CN105219682B

CN105219682B - 一种替代抗生素饲料添加剂的地衣芽孢杆菌及其应用

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Publication number: CN105219682B
Application number: CN201510749342.8A
Authority: CN
Inventors: 岳寿松; 王翠萍; 边斐; 张燕; 陈高; 葛海涛; 马德源; 刘国霞
Original assignee: Biotechnology Research Center of Shandong Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Biotechnology Research Center of Shandong Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2015-11-03
Filing date: 2015-11-03
Publication date: 2018-07-10
Anticipated expiration: 2035-11-03
Also published as: CN105219682A

Abstract

本发明涉及一种替代抗生素饲料添加剂的地衣芽孢杆菌及其应用。一株地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)SDZD02，于2015年4月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC NO.10682。本发明通过液体深层发酵、板框压滤、沸腾干燥技术制得替代畜牧业抗生素饲料添加剂，有效活菌数量不少于2.0×10¹⁰CFU/克，其用于现代畜牧业中，替代抗生素饲料添加剂，具有促进生长、防病抗病，提高饲料转化率，无残留、无污染等特点。

Description

一种替代抗生素饲料添加剂的地衣芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及一种地衣芽孢杆菌及其应用，特别涉及一种替代抗生素饲料添加剂的地衣芽孢杆菌及其应用，属于农业生物技术领域。

背景技术

抗生素在畜牧业中作为抗菌促生长剂已有60多年的历史。抗生素作为促生长剂大幅度降低饲养成本、发病率和死亡率，提高动物生产性能，从而显著提高畜牧业的劳动生产率和经济效益。但抗生素长期使用直接危害人类健康和公共卫生，长期低剂量饲用抗生素增加细菌的抗药性，加速了“超级细菌”的产生；饲用药物以原形或代谢物的形式随动物排泄物排放于环境中，也会直接导致环境生态的改变，并污染水源和土壤，养殖业排放到环境中的抗生素已成为一种新的重要污染源，并引起了日益严峻的社会问题。目前世界上有20多种抗生素及十几种合成抗菌剂药物被应用到饲料中。饲用抗生素存在的主要问题表现在：①破坏动物体内原有的微生态平衡，造成对抗生素非敏感的微生物大量繁殖，从而产生了新的感染；②耐药菌的产生，有抗药性的病原微生物大量繁殖后，就可能使人和动物患病机会增多，并给疾病的治疗带来了困难，甚至使抗生素失去作用；③畜禽产品中抗生素的残留，对人体健康带来威胁；④机体免疫力下降，更容易感染疾病。近年来，消费者对“无抗”畜产品的呼声也越来越高，一些国家已开始限制饲用抗生素的使用，瑞士在1992年即禁止使用饲用抗生素；2006年欧洲规定饲料中禁止添加抗生素，2013年美国FDA明确三年后饲料中禁止添加抗生素。2015年9月1日我国农业部公告第2292号，规定在我国食品动物中禁止使用洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星4种兽药。

20世纪80年代以来，研究开发饲料中抗生素替代产品日益受到重视。饲用微生物制剂作用功能与抗生素添加剂最相近，而且不存在耐药性二重感染和有害物质残留等抗生素弊端，而且可改善畜产品肉质风味，有利于生态环境，是最有潜力的抗生素饲料添加剂替代产品。

目前欧洲等发达国家的无抗生素和生长促进剂饲料及养殖从技术到产业处于领先水平，其主要措施是通过添加微生物和酶制剂等现代生物技术措施，通过肠道保健，达到促生长和防病抗病目的，实现对抗生素的替代。我国在无抗生素饲料添加剂领域起步较晚，从理论研究的系统深入性和产业化推广应用均与发达国家存在较大差距。

中国专利文献CN101965912A(申请号CN201010274044.5)公开了一种替代抗生素的微生物饲料添加剂，主要由枯草芽孢杆菌、酿酒酵母菌、黑曲霉菌、米曲霉菌等组成；其制备方法为：各菌种的母种由液态发酵而成，生产种由母种固态发酵而成，生产种进一步固态发酵得到菌种，将菌种按一定比例混合即得本微生物饲料添加剂。该添加剂能提高动物非特异免疫力，增强机体抗应激能力，激活动物生长潜能，全面提高生产性能，解决畜禽产品品质低下、风味缺失，仔猪腹泻、母猪便秘、鸡鸭粪便稀溏，饲料原料抗营养因子多、消化利用低的问题。

中国专利文献CN103005210A(申请号CN201210569755.4)公开了一种可替代抗生素的猪饲料添加剂，其配方中的组分及其重量份数为：神曲1-5份、当归1-5份、黄芪1-5份、山楂1-5份、党参1-5份；柠檬酸10-20份，乳酸10-20份，包被磷酸20-30份，微生态制剂5-10份，酵母细胞壁多糖5-10份，复合植物精油1-5份以及载体5-10份。

以上专利文献，没有明确使用地衣芽孢杆菌，利用酿酒酵母菌、黑曲霉菌、米曲霉菌等菌种进行，采用发酵效率较低的固体发酵技术，通过提高动物非特异免疫力，增强机体抗应激能力，提高动物生产性能，没有明确替代抗生素的种类和作用机制；有的是与中药、有机酸等配合，没有突出说明在专利产品中微生态制剂的具体种类和在产品中起的作用。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种地衣芽孢杆菌及其应用。

本发明的技术方案如下：

一株地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)SDZD02，于2015年4月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC NO.10682。

上述地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)SDZD02在制备替代畜牧业饲料抗生素添加剂中的应用。

根据本发明优选的，所述替代畜牧业抗生素饲料添加剂，地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)SDZD02含量不少于2.0×10¹⁰CFU/克。

上述替代畜牧业抗生素饲料添加剂的制备方法，步骤如下：

(1)取活化后的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)SDZD02斜面种子，在无菌条件下接种于摇瓶培养基中，培养得摇瓶种子液；

(2)将步骤(1)制得的摇瓶种子液接种于种子培养基中，在通气搅拌条件下发酵罐培养，制得发酵罐种子液；

(3)将步骤(2)制得的发酵罐种子液接种于发酵培养基进行发酵培养，至芽孢率高于90％；然后将发酵液经70～85℃处理25～40分钟，制得芽孢含量不低于2.0×10¹⁰CFU/mL的发酵液；

(4)将步骤(3)制得的发酵液经过滤、干燥，制得地衣芽孢杆菌菌粉，加入稀释剂，制得地衣芽孢杆菌芽孢含量不低于2.0×10¹⁰CFU/克的替代畜牧业抗生素饲料添加剂。

根据本发明优选的，所述步骤(1)中的活化后的地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)SDZD02斜面种子，采用如下方法制备：

将地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)SDZD02接种于活化培养基中，32～35℃活化培养34～40h，制得活化后的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)SDZD02斜面种子；

所述活化的固体培养基，每升组分如下：

蛋白胨10克，酵母膏5克，氯化钠10克，琼脂粉15克，蒸馏水定容至1L。

根据本发明优选的，所述步骤(1)中摇瓶培养为：32～35℃、转速180～200rpm的条件下，摇瓶培养16～24h，摇瓶培养基占摇瓶总体积的65～70％；

所述摇瓶培养基，每升组分如下：

蛋白胨10克，酵母膏5克，氯化钠10克，蒸馏水定容至1L。

根据本发明优选的，所述步骤(2)中，发酵罐培养为：温度32～35℃、通气量为1∶(1.0～1.1)发酵液体积m³/空气体积m³·分钟、压力0.015～0.02MPa、搅拌速度为220～260rpm的条件下，发酵罐培养16～20h；接种量为2～5％(体积百分比)，种子培养基占发酵罐体积的65～70％；

所述种子发酵培养基组分如下，均为重量份：

蛋白胨0.1～2份、酵母膏0.1～2份、玉米淀粉0.2～2份、大豆粉0.2～3份、氯化钠0.01～0.2份、硫酸氨0.02～0.1份、硫酸锰0.01～0.5份，水90.2～99.36份。

根据本发明优选的，所述步骤(3)中，发酵培养为：温度32～35℃，通气量为1∶(1.0～1.1)发酵液体积m³/空气体积m³·分钟，压力0.015～0.02MPa，搅拌速度为200～240rpm，发酵培养16～20h；接种量为5～10％(体积百分比)，发酵培养基占发酵罐体积的60～70％；

所述发酵培养基组分如下，均为重量份：

玉米淀粉0.5～5份、豆饼粉0.5～4份、糖蜜0.3～2份、氯化钠0.01～0.2份、硫酸氨0.02～0.1份、硫酸锰0.01～0.5份，水88.4～98.67份。

根据本发明优选的，所述步骤(4)中过滤为通过加入助滤剂和过滤剂，然后进行板框压滤；进一步优选的，所述助滤剂为氯化钙，过滤剂为轻质碳酸钙。

根据本发明优选的，所述步骤(4)中，干燥为沸腾干燥，干燥进风口温度为100～110℃。

根据本发明优选的，所述步骤(4)中，稀释剂为轻质碳酸钙。

上述培养基中的原料均为本领域常用配制培养基原料，均可市场购得。

有益效果

本发明首次发现了地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)SDZD02菌株，通过深层液体发酵技术，最大限度提高发酵效率并保持菌种的活性功能，可以替代抗生素饲料添加剂，具有促进生长、防病抗病，提高饲料转化率，无残留、无污染等特点。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步说明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1

上述地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)SDZD02为发明人从土壤中分离筛选并鉴定。该菌2015年4月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC NO.10682。

该菌革兰氏阳性，直杆状，培养48小时形成大量芽孢，孢子囊柱状，次端生，壁薄，孢子囊不膨胀，菌体大小0.6～0.8μm×1.5～3.0μm，芽孢大小0.6～0.8μm×1.0～1.5μm。可以在15℃～55℃温度下生长，最适生长温度范围为30℃～40℃；该菌可以在NaCl浓度为0.1％～8％范围内生长良好，当NaCl浓度为12％时，生长被抑制；最适生长pH范围为7.0～8.0；该菌的生理生化特征与伯杰鉴定手册中Bacillus licheniformis的典型特征完全一致。

使用细菌通用16s引物扩增SDZD02基因组DNA，得到约1400pb碱基克隆产物，经测序分析，此序列长度为1424bp，将该序列进行分子系统进化分析，知该菌株与Bacilluslicheniformis 16sDNA序列具99％相似性，分子鉴定结果表明SDZD02为Bacilluslicheniformis属。

实施例2

实施例1所述地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)SDZD02在制备替代畜牧业饲料抗生素添加剂中的应用。

上述替代畜牧业饲料抗生素添加剂的制备方法，步骤如下：

(1)将地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)SDZD02接种于活化培养基中，32℃活化培养34h，制得活化后的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)SDZD02斜面种子；

所述活化的固体培养基，每升组分如下：

将活化后的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)SDZD02，于无菌条件下，接种于121℃灭菌摇瓶培养基中，摇瓶三角瓶培养基装量为容积的60％，培养温度32℃，转速200rpm，培养时间16h，得摇瓶种子液；

摇瓶培养基组分如下，均为重量份：

蛋白胨10份，酵母膏5份，氯化钠10份，蒸馏水75份。

(2)将步骤(1)制得的摇瓶种子液以体积百分比4％的接种量接种于种子培养基中，在通气搅拌条件下发酵罐培养，种子培养基占罐体容体积的65％，培养温度32℃、通气量以发酵液体积m³/空气体积m³·分钟计为1∶1.0、罐压0.02MPa，搅拌速度为230rpm，发酵罐培养17h，，制得发酵罐种子液；

所述种子培养基组分如下，均为重量份：

蛋白胨0.5份、酵母膏0.5份、玉米淀粉1份、大豆粉1.5份、氯化钠0.05份、硫酸氨0.05份、硫酸锰0.1份，水96.3份；

(3)将步骤(2)制得的发酵罐种子液按照体积百分比8％的接种量接种于发酵培养基进行发酵培养，在温度32℃、通风量为1∶1.0、罐压为0.02MPa、搅拌速度为220rpm的条件下，发酵培养20h，经检测，芽孢率高于90％；然后将发酵液经80℃处理30分钟，得到芽孢含量为2.3×10¹⁰FU/mL的发酵液；

所述的发酵培养基组分如下，均为重量份：

玉米淀粉2份、豆饼粉2份、糖蜜1份、氯化钠0.05份、硫酸氨0.04份、硫酸锰0.2份，水95.71份。

(4)将步骤(3)制得的发酵液加入助滤剂氯化钙和过滤剂轻质碳酸钙，板框压滤，沸腾干燥，制得地衣芽孢杆菌菌粉，加入轻质碳酸钙，制得地衣芽孢杆菌芽孢含量为2.0×10¹⁰CFU/克的替代畜牧业抗生素饲料添加剂。

实施例3

如实施例2所述的地衣芽孢杆菌制备方法，不同之处在于，

所述步骤(3)中，发酵培养步骤如下：

将步骤(2)制得的发酵罐种子液按照体积百分比10％的接种量接种于发酵培养基进行发酵培养，在温度35℃、通风量为1∶1.1、罐压为0.02MPa、搅拌速度为230rpm的条件下，发酵培养16h，经检测，芽孢率高于90％；然后将发酵液经80℃处理30分钟，得到芽孢含量为2.5×10¹⁰FU/mL的发酵液

所述的发酵培养基组分如下，均为重量份：

玉米淀粉4份、豆饼粉3份、糖蜜1份、氯化钠0.1份、硫酸氨0.1份、硫酸锰0.3份，水91.5份。

所述步骤(4)制得菌量为2.6×10¹¹CFU/克的地衣芽孢杆菌菌粉，用轻质碳酸钙作为稀释剂配成含有地衣芽孢杆菌2.0×10¹⁰CFU/克的饲料添加剂。

试验例1本发明地衣芽孢杆菌饲料添加剂替代金霉素养殖试验

用实施例2所制得的替代畜牧业抗生素饲料添加剂替代金霉素进行养殖试验。使用剂量为每吨全价料添加800克。

本试验采用单因子随机试验设计，将1200只15日龄AA鸡随机分为3组，即对照组、处理组1、处理组2，每组设4个重复，每个重复100只肉仔鸡，分养在相临的12个栏内，要求各组肉仔鸡平均体重差异不显著(P＞0.05)。对照组日粮中不加复合芽孢杆菌制剂和促生长剂金霉素；处理1日粮中添加金霉素600克/吨全价饲料(推荐使用量；处理组2日粮中添加本发明地衣芽孢杆菌制剂800g/吨全价饲料g。基础日粮配制标准参照中华人民共和国农业部2004年发布的鸡饲养标准(NY/T 33-2004)。整个试验期保持肉仔鸡自由采食，自由饮水，肉仔鸡在育成舍地面平养，木屑垫料，为保持舍内温度，舍内半通风，免疫按试验场自定免疫程序进行、搞好环境卫生，其它按《肉仔鸡饲养管理手册》进行。

试验结果

各处理组平均个体日增重、日耗料量、料肉比及死淘率情况见表1。与对照组相比，金霉素组试鸡只均日增重比对照组提高0.56％；本发明地衣芽孢杆菌制剂试鸡只均日增重提高0.60％，与对照相比均达到显著水平，本发明地衣芽孢杆菌制剂与金霉素相比差异不显著(表1)。本发明地衣芽孢杆菌制剂料肉比与对照相比下降0.11，与金霉素基本一致。本发明地衣芽孢杆菌制剂和金霉素均降低了鸡只死亡数量，与对照相比达到显著水平(P＜0.05)，地衣芽孢杆菌和金霉素差异不明显(p＞0.05)。

表1 各试验组肉鸡的生产性能

注：数值后面小写字母相同表差异不显著(p＞0.05)，字母不同表示差异显著(P＜0.05)。

结论：肉鸡日粮中添加800mg/kg的本发明替代畜牧业抗生素饲料添加剂替代金霉素是可行的，且有改善肉鸡生产性能的趋势，同时降低了饲料成本，提高肉鸡养殖效益。

试验例2本发明地衣芽孢杆菌制剂对断奶仔猪生长性能及健康状况的影响

用实施例2所制得的替代畜牧业抗生素饲料添加剂替代抗生素硫酸粘杆菌素进行养殖试验。试验在德州市某大型养殖场进行。

本试验采用单因子随机试验设计，试验根据品种相同、体重和日龄相近的原则选择断奶仔猪(杜长大)150头，随机分为3组，即对照组、抗生素(硫酸粘杆菌素)处理组、地衣芽孢杆菌处理组。各组仔猪初始平均体重差异不显著(P＞0.05，表2)。对照组日粮中不加合地衣芽孢杆菌和硫酸粘杆菌素，抗生素处理为日粮中添10％硫酸粘杆菌素80g/吨(国家推荐使用量)；芽孢杆菌处理为日粮中添加本发明的地衣芽孢杆菌制剂1000g/吨。基础日粮配制标准参照中华人民共和国GB/T5915-93仔猪、生长肥育猪配合饲料标准。试验周期从乳猪断奶(35d)到65日龄。试验组和对照组饲养于同样的环境中，由同一饲养员饲养管理，统一的饲养管理方式，按正常免疫程序对猪进行免疫。

表2 各试验组仔猪平均初始体重(kg)

组别	对照组	抗生素组	地衣芽孢杆菌组
				平均初始体重	12.26±0.61	11.77±0.69	11.12±0.50

试验结果

试验结果表明，各处理平均增重、料肉比、腹泻率和死淘率存在显著差异。本发明地衣芽孢杆菌与提抗生素处理和对照比显著提高了平均增重、明显降低了料肉比(表3)。抗生素处理和本发明处理还显著降低了仔猪腹泻率和死亡率，抗生素处理腹泻率下降了20.18个百分点，本发明地衣芽孢杆菌处理下降了19.1个百分点；抗生素组死淘率比对照组下降了10个百分点，本发明地衣芽孢杆菌组没有死亡现象发生，优于抗生素处理组。本发明微生物处理与对照和抗生素处理相比，料肉比分别降低0.16和0.17，说明微生物处理组大幅度提高了饲料转化效率。

表3 不同处理对仔猪饲料转化率(料肉比)和抗病性能的影响

组别	对照组	抗生素组	芽孢杆菌组
				试验末平均体重(kg)	27.78±1.09a	26.29±1.57a	28.40±0.89b
平均增重(kg)	15.5a	14.5a	17.3b
				平均耗料量(kg)	21.2a	20.1b	20.7b
料肉比	1.37	1.38	1.21
				腹泻率	26.5％	6.32％	7.40％
死亡数量	7	2	0
				死淘率	14％	4％	0

结论：仔猪日粮中添加本发明替代饲料添加剂抗生素药物硫酸粘杆菌素，而且在饲料转化率方面更优于抗生素处理。

Claims

1.一株地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）SDZD02，于2015年4月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC NO.10682。

2.如权利要求1所述的地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）SDZD02在制备替代畜牧业饲料抗生素添加剂中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述替代畜牧业抗生素饲料添加剂，地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）SDZD02含量不少于2.0×10¹⁰CFU/克。

4.权利要求2中所述替代畜牧业抗生素饲料添加剂的制备方法，步骤如下：

（1）取活化后的地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）SDZD02斜面种子，在无菌条件下接种于摇瓶培养基中，培养得摇瓶种子液；

（2）将步骤（1）制得的摇瓶种子液接种于种子培养基中，在通气搅拌条件下发酵罐培养，制得发酵罐种子液；

（3）将步骤（2）制得的发酵罐种子液接种于发酵培养基进行发酵培养，至芽孢率高于90%；然后将发酵液经70～85℃处理25～40分钟，制得芽孢含量不低于2.0×10¹⁰ CFU/mL的发酵液；

（4）将步骤（3）制得的发酵液经过滤、干燥，制得地衣芽孢杆菌菌粉，加入稀释剂，制得地衣芽孢杆菌芽孢含量不低于2.0×10¹⁰ CFU/克的替代畜牧业抗生素饲料添加剂。

5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中的活化后的地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）SDZD02斜面种子，采用如下方法制备：

将地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）SDZD02接种于活化培养基中，32～35℃活化培养34～40h，制得活化后的地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）SDZD02斜面种子；

所述活化的固体培养基，每升组分如下：

6.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中摇瓶培养为：32～35℃、转速180～200 rpm的条件下，摇瓶培养16～24h，摇瓶培养基占摇瓶总体积的65～70%；

所述摇瓶培养基，每升组分如下：

蛋白胨10克，酵母膏5克，氯化钠10克，蒸馏水定容至1L。

7.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中，发酵罐培养为：温度32～35℃、通气量为1∶（1.0～1.1）发酵液体积m³/空气体积m³·分钟、压力0.015～0.02MPa、搅拌速度为220～260rpm的条件下，发酵罐培养16～20h；接种量为2～5％（体积百分比），种子培养基占发酵罐体积的65～70%；

所述种子发酵培养基组分如下，均为重量份：

8.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中，发酵培养为：温度32～35℃，通气量为1∶（1.0～1.1）发酵液体积m³/空气体积m³·分钟，压力0.015～0.02MPa，搅拌速度为200～240rpm，发酵培养16～20h；接种量为5～10%（体积百分比），发酵培养基占发酵罐体积的60～70%；

所述发酵培养基组分如下，均为重量份：

9.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（4）中过滤为通过加入助滤剂和过滤剂，然后进行板框压滤。

10.如权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述助滤剂为氯化钙，过滤剂为轻质碳酸钙。

11.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（4）中，干燥为沸腾干燥，干燥进风口温度为100～110℃。

12.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（4）中，所述步骤（4）中，稀释剂为轻质碳酸钙。