所述摇瓶培养基的配方为：海藻酸钠0.7％，蛋白胨0.3％，诱导剂0.1％，NaNO30.025％，NaCl 0.5％，KH2PO4 0.05％，MgSO4·7H2O 0.025％，FeSO4·7H2O 0.02％，余量为陈海水，pH值为7.95。
6.根据权利要求1所述的一种海藻寡糖的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，以质量百分比计，所述发酵罐培养基的配方为：海藻酸钠0.7％，蛋白胨0.3％，诱导剂0.1％，NaNO30.025％，NaCl 0.5％，KH2PO4 0.05％，MgSO4·7H2O 0.025％，FeSO4·7H2O 0.002％，余量为陈海水，pH值为7.0。
7.根据权利要求1所述的一种海藻寡糖的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，所述加热除菌的温度为50-60℃，时间为10-20min。
8.根据权利要求1所述的一种海藻寡糖的制备方法，其特征在于，步骤(5)中，所述待酶解的海藻、发酵液和氯化钠的质量比为(18-22):(8-12):(0.4-0.6)。
9.根据权利要求1所述的一种海藻寡糖的制备方法，其特征在于，步骤(6)中，所述超滤分离的膜孔径为0.05-1nm，压力为0.1-0.5Mpa。
10.根据权利要求1所述的一种海藻寡糖的制备方法，其特征在于，步骤(6)中，所述真空浓缩的温度为45-55℃，压力为82.7-90.6KPa，时间为2-4h；所述微波真空干燥的温度为60-80℃，压力为88.2-99.2KPa，时间为4-6h。
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