CN103266074B - 一种枯草芽孢杆菌菌株及其应用 - Google Patents
一种枯草芽孢杆菌菌株及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明的目的是提供一株枯草芽孢杆菌及其在畜禽养殖中的应用，所述枯草芽孢杆菌筛选自健康仔猪的新鲜粪样，具有很强的产淀粉酶、蛋白酶和纤维素酶的能力，可作为饲料添加剂应用于畜禽饲料中，能有效提高养殖动物的生产性能，应用前景广阔。
Description
技术领域
本发明属于微生物筛选、应用技术领域，具体涉及一种枯草芽孢杆菌菌株及其应用。
背景技术
在畜禽类养殖中，抗生素因能有效的减少畜禽的发病率，提高畜禽生长效率而被广泛应用于畜禽饲料中。但抗生素滥用引起的问题日益受到关注，例如耐药性病原菌增加，畜禽产品药残超标、影响畜禽肠道内微生态平衡和畜禽食品安全性等。对此欧盟已全面禁止饲料中使用抗生素促生长饲料添加剂。为了应对这些问题，采用益生菌微生态制剂来替代抗生素成为当前畜禽养殖的热点。
益生菌在其生长代谢过程中，会分泌产生多种酶类，如淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶等，这些酶的产生可提高饲料利用率，提高动物生长性能。其次益生菌其自身作为一种单细胞蛋白，也可作为动物营养的一部分，促进动物生长。因此，微生态制剂作为一种新型的无毒副作用、无耐药性、无残留的抗生素替代品具有广阔的研究和开发前景。但制备微生物制剂首先需要筛选出具有良好效果的益生菌。
发明内容
本发明的目的是提供一株枯草芽孢杆菌及其在畜禽养殖中的应用，所述枯草芽孢杆菌筛选自健康仔猪的新鲜粪样，具有很强的产淀粉酶、蛋白酶和纤维素酶的能力，可作为饲料添加剂应用于畜禽饲料中，以弥补现有技术的不足。
本发明一方面提供了一株枯草芽孢杆菌，该菌株命名为枯草芽孢杆菌BW2（Bacillus subtilis BW2），已于2013年5月20日保藏于中国武汉 武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO:M 2013222。
本发明的枯草芽孢杆菌BW2应用于饲料添加剂领域。
本发明的另一个方面提供一种包含上述枯草芽孢杆菌BW2的微生物制剂。
上述的微生物制剂为枯草芽孢杆菌BW2的菌粉，按质量百分比为0.2%-0.8%的比例添加至畜禽饲料中。
本发明的枯草芽孢杆菌BW2具有很高的产酶能力，可作为饲料添加剂应用于畜禽饲料中，能有效提高养殖动物的生产性能，应用前景广阔。
具体实施方式
实施例1 枯草芽孢杆菌BW2分离筛选及鉴定：
1、菌株初筛
采集健康仔猪新鲜粪样6份，分别称取5g样品，加入45mL无菌水，制备成悬液，经80℃水浴处理杀死非芽孢营养体后，涂布于LB平板上，37℃培养48小时，获得48株芽孢杆菌。
2、产酶芽孢杆菌筛选
1）α-淀粉酶检测：
淀粉培养基：蛋白胨10g、牛肉膏5g、NaCl 5g、可溶性淀粉2g、蒸馏水1000ml、琼脂粉20g。
将分离到的菌株点种到培养基上，37℃培养24-48小时，在培养基表面滴加适量碘液使均匀布满整个平板，如果菌落周围出现无色透明圈，说明淀粉已被水解。
2）蛋白酶检测：
牛奶培养基：脱脂牛奶50ml、蒸馏水50ml、琼脂粉1.5g。
将分离到的菌株点种到牛奶培养基，37℃培养24-48小时，如果菌落周围有透明圈产生说明酪蛋白已经被水解。
3）纤维素培养基：营养琼脂+0.5%CMC。
将分离到的菌株点种到纤维素培养基，37℃培养24-48小时，用0.1%刚果红溶液染色30分钟，再用1moL/L氯化钠脱色20分钟左右，如果菌落周围出现透明水解圈，说明CMC已经被水解。
4）经过产酶实验，筛选得到一株淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶产量均较高的菌株，对此菌株进一步鉴定分析。
3、芽孢杆菌分类学鉴定
采用分子生物学的方法对筛选得到的高产酶菌株进行鉴定，测得其16s rDNA序列，在GenBank核酸数据库中进行blast比对，通过序列比对确认为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），命名为枯草芽孢杆菌BW2（Bacillus subtilis BW2），并于2013年5月20日保藏于中国武汉 武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2013222。.
实施例2：枯草芽孢杆菌BW2产酶实验
1、α-淀粉酶检测：
淀粉培养基：蛋白胨10g、牛肉膏5g、NaCl 5g、可溶性淀粉2g、蒸馏水1000ml、琼脂粉20g。
将分离到的菌株点种到培养基上，37℃培养24-48小时，在培养基表面滴加适量碘液使均匀布满整个平板，如果菌落周围出现无色透明圈，说明淀粉已被水解。测量透明圈直径与菌落直径的比值。
2、蛋白酶检测：
牛奶培养基：脱脂牛奶50ml、蒸馏水50ml、琼脂粉1.5g。
将分离到的菌株点种到牛奶培养基，37℃培养24-48小时，如果菌落周围有透明圈产生说明酪蛋白已经被水解。测量透明圈直径与菌落直径的比值。
3、纤维素培养基：营养琼脂+0.5%CMC。
将分离到的菌株点种到纤维素培养基，37℃培养24-48小时，用0.1%刚果红溶液染色30分钟，再用1moL/L氯化钠脱色20分钟左右，如果菌落周围出现透明水解圈，说明CMC已经被水解。测量透明圈直径与菌落直径的比值。
枯草芽孢杆菌BW2的产酶情况如下表所示：
由表中可以看出，枯草芽孢杆菌BW2具有很强的产淀粉酶、蛋白酶和纤维素酶能力，三种酶的透明圈直径与菌落直径比均在5.0左右，因此本发明筛选的枯草芽孢杆菌BW2在动物微生态的应用上有很大的潜力。
实施例3：枯草芽孢杆菌BW2菌粉的制备
1、种子液制备：挑一环新鲜的枯草芽孢杆菌BW2菌泥，接种于100mLLB培养基中（500mL三角瓶装液100mL），37℃、200rpm培养12-16h即成种子液；
2、发酵培养：将上述种子液以5-10%接种量接种至灭菌营养肉汤培养基中，37℃、200rpm培养28-32h，镜检芽孢产率在95%以上时停止发酵培养；
3、菌粉制备：将发酵液离心（8000rpm，5min）收集菌体，加入糊精搅拌混匀，真空冷冻干燥，制成菌量为500-1000亿/g的枯草芽孢杆菌BW2菌粉。
实施例4：枯草芽孢杆菌BW2对肉鸡生产性能的影响
将240只生长良好、体重相近的21日龄肉鸡随机分为2组，每组6个重复，每个重复20只，Ⅰ组为对照组，饲喂普通商品日粮，Ⅱ组为实验组，在普通商品日粮基础上添加质量百分比为0.2%的枯草芽孢杆菌BW2粉剂。试验期为21天，测量肉鸡的平均日增重和料肉比。实验结果如下表所示：
| 组别 | 平均日增重（g） | 料肉比 |
| Ⅰ | 62.42±4.73 | 1.57±0.08b |
| Ⅱ | 65.28±4.69 | 1.41±0.09a |
由上表中试验结果可以看出，21日龄肉鸡饲养21天以后，Ⅱ组（实验组）肉鸡平均日增重比Ⅰ组（对照组）增加2.86g，肉鸡料肉比降低0.13，与Ⅰ组（对照组）差异显著（P＜0.05）。本试验结果表明日粮中添加枯草芽孢杆菌BW2能显著提高肉鸡的生产性能，降低日粮成本，增加经济收益。枯草芽孢杆菌BW2在肉鸡饲料中添加有很好的应用前景。
Claims (4)
1.一种枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述的枯草芽孢杆菌的保藏编号为CCTCC NO:M2013222。
2.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌作为饲料添加剂的应用。
3.一种微生物制剂，所述的微生物制剂为权利要求1所述的枯草芽孢杆菌的菌粉。
4.权利要求3所述的微生物制剂的应用方法，是将所述的微生物制剂按质量百分比为0.2%-0.8%添加至畜禽饲料中。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
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| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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Owner name: SHANDONG CONTINENT BIOTECH CO., LTD. Effective date: 20131017 |
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| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20131017 Address after: 251719, Huimin County, Shandong Province, Binzhou Economic Development Zone (Stone Town, sand nest, forest farm) Applicant after: SHANDONG VLAND BIOTECH CO.,LTD. Applicant after: SHANDONG KDN BIOTECH Co.,Ltd. Address before: 251719, Huimin County, Shandong Province, Binzhou Economic Development Zone (Stone Town, sand nest, forest farm) Applicant before: SHANDONG VLAND BIOTECH CO.,LTD. |
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| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20231211 Address after: 251702 Road West, 1 kilometer north of the intersection of Hefang Daji Road and Sunwu Road in Huimin County, Binzhou City, Shandong Province Patentee after: Yingchuang Ulan Biotechnology (Shandong) Co.,Ltd. Address before: 251719 Economic Development Zone, Huimin County, Binzhou City, Shandong Province (Shawo forest farm, Shimiao town) Patentee before: SHANDONG VLAND BIOTECH CO.,LTD. Patentee before: SHANDONG KDN BIOTECH Co.,Ltd. |