CN103160455A

CN103160455A - 凝结芽孢杆菌的芽孢制剂的制备方法

Info

Publication number: CN103160455A
Application number: CN2013101011812A
Authority: CN
Inventors: 王云龙; 吴勃
Original assignee: HANGZHOU BIOCOM BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: HANGZHOU BIOCOM BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2013-03-27
Filing date: 2013-03-27
Publication date: 2013-06-19
Anticipated expiration: 2033-03-27
Also published as: CN103160455B

Abstract

本发明提出了一种凝结芽孢杆菌的芽孢制剂的制备方法，包括：(a)斜面菌体活化；（b）凝结芽孢杆菌的种子罐培养；（c）凝结芽孢杆菌的固体发酵；将步骤（b）中的培养基按1%～10%的重量比接入固体发酵培养基中，采用半封闭式发酵48～72h。本发明采用半封闭式固体发酵工艺，在发酵过程中物料处于半封闭状态，与少量空气接触，生长期可以充分利用残余氧气使凝结芽孢杆菌菌体大量繁殖，生长后期氧气大量减少，刺激芽孢快速形成，同时可以代谢较多的L-乳酸，解决发酵过程中产酸不足的情况，通过夺氧作用抑制杂菌的生长，解决固体发酵污染的情况。

Description

凝结芽孢杆菌的芽孢制剂的制备方法

技术领域

本发明涉及微生物发酵技术领域，特别是指一种凝结芽孢杆菌的芽孢制剂的制备方法。

背景技术

近年来频发的“瘦肉精”、“多宝鱼”、“红心鸭蛋”等事件，敲响了国民对食品安全的警钟，也引起了党和政府及广大人民群众的高度关注。传统畜牧养殖业都是以追求高饲料报酬、高生长速度，以低成本提高经济效益，以牺牲环境和消耗资源作为代价而发展。而我国畜牧业在一定历史阶段内仍要在农业经济中占很大比例，因此，发展高效无公害养殖生产技术是我国畜牧业发展必然之路。无公害饲料添加剂是生产无公害畜产品的重要环节，是发展安全、高效、优质的绿色养殖业的关键技术。

我国作为世界第一养猪及猪肉消费大国，由于养猪业的集约化和规模化发展，在饲料中添加抗生素作为生长促进剂极为普遍。滥用抗生素会抑杀动物体内生理性有益微生物，扰乱胃肠道有益菌群区系平衡，造成了某些致病菌过多繁殖而引起内源性感染；抗生素的长期使用还会产生耐药性和免疫功能下降，甚至导致动物发病或死亡；抗生素在畜产品的肉、内脏、奶、蛋中残留，还直接威胁人类的健康与安全。欧盟自1999年1月1日起全面禁用抗生素作为饲料添加剂并积极寻求抗生素替代品，其它许多国家也逐渐开始限制或禁止某些抗生素在畜禽饲料中应用。抗生素残留已使我国的畜牧产品难以通过国外的技术壁垒,令我国的畜牧产品出口蒙受着巨大的损失。但就国内目前的养殖环境下一旦禁用抗生素后，必将对养猪业的生产效能造成巨大的影响。因此，抗生素替代猪用微生态制剂的研究成为养猪业饲料添加剂中最为瞩目的技术，也是当前和今后我国畜牧经济发展需要解决的重要而迫切的科技问题。

益生菌是近年来国内外迅速崛起的一类微生态制剂，因其具有改善肠道功能、维持肠道内菌群平衡和提高机体健康水平的作用、能够有效避免服用抗生素带来的耐药性和二重感染等问题的优点，作为抗生素生长促进剂的替代品而备受世人瞩目。乳酸菌作为其中最重要的一类益生菌被广泛地应用于食品、医疗、保健、畜牧业和水产等行业。但由于其对环境的抗逆性差，故而乳酸菌活菌制剂普遍存在保存性差、易失活等缺点，极大地制约着其产业化发展。本发明所应用的凝结芽孢杆菌正好可弥补这一缺憾。凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)又称乳酸芽孢杆菌，是一类能形成芽孢的产乳酸细菌。凝结芽抱杆菌除了具备普通乳酸菌所具有的维持肠道微生态平衡，刺激免疫，提高机体健康水平，提高人和动物消化功能等作用外，同时由于能形成芽孢以休眠体形式在动物体内的特定位点激活，具有普通乳酸菌所不具备的环境抗逆性强、抗胃酸、抗干燥、耐高温高压、易贮存、效果稳定等独特的生物特性。这就使得它作为微生态益生菌在众多应用领域中十分瞩目，特别是在饲料领域中的应用。1992年,美国食品与药物管理局(FDA)和美国饲料控制官员协会批准了42种饲用微生物饲料添加剂名单,其中有5种芽孢杆菌,凝结芽孢杆菌被放在了第一位。我国对饲用凝结芽孢杆菌的应用研究相对起步较晚，目前还处于初级阶段。

要求日益提高。用地限制、环境污染等不断凸现的瓶颈性因素，影响着浙江畜牧业发展的空抗生素作为饲料添加剂的时代即将成为过去。人们必需寻找对动物与人类有益无害的抗生素替代品，微生态制剂首当其冲是最先被提出的替代品。微生态制剂可以起到降低饲料系数、料肉比(料蛋比等)、提高日增重、缩短养殖周期、增强免疫力、改善养殖环境等功效。浙江是一个畜牧业大省。“七山二水一分田”，土地资源十分稀缺，发展畜牧业资源禀赋不足；加之浙江又是我国市场经济最发达的省份之一，农村居民对环境卫生间。早在2004年，省委省政府就明确提出要转变畜牧业生产方式，优化产业结构，大力推广生态循环的清洁化生产技术，加快发展绿色生态畜牧业的发展，由此拉开了浙江生态畜牧业发展的序幕。

由上述可见，重视优质高效无公害饲用微生态制剂关键技术的研究和产品开发，将是我省畜牧产业可持续发展的最佳路径。

20世纪被用作益生菌的乳酸菌主要有双歧杆菌、乳酸菌和粪链球菌等3种。这些细菌自身非常娇嫩且不耐高温，凝结芽孢杆菌与上述微生物最大不同之处在于，它能耐高温且能生活在强酸或强碱等恶劣环境中。科学研究表明，凝结芽孢杆菌在人或动物的肠道中生长良好，而且能将食物中的糖类物质充分转化为D-型或D，L-型乳酸，而这些乳酸能有效杀死或抑制肠道中的有害微生物。凝结芽孢杆菌在口服后能顺利通过胃酸和消化酶的双重关口并进入肠道“定居”。它们在那里能快速复苏，重新成为活菌，从而开始发挥其肠道保健作用。

凝结芽孢杆菌备受人们关注的另一新用途是作为一种可代替抗生素的“动物生长促进剂”用作饲料添加剂。有报道称，将少量凝结芽胞杆菌添加于鸡饲料中或观赏动物饲料中，可以提高鸡或观赏动物的抗病能力，防止感染鸡瘟病和其他微生物引起的疾病，提高鸡的成活率。此外，美国等国家所做的实验证实，经常食用含凝结芽孢杆菌类添加剂的鸡，其鸡肉或鸡蛋中沙门氏菌等有害微生物的菌落个数大大下降，从而提高了禽蛋食品的食用安全级别。牛和猪等大牲畜经常喂食以含有凝结芽孢杆菌的饲料，不仅能提高纤维素类饲料的利用转化率，而且同样能防止大牲畜患病，并缩短存栏时间。因此，凝结芽胞杆菌也可代替从前广泛使用的盐酸四环素、莫能星和阿维菌素等抗生素类“动物生长促进剂”，从而让困扰饲养业多年的畜(禽)肉中抗生素残留量超标的问题迎刃而解。

目前国内外凝结芽孢杆菌生产都采用液体发酵工艺，固体发酵工艺末见报道。据国内外现有文献报道，凝结芽孢杆菌通过液体发酵，活菌数可达10⁹～10¹⁰CFU/mL,但芽孢形成率不高。如RamkrishnaSen等通过优化凝结芽孢杆菌的发酵条件，活菌数量达3.9×10⁹CFU/mL,崔东良等通过优化凝结芽孢杆菌的发酵培养基，活菌数量达到9.3×10⁹CFU/mL，但均未提及对芽孢数量的提高。

国内外学者对凝结芽孢杆菌液体发酵高密度培养进行深入研究后认为这主要是由于凝结芽抱杆菌经同型发酵生成的乳酸在发酵液中积累将造成pH值下降及对菌体生长产生强烈的抑制作用。针对这种现象的解决途径：一是应用过滤培养技术有可能将发酵液中的乳酸含量保持在较低的范围内，为菌体生长创造有利的条件，使菌体达到很高的密度。刘馨磊、戚薇等分别用补料分批法和中空纤维膜过滤法高密度培养凝结芽孢杆菌，芽孢率为26.7%和75%，最终芽孢浓度为1.2×10⁹CFU/mL和1.2×10¹⁰CFU/mL，上述方法使凝结芽孢杆菌芽孢浓度得以有效提高，但发酵培养基的主要原料是葡萄糖、蛋白胨等精细原料，发酵生产成本较高，且发酵装置、发酵工艺较复杂。

获得凝结芽孢杆菌高密度、高产孢率培养的第二条有效途径就是采用固体发酵进行生产。本公司采用自筛的一株凝结芽孢杆菌通过固体发酵培养48小时，活菌数达1×10¹⁰CFU/g，芽孢数可达5×10⁹CFU/g，芽孢率偏低仅为50%左右，有待进一步提高。经过进一步试验，我们发现碳源充足利于菌体生长，碳源缺乏能促使芽孢形成。在凝结芽孢杆菌生长初期采用高糖配方促进菌体生长，而在对数生长末期添加酒精干酵母进行生物降糖促进芽孢形成，也许是获得优质凝结芽孢杆菌产品的有效途径。

凝结芽孢杆菌低成本发酵工艺是其大规模地用于饲养业以此代替抗生素的前提和关键。目前凝结芽孢杆菌的研究主要集中在传统固体发酵工艺及液体发酵工艺。传统固体发酵工艺易于污染，对于大规模生产具有相当大的制约性，液体发酵法制备凝结芽孢杆菌的方法工艺简单，成本低，但活菌数下降较快，芽孢形成率差，储存期短，体积大，携带运输不方便，容易污染，后处理复杂。

发明内容

本发明提出一种凝结芽孢杆菌的芽孢制剂的制备方法，解决了现有技术中能耗高、环境污染大、成本高的问题。

本发明进一步提出了一种凝结芽孢杆菌的芽孢制剂的制备方法，解决了现有技术中产品浓度低、芽孢率低、产酸不足和杂菌污染的问题。

本发明再一步提出了一种凝结芽孢杆菌的芽孢制剂的制备方法，解决了现有技术中液体斜面接种操作复杂、周期长、易污染的问题。

本发明的技术方案是这样实现的：

一种凝结芽孢杆菌的芽孢制剂的制备方法，包括：

(a)斜面菌体活化

将凝结芽孢杆菌（ACCC10229）接种至一级斜面培养基上，30℃～45℃培养20～32h；

（b）凝结芽孢杆菌的种子罐培养

将步骤（a）中的活化后的结芽孢杆菌单菌落接种于二级培养液中，装液量为50～100mL/500mL，30℃～45℃、160～300rpm/min条件下培养20～32h；然后将培养后的种子液体积百分比0.5～10%，在培养基上30℃～45℃、160～300rpm/min条件下培养20～36h；

（c）凝结芽孢杆菌的固体发酵

将步骤（b）中的培养基按1%～10%的重量比接入固体发酵培养基中，培养基含水量控制在49%～58%，pH范围在6.0～7.0，曲房相对湿度保持在85%以上，料温控制在30℃～45℃，采用半封闭式发酵48～72h；

或者（b’）将步骤（a）中的活化后的结芽孢杆菌单菌落接种于二级茄型培养瓶中，30℃～45℃培养36～48h；

（c’）按10～15瓶二级茄型培养瓶培养基接入1.0t固体发酵培养基中，培养基含水量控制在49%～58%，pH范围在6.0～7.0，曲房相对湿度保持在85%以上，料温控制在30℃～45℃，采用半封闭式发酵48～72h。

作为优选的技术方案，所述步骤（a）中的一级斜面培养基为按下述比例配制的混合液（g/L）：酵母膏5～15g/L，蛋白胨5～15g/L，葡萄糖0.5～5g/L，氯化钠5～10g/L，磷酸氢二钾1～5g/L，硫酸锰0.1～2g/L，pH7.0～7.2。

作为另一种优选的技术方案，所述步骤（a）中的一级斜面培养基为按下述比例配制的混合液（g/L）：酵母膏5～15g/L蛋白胨5～15g/L葡萄糖0.5～5g/L氯化钠5～10g/L磷酸氢二钾1～5g/L硫酸锰0.1～2g/L，琼脂15～20g/L，pH7.0～7.2。

作为优选的技术方案，所述步骤（b）中的二级液体培养基为按下述比例配制的混合液（g/L）：葡萄糖5～20g/L氯化钠1～5g/L酵母膏3～12g/L胰蛋白胨10～25g/L牛肉膏5～10g/L磷酸二氢钾1～5g/L硫酸镁1～5g/L硫酸锰0.1～2g/L碳酸钙1～5g/LpH6.6～7.0。

作为优选的技术方案，所述步骤（c）或（c’）中的固体发酵培养基为按下述比例配制：麸皮30%～40%，玉米粉1%～5%，豆粕粉30%～40%，葡萄糖0.1%～2%，氯化钠2%～5%，磷酸氢二钾0.2%～1%，硫酸锰0.1%～0.5%，碳酸钙0.5%～2%，氯化铵0.5%～1%，pH7.0～7.2。

作为另一种优选的技术方案，所述步骤（c）或（c’）中的固体发酵培养基为按下述比例配制：麸皮55%～70%，豆粕20%～40%，玉米粉1%～5%，蔗糖0.1%～1%，乳糖0.5%～1.5%，葡萄糖0.1%～1%，酵母膏0.1%～1%，pH7.0～7.2。

作为再一种优选的技术方案，所述步骤（c）或（c’）中的固体发酵培养基为按下述比例配制：麸皮40%～50%，玉米粉5%～10%，豆粕粉40%～50%，葡萄糖0.5%～1%，氯化钠2%～5%，磷酸氢二钾0.5%～2%，硫酸锰0.5%～1%，pH7.0～7.2。

有益效果

（1）本发明采用半封闭式固体发酵工艺，在发酵过程中物料处于半封闭状态，与少量空气接触，生长期可以充分利用残余氧气使凝结芽孢杆菌菌体大量繁殖，生长后期氧气大量减少，刺激芽孢快速形成，同时可以代谢较多的L-乳酸，解决发酵过程中产酸不足的情况，通过夺氧作用抑制杂菌的生长，解决固体发酵污染的情况；

（2）本发明的凝结芽孢杆菌可以在营养贫瘠的培养基中繁殖，采用农副产品，成本较低，操作简便；

（3）本发明固体发酵培养基碳源充足利于菌体生长，碳源缺乏能促使芽孢形成；在凝结芽孢杆菌生长初期采用高糖配方促进菌体生长，而在对数生长末期添加酒精干酵母进行生物降糖促进芽孢形成；与传统的液体发酵工艺相比，芽孢率提高30%～45%；

（4）凝结芽孢杆菌的接种方式主要采用液体接种法，该法操作复杂，周期较长，种子液制备过程中易污染。本发明提供的固体斜面接种法可以大幅缩短种子制备周期，通过冷刺激，凝结芽孢杆菌繁殖初期可以同期均一繁殖，芽孢形成阶段较为集中，更易于获得高芽孢率的产品。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

一种凝结芽孢杆菌的芽孢制剂的制备方法，包括：

1.凝结芽孢杆菌一级试管斜面种子

将原始菌种接种至一级斜面培养基上，30℃～45℃培养20～32h。

所述一级斜面培养基为按下述比例配制的混合液（g/L）：酵母膏5～15g/L蛋白胨5～15g/L葡萄糖0.5～5g/L氯化钠5～10g/L磷酸氢二钾1～5g/L硫酸锰0.1～2g/LpH7.0～7.2。

2.凝结芽孢杆菌二级液体种子

将步骤1中的一级凝结芽孢杆菌单菌落接种于二级培养液中，装液量为50～100mL/500mL，30℃～45℃、160～300rpm/min条件下培养20～32h得到二级凝结芽孢杆菌种子液。

所述的二级液体培养基为按下述比例配制的混合液（g/L）：葡萄糖5～20g/L氯化钠1～5g/L酵母膏3～12g/L胰蛋白胨10～25g/L牛肉膏5～10g/L磷酸二氢钾1～5g/L硫酸镁1～5g/L硫酸锰0.1～2g/L碳酸钙1～5g/LpH6.6～7.0。

3.凝结芽孢杆菌三级扩大培养

将步骤2中得到的二级凝结芽孢杆菌种子液体积百分比0.5%～10%，在培养基上与30℃～45℃、160～300rpm/min条件下培养20～36h，得到凝结芽孢杆菌三级种子液。

所述的培养基同步骤2中的培养基。

4.凝结芽孢杆菌固体发酵培养

培养基按1%～10%的重量比接入固体发酵培养基中，培养基含水量控制在49%～58%，pH范围在6.0～7.0，曲房相对湿度保持在85%以上，料温控制在30℃～45℃，采用半封闭式发酵48～72h，芽孢率达到90%以上，芽孢达到1.5×10¹⁰CFU/g。

固体发酵培养基为按下述比例配制：麸皮55%～70%，豆粕20%～40%，玉米粉1%～5%，蔗糖0.1%～1%，乳糖0.5%～1.5%，葡萄糖0.1%～1%，酵母膏0.1%～1%，pH7.0～7.2。

实施例2

一种凝结芽孢杆菌的芽孢制剂的制备方法，包括：

1.凝结芽孢杆菌一级试管斜面种子

所述一级斜面培养基为按下述比例配制的混合液（g/L）：酵母膏5～15g/L蛋白胨5～15g/L葡萄糖0.5～5g/L氯化钠5～10g/L磷酸氢二钾1～5g/L硫酸锰0.1～2g/LpH7.0～7.2

2.凝结芽孢杆菌二级液体种子

3.凝结芽孢杆菌三级扩大培养

所述的培养基同步骤2中的培养基。

4.凝结芽孢杆菌固体发酵培养

培养基按1%～10%的重量比接入固体发酵培养基中，培养基含水量控制在49%～58%，pH范围在6.0～7.0，曲房相对湿度保持在85%以上，料温控制在30℃～45℃，采用半封闭式发酵48～72h，芽孢率达到90%以上，芽孢达到1.4×10¹⁰CFU/g。

固体发酵培养基为按下述比例配制：：麸皮40%～50%，玉米粉5%～10%，豆粕粉40%～50%，葡萄糖0.5%～1%，氯化钠2%～5%，磷酸氢二钾0.5%～2%，硫酸锰0.5%～1%，pH7.0～7.2。

实施例3

一种凝结芽孢杆菌的芽孢制剂的制备方法，包括：

1.凝结芽孢杆菌一级试管斜面种子

所述一级斜面培养基为按下述比例配制的混合液（g/L）：酵母膏5～15g/L蛋白胨5～15g/L葡萄糖0.5～5g/L氯化钠5～10g/L磷酸氢二钾1～5g/L硫酸锰0.1～2g/L，琼脂15～20g/L，pH7.0～7.2

2.凝结芽孢杆菌二级固体种子

将步骤1中的一级凝结芽孢杆菌单菌落批量接种于二级茄型培养瓶中，30℃～45℃培养36～48h，置于4℃冷藏24h。

所述的二级茄型培养瓶培养基同步骤1中的培养基。

3.凝结芽孢杆菌固体发酵培养

按10～15瓶二级茄型培养瓶培养基接入1.0t固体发酵培养基中，培养基含水量控制在49%～58%，pH范围在6.0～7.0，曲房相对湿度保持在85%以上，料温控制在30℃～45℃，采用半封闭式发酵48～72h，芽孢率达到93%以上，芽孢达到1.6×10¹⁰CFU/g。

实施例4

一种凝结芽孢杆菌的芽孢制剂的制备方法，包括：

1.凝结芽孢杆菌一级试管斜面种子

2.凝结芽孢杆菌二级固体种子

所述的二级茄型培养瓶培养基同步骤1中的培养基。

3.凝结芽孢杆菌固体发酵培养

按10～15瓶二级茄型培养瓶培养基接入1.0t固体发酵培养基中，培养基含水量控制在49%～58%，pH范围在6.0～7.0，曲房相对湿度保持在85%以上，料温控制在30℃～45℃，采用半封闭式发酵48～72h，芽孢率达到95%以上，芽孢达到1.8×10¹⁰CFU/g。

实施例5

一种凝结芽孢杆菌的芽孢制剂的制备方法，包括：

1.凝结芽孢杆菌一级试管斜面种子

2.凝结芽孢杆菌二级固体种子

将步骤1中的一级凝结芽孢杆菌单菌落批量接种于二级茄型培养瓶中，

30℃～45℃培养36～48h，置于4℃冷藏24h。

所述的二级茄型培养瓶培养基同步骤1中的培养基。

3.凝结芽孢杆菌固体发酵培养

按10～15瓶二级茄型培养瓶培养基接入1.0t固体发酵培养基中，培养基含水量控制在49%～58%，pH范围在6.0～7.0，曲房相对湿度保持在85%以上，料温控制在30℃～45℃，采用半封闭式发酵48～72h，芽孢率达到95%以上，芽孢达到2.2×10¹⁰CFU/g。

固体发酵培养基为按下述比例配制：麸皮30%～40%，玉米粉1%～5%，豆粕粉30%～40%，葡萄糖0.1%～2%，氯化钠2%～5%，磷酸氢二钾0.2%～1%，硫酸锰0.1%～0.5%，碳酸钙0.5%～2%，氯化铵0.5%～1%，pH7.0～7.2。

对比例1

深层液体发酵法生产的芽孢杆菌发酵结束活菌数达1.2×10⁹CFU/ml，浓缩后活菌数可达1.5×10¹⁰CFU/ml。

采用液体发酵配方：所述的二级液体培养基为按下述比例配制的混合液(g/L)：大豆蛋白胨6.0～16.0，酵母膏5.0～15.0，葡萄糖3.0～13.0，MgSO₄.7H2O0.5～1.5，K₂HPO₄1.0～5.0硫酸锰0.35，CaCO₃5.0～15.0，pH为7.0。

该专利(CN200710122111.X)采用的是液体发酵，经过后期的浓缩工艺，可以将菌体浓度提高，但是液体发酵控制要求严格，风险大，成本高，后处理麻烦，载体添加繁琐，产芽孢率低等问题。

对比例2

专利（CN200810235512.0）要求凝结芽孢杆菌采用种子罐液体发酵培养，其采用的配方以g/L计：麸皮10～25，酵母膏5～10，豆粕粉5～10，K₂HPO₄3.0，氯化钠5.0，硫酸锰0.3，K₂HPO₄1.0～5.0，pH7.0。

工艺要求采用液体种子逐级扩大培养，以三代液体种子罐为生产操作。采用有氧发酵。

发酵结束芽孢率85%，芽孢数为1.2×10⁹CFU/ml。

对比例3

工艺采用液体接种固体发酵方法。液体种子经过二级扩大培养，液体种子接种采用斜面接种。生产采用浅盘发酵法。

固体发酵配方（%）：麸皮49%，玉米粉1%，豆粕粉49%，葡萄糖1%，氯化钠5.6g/L,磷酸氢二钾3.3g/L，MnSO₄0.21g/L，料水比1：1.2，pH7.0～7.2。

生产发酵活力检测：芽孢2×10⁸CFU/g，活菌数1×10⁹CFU/g。芽孢率20%。工艺采用有氧发酵，对于提高活菌数来说有很大的优点，但是对于产芽孢来说并不是很理想，芽孢率仅仅只有20%。而且有氧发酵存在比较严重的污染问题，所以在工艺改进方面可以考虑与厌氧发酵结合。

对比例4

工艺采用液体接种，厌氧发酵，发酵方式为固体装袋密闭法。

液体配方：酵母膏10g/L,蛋白胨10g/L,葡萄糖20g/L，氯化钠5.6g/L,K₂HPO₄3.3g/L，硫酸镁0.5g/L，pH7.0～7.2。

固体发酵配方（%）：麸皮49%，玉米粉0.5%，豆粕粉49%，葡萄糖1.5%，氯化钠6g/L,磷酸氢二钾5g/L，MnSO₄0.42g/L，碳酸钙25g/L，氯化铵15g/L，料水比1：1.2，pH7.0～7.2。

发酵结束活菌数可达1.5×10⁹CFU/g，芽孢数可达5×10⁸CFU/g。

对比例5

工艺采用固体发酵，方式为浅盘发酵法，接种方式为茄子瓶斜面接种，接种量10瓶/吨。发酵采用有氧发酵，发酵周期以芽孢率最高为止。

茄子瓶固体配方：葡萄糖16g/L，氯化钠5g/L，酵母粉6g/L，胰蛋白胨18g/L，牛肉膏6g/L，磷酸氢二钾2g/L，硫酸镁1g/L，硫酸锰0.25g/L，碳酸钙3g/L，琼脂2%，pH6.8～7.0。

固体发酵配方：麸皮50%，豆粕25%，玉米粉20%，葡萄糖2%，磷酸氢二钾0.2%，硫酸镁0.02%，硫酸锰0.005%，氯化钠0.5%。pH7.0～7.2。发酵所得最大活菌数：2.5×10⁹CFU/g，最大芽孢数为：1.5×10⁹CFU/g。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种凝结芽孢杆菌的芽孢制剂的制备方法，包括：

(a)斜面菌体活化

（b）凝结芽孢杆菌的种子罐培养

（c）凝结芽孢杆菌的固体发酵

2.根据权利要求1所述的一种凝结芽孢杆菌的芽孢制剂的制备方法，其特征在于，所述步骤（a）中的一级斜面培养基为按下述比例配制的混合液（g/L）：酵母膏5～15g/L，蛋白胨5～15g/L，葡萄糖0.5～5g/L，氯化钠5～10g/L，磷酸氢二钾1～5g/L，硫酸锰0.1～2g/L，pH7.0～7.2。

3.根据权利要求1所述的一种凝结芽孢杆菌的芽孢制剂的制备方法，其特征在于，所述步骤（a）中的一级斜面培养基为按下述比例配制的混合液（g/L）：酵母膏5～15g/L蛋白胨5～15g/L葡萄糖0.5～5g/L氯化钠5～10g/L磷酸氢二钾1～5g/L硫酸锰0.1～2g/L，琼脂15～20g/L，pH7.0～7.2。

4.根据权利要求2所述的一种凝结芽孢杆菌的芽孢制剂的制备方法，其特征在于，所述步骤（b）中的二级液体培养基为按下述比例配制的混合液（g/L）：葡萄糖5～20g/L氯化钠1～5g/L酵母膏3～12g/L胰蛋白胨10～25g/L牛肉膏5～10g/L磷酸二氢钾1～5g/L硫酸镁1～5g/L硫酸锰0.1～2g/L碳酸钙1～5g/LpH6.6～7.0。

5.根据权利要求1-4任一权利要求所述的一种凝结芽孢杆菌的芽孢制剂的制备方法，其特征在于，所述步骤（c）或（c’）中的固体发酵培养基为按下述比例配制：麸皮30%～40%，玉米粉1%～5%，豆粕粉30%～40%，葡萄糖0.1%～2%，氯化钠2%～5%，磷酸氢二钾0.2%～1%，硫酸锰0.1%～0.5%，碳酸钙0.5%～2%，氯化铵0.5%～1%，pH7.0～7.2。

6.根据权利要求1-4任一权利要求所述的一种凝结芽孢杆菌的芽孢制剂的制备方法，其特征在于，所述步骤（c）或（c’）中的固体发酵培养基为按下述比例配制：麸皮55%～70%，豆粕20%～40%，玉米粉1%～5%，蔗糖0.1%～1%，乳糖0.5%～1.5%，葡萄糖0.1%～1%，酵母膏0.1%～1%，pH7.0～7.2。

7.根据权利要求1-4任一权利要求所述的一种凝结芽孢杆菌的芽孢制剂的制备方法，其特征在于，所述步骤（c）或（c’）中的固体发酵培养基为按下述比例配制：麸皮40%～50%，玉米粉5%～10%，豆粕粉40%～50%，葡萄糖0.5%～1%，氯化钠2%～5%，磷酸氢二钾0.5%～2%，硫酸锰0.5%～1%，pH7.0～7.2。