CN105018544A - 具有促进海参生长和抗逆作用的卡拉胶寡糖及其制法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种促进海参生长和抗逆作用的卡拉胶寡糖及其制备方法和应用，涉及微生物领域。通过本发明方法得到的卡拉胶寡糖，可用于食品、饲料添加剂，保健品和生物农药等，应用广泛。以该卡拉胶寡糖作为饲料添加剂饲喂海参，海参生长情况较好，刺坚挺，活动自如，摄食力强，该寡糖不但对海参生长具有明显的促进作用，还能够提高海参的抗逆作用，增加其抗逆性和免疫机能，是理想的海参饵料添加剂。
Description
技术领域
本发明涉及微生物领域，具体涉及一种具有促进海参生长和抗逆作用的卡拉胶寡糖及其制备方法和应用。
背景技术
卡拉胶是红藻中提取的一种海洋多糖，被主要用于藻胶产业，其具有较高的生物活性，如抗凝、抗病毒、降低胆固醇和抗氧化等作用，但多糖的溶解性不好，较难吸收，使其在生物医药领域应用上受到限制。目前降解多糖的方法主要有物理降解、化学降解和生物降解法。化学降解和物理降解均为随机降解，所得寡糖的分子片段不均一。微生物能够产生具有独特生理活性的酶系，迄今为止，已发现大量可以产生卡拉胶降解酶的微生物，以酶法制备的寡糖，产物均一且硫酸基团未被破坏，分子量相对较小，溶解度提高，易于吸收，且操作简单易行，稳定性好等。
我国海参有140余种，约20种可以食用，其中以分布于黄、渤海域的海参食用价值最大，品质最好。近年来由于需求的增加导致海参过度捕捞，海参的人工养殖业随之兴起，但人工养殖环境、种质退化等因素使海参感染病害的几率增大。在疾病防治过程中抗生素的使用，产生了新的致病菌，从而导致肠道菌群的紊乱产生耐药性等等。抗生素的诸多副作用使人们开始寻找新的代替物，应用天然活性成分代替抗生素是抑制病原微生物生长的一个有效途径。
近年来的研究显示，卡拉胶寡糖具有抗肿瘤、抗氧化、抗菌、抗病毒、抑制血管生成等多种生物活性。但尚未有关于利用酶法制备具有促生长和抗逆性作用的卡拉胶寡糖及其应用的报道。
发明内容
为解决上述问题，本发明的第一个目的是提供一种具有促进海参生长和抗逆作用的卡拉胶寡糖的制备方法及其本身。本发明的另一个目的是提供利用上述卡拉胶寡糖在饲料添加剂中的应用。
本发明的技术方案如下：具有促进海参生长和抗逆作用的卡拉胶寡糖的制备方法，包括以下步骤：
(1)粗酶液的制备
将卡拉胶寡糖降解菌(Cellulophaga lytica：M9)接种到液体培养基中，震荡培养16-20h后以2％接种量进行传代，于35℃气浴摇床上震荡培养，转速120r/min，待菌株稳定后，取发酵液于4℃条件下4000r/min离心20min，取上清液即为粗酶液；
(2)卡拉胶寡糖的制备
将浓度为0.5％的卡拉胶与粗酶液和蒸馏水按照体积比为2:1:1混合，于35℃气浴摇床上震荡，降解36-48h，降解卡拉胶寡糖溶解在溶液中，经透析、干燥获得卡拉胶寡糖粉末。
优选的，所述的步骤(1)中液体培养基为(w/v)：k-卡拉胶0.1％，蛋白胨0.4％，硫酸亚铁0.001％，陈海水适量。
所述的卡拉胶寡糖降解菌，该菌株保藏号为：CGMCC No:10829。
所述的卡拉胶寡糖降解菌株M9分离自中国辽宁省大连市开发区海贝广场海域的浮游海藻样品，经生理生化及16SrDNA鉴定，该菌株分类名为Cellulophaga lytica：M9。
所述的卡拉胶寡糖降解菌株M9已于2015年6月16日提交保藏，具体保藏信息如下：
保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；
保藏日期：2015年6月16日；
保藏编号：CGMCC No.10829。
所述的卡拉胶寡糖降解菌株M9生理化特性为：革兰氏阴性杆菌，黄色菌落，表面有不规则凸起，杆状菌。氧化酶阳性，最适生长温度25℃-35℃，最适氯化钠浓度0.5％-3％。
利用本发明制备方法获得的卡拉胶寡糖的平均相对分子量为1600；平均聚合度为9。
本发明还要求保护卡拉胶寡糖在饲料添加剂中的应用：将制得的卡拉胶寡糖作为添加剂饲喂海参，能够促进海参生长和提高海参的抗逆能力。
本发明的有益效果是：通过本发明酶解法得到的卡拉胶寡糖，其平均聚合度为9，平均分子质量为1600，该产品可用于食品、饲料添加剂、保健品和生物农药等，用途广泛。以该卡拉胶寡糖作为饲料添加剂饲喂海参，发现其生长情况较好，刺坚挺，活动自如，摄食力强，该卡拉胶寡糖不但对海参生长具有明显的促进作用，能够提高海参的增长率，使海参体重增加75.41％，还能够提高海参的抗逆作用，增加其抗逆性和免疫机能，为开发新型饲料添加剂和免疫增强剂奠定基础，是理想的海参饵料添加剂。
附图说明
图1为薄层层析分析卡拉胶寡糖降解情况图；
图2为卡拉胶寡糖对海参抗逆生长作用的影响结果图；
图3为卡拉胶寡糖对海参促生长作用的影响结果图。
具体实施方式
下面以具体实施例对本发明的技术方案作进一步的说明，但本发明不以任何形式受限于实施例内容。实施例中所述实验方法如无特殊说明，均为常规方法；如无特殊说明，所述试剂和生物材料，均可从商业途径获得。
实施例1卡拉胶寡糖降解菌(Cellulophaga lytica：M9)的选育
1、菌种的筛选：
从辽宁省大连市开发区海贝广场海域取适量海藻，用无菌的生理盐水进行梯度稀释，然后将10-2～10-6的稀释液进行平板涂布，将涂布好的平板置于30℃恒温培养箱中培养，48-60h后观察平板，挑取周围有凹陷或者晕圈的单菌落进行条件优化，最后确定实验菌株。
2.卡拉胶寡糖的制备
(1)粗酶液制备
将菌株M9接种到液体培养基中，震荡培养16-20h后以2％接种量进行传代，于35℃气浴摇床上震荡培养，转速120r/min，待菌株稳定后，取发酵液于4℃条件下4000r/min离心20min，取上清液即为粗酶液；液体培养基为(w/v)：κ-卡拉胶：0.1％；蛋白胨0.4％，硫酸亚铁0.001％，陈海水适量，pH自然。
(2)卡拉胶寡糖制备
将浓度为0.5％的卡拉胶与粗酶液和蒸馏水按照2:1:1的体积比混合，于35℃气浴摇床上震荡降解36-48h，降解卡拉胶寡糖溶解在溶液中，经透析、干燥获得卡拉胶寡糖粉末。
对卡拉胶寡糖进行总糖和还原糖含量测定，总糖测定方法采用硫酸-苯酚法，还原糖含量测定采用3,5-二硝基水杨酸法，以葡萄糖作为标准品，经薄层层析鉴定，结果如图1。
经薄层层析鉴定结果如图1所示：左侧点1为葡萄糖标准品，右侧点2为卡拉胶寡糖，从图1可得出卡拉胶寡糖分子量分布情况，所降解卡拉胶寡糖可见两个清晰的寡糖聚合点，分子量大小不等，分离清晰，无拖尾现象；经测定总糖和还原糖含量得出寡糖平均聚合度为9，平均分子量为1600。
实施例2卡拉胶寡糖对海参生长情况的影响
1.将制得的卡拉胶寡糖粉末配合海参基础饲料来饲喂海参，对海参进行为期8周的饲养。早喂食，晚换水，实时监测水温和室温，24h打氧。实验分五组，按寡糖添加量分别为0，0.5％，2.5％，5％，10％的比例加入基础饲料中。海参体重在3.75±0.20g+之间，每天投喂一次，投食量为海参体重的3-5％。每天给海参换水一次，清理残饵及粪便。实时观测水温及室温，观察海参状态，摄食及排便情况。
2.卡拉胶寡糖对海参抗逆性的影响
抗逆生长测试结果如图2所示，由于海参适应了大规模养殖，不适应实验室小规模养殖环境和饲喂方式，实验第10天时，对照组即寡糖添加量为0的海参体重急剧下降，生长率为-13.05％，但寡糖添加组的海参生长情况良好，不同剂量卡拉胶寡糖能够提高海参的抗逆作用，延缓海参的体重下降，增长率分别为-4.84％、-2.17％、-0.12％和3.10％，当卡拉胶寡糖添加量为10％时，生长率为3.10％，并且卡拉胶寡糖添加组海参生长情况较好，刺坚挺，活动自如，摄食力强，说明卡拉胶寡糖增强海参对抗逆环境的能力；
3.卡拉胶寡糖促进海参生长作用
生长率测试结果如图3所示，实验第56天时，即实验第八周，发现卡拉胶寡糖能够明显促进海参的生长，寡糖添加组海参生长状态好，刺坚挺圆润，活动自如，生长率显著高于对照组，其中寡糖添加量为5％和10％组增长率最高，分别为73.57％和75.41％，生长率为对照组的10倍，结果如图3所示：
综上所述，卡拉胶寡糖对海参的生长起显著促进作用；以不同的寡糖添加量配合基础饲料来饲喂海参，寡糖添加组海参平均体重显著增加，生长率随寡糖添加量的增多而升高抗逆性较好，抗氧化酶活性提高，免疫相关因子活性升高。
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序列表
SEQ ID No.1(卡拉胶寡糖降解菌株M9的16S rRNA核苷酸序列)ACGCTAGCGGCAGGCTTAACACATGCAAGTCGAGGGGTAACAGAGGAGCTTGCTCTTGCTGACGACCGGCGCACGGGTGCGTAACGCGTATACAATCTGCCTTACACTAAGGGATAGCCCAGAGAAATTTGGATTAACACCTTATAGTTTATTTTCATGGCATCATTTAAATAATAAAGTTTACGGTGTAAGATGAGTATGCGTCCCATTAGTTTGTTGGTAAGGTAACGGCTTACCAAGACTACGATGGGTAGGGGCCCTGAGAGGGGGATCCCCCACACTGGTACTGAGACACGGACCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGAGGAATATTGGACAATGGAGGAGACTCTGATCCAGCCATGCCGCGTGCAGGAAGACGGTCCTATGGATTGTAAACTGCTTTTATACAGGAAGAATAAGGACTACGTGTAGTCTGGTGACGGTACTGTAAGAATAAGGACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTCCGAGCGTTATCCGGAATTATTGGGTTTAAAGGGTCCGTAGGCGGGCTGTTAAGTCAGGGGTGAAAGTTTGCAGCTCAACTGTAGAATTGCCTTTGATACTGATGGTCTTGAATTATTGTGAAGTGGTTAGAATATGTAGTGTAGCGGTGAAATGCATAGATATTACATAGAATACCGATTGCGAAGGCAGATCACTAACAATTGATTGACGCTGATGGACGAAAGCGTGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGGATACTAGCTGTTTGGATTTCGATCTGAGCGGCCAAGCGAAAGTGATAAGTATCCCACCTGGGGAGTACGTTCGCAAGAATGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGATACGCGAGGAACCTTACCAGGGCTTAAATGTAGATTGACAGGTTTAGAGATAGACTTTCCTTCGGGCAATTTACAAGGTGCTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGCCGTGAGGTGTCAGGTTAAGTCCTATAACGAGCGCAACCCCTGTTGTTAGTTACCAGCACATTATGGTGGGGACTCTAGCAAGACTGCCGGTGCAAACCGTGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCACGGCCCTTACGTCCTGGGCCACACACGTGCTACAATGGTAGGTACAGAGAGCAGCCACTTAGCGATAAGGAGCGAATCTATAAAACCTATCACAGTTCGGATCGGAGTCTGCAACTCGACTCCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGGATATCAGCCATGATCCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCAAGCCATGGAAGCTGGGGGTACCTGAAGTTCGTCACCGCAAGGAGCGACCTAGGG
Claims (4)
1.一种具有促进海参生长和抗逆作用的卡拉胶寡糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)粗酶液的制备
将卡拉胶寡糖降解菌(Cellulophaga lytica：M9)接种到液体培养基中，震荡培养16-20h后以2％接种量进行传代，于35℃气浴摇床上震荡培养，转速120r/min，待菌株稳定后，取发酵液于4℃条件下4000r/min离心20min，取上清液即为粗酶液；
(2)卡拉胶寡糖的制备
将浓度为0.5％的卡拉胶与粗酶液和蒸馏水按照体积比为2:1:1混合，于35℃气浴摇床上震荡，降解36-48h，降解的卡拉胶寡糖溶解在溶液中，经透析、干燥获得卡拉胶寡糖粉末。
2.根据权利要求1所述的制备卡拉胶寡糖的方法，其特征在于，所述的步骤(1)中液体培养基为(w/v)：k-卡拉胶0.1％，蛋白胨0.4％，硫酸亚铁0.001％，陈海水适量。
3.一种按照权利要求1所述的制备方法获得的卡拉胶寡糖，其特征在于，该卡拉胶寡糖的平均相对分子量为1600；平均聚合度为9。
4.一种利用如权利要求1所述的制备方法获得的卡拉胶寡糖在饲料添加剂中的应用，其特征在于，将制得的卡拉胶寡糖作为添加剂饲喂海参，能够提高海参的抗逆能力，促进海参生长。
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