CN109609432A - 一种凝结芽孢杆菌的产孢方法 - Google Patents

一种凝结芽孢杆菌的产孢方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种凝结芽孢杆菌的产孢方法，包括如下步骤：菌种的活化、种子液的制备及发酵及发酵过程控制。本发明主要以残糖为指导参数，在不同阶段通过调整底物浓度大幅度提高营养细胞产量，发酵后期通过添加促孢因子，调整发酵过程参数，提高成孢率，营养细胞可达5.01×1010cfu/m或以上，产孢率90％以上。此方法简单方便，有利于工业化生产，为益生菌工业化，规模化，提供了一定借鉴。

Description

一种凝结芽孢杆菌的产孢方法
技术领域
本发明属于发酵工程技术领域，具体涉及一种通过补糖工艺及促孢因子的添加，最终实现凝结芽孢杆菌营养细胞的高密度发酵并提高产孢率的凝结芽孢杆菌的产孢方法。
背景技术
凝结芽孢杆菌是一种兼备芽孢菌产生孢子，及乳酸菌产酸能力的特殊功能性益生菌，在自然界中分布广泛。该菌株能够产生乳酸，属于同型乳酸发酵；同时该菌株属于芽孢杆菌属，能产生具有强耐受性的休眠孢子体。因此，凝结芽孢杆菌既具有芽孢杆菌的特点，同时还具有乳酸菌的优势。凝结芽孢杆菌既可以产生大量的代谢产物，如凝固素，L-乳酸等，增加动物体对矿物质及营养元素的降解吸收，调节肠道菌群结构，增加肠道益生菌数量，提高动物体免疫力，还能够通过产生蛋白酶，淀粉酶，纤维素酶等胞外代谢产物，改善饲料营养成分，提高饲料转化率。同时，由于其对胃酸，胆盐的抗性，使得其能够通过动物体胃消化过程，到达结肠，盲肠，并定植，在肠道内通过代谢，产生抑菌物质，抑制有害微生物的生长繁殖，基于上述优势，凝结芽孢杆菌在饲料添加剂中的使用越来越受到学者的关注。
在生物技术转化过程中，低成本化，规模化，工业化，是面临的主要问题，如何利用低成本的原料生产出大批量的菌体或者代谢产物，成为研究的热点。本发明针对凝结芽孢杆菌大规模工业化过程中遇到的问题，通过对发酵培养基成分及发酵过程工艺控制的摸索，实现了凝结芽孢杆菌营养细胞与孢子的高密度发酵，为凝结芽孢杆菌工业化生产提供了借鉴。
发明内容
有鉴于此，本发明的主要目的在于，提供一种凝结芽孢杆菌的产孢方法。
为了达成上述的目的，本发明采用了如下技术方案：
一种凝结芽孢杆菌的产孢方法，包括如下步骤：
1)将凝结芽孢杆菌菌吸取到固体营养琼脂培养基，划线，35℃-45℃条件下培养24-36h，挑取平板单菌落于斜面培养基，35-45℃培养12-24h后获得斜面培养物；
2)使用1-3ml无菌生理盐水冲洗斜面培养物菌苔，以0.1-0.7％(v/v)的接种量接种于种子培养基，35-45℃，转速160-320rpm/min，培养16-30h后获得种子培养液；
3)将培养好的种子培养液以3.0-7.0％(v/v)的接种量接种于装有35L发酵培养基的50L发酵罐中，进行发酵，之后添加促孢因子，收获营养细胞及孢子。
进一步地，其中步骤1)中，所述凝结芽孢杆菌是从-70℃保藏的甘油管中吸取的凝结芽孢杆菌菌悬液。
进一步地，其中步骤2)中，所述种子培养基的各成分为:葡萄糖10-40g/L，蛋白胨5.0-15g/L，酵母粉1.0-5.0g/L，NH4Cl 0.5-1.5g/L，MgSO4 0.1-0.3g/L，CaCO3 0.5-2.0g/L，pH7.0-8.0。
进一步地，其中步骤3)中，所述发酵的初始pH值为7.5-8.5，转速为150-250rpm/min。
进一步地，其中步骤3)中，当所述发酵培养基中残糖下降至0.1-0.5g/L以下时，补加葡萄糖至终浓度8-12g/L。
进一步地，其中步骤3)中，促孢因子的添加时间为发酵14-20h后，添加所述促孢因子后，发酵温度调至35-45℃，转速调整至250-300rpm/min，发酵24-36h后收获营养细胞及孢子。
进一步地，其中步骤3)中，所述发酵培养基各成分为：葡萄糖5-20g/L，大豆蛋白胨10-20g/L，酵母膏5-15/L，硫酸镁2.0-5.0g/L，pH7.5-8.5。
进一步地，其中步骤3)中，所述促孢因子的成分为：1.5-2.5g/L碳酸钙+0.05-0.2mg/L异亮氨酸。
进一步地，其中步骤3)具体包括：将培养好的种子培养液以3.0-7.0％(v/v)的接种量接种于装有35L发酵培养基的50L发酵罐中，发酵初始pH7.5-8.5，转速150-250rpm/min，溶氧控制在30-50％，温度40-50℃，发酵6-12h，当所述发酵培养基中残糖下降至0.1-0.5g/L或以下时，补加葡萄糖至终浓度8-12g/L，发酵14-20h之后，残糖低于0.3-0.7g/L或以下时，添加促孢因子，发酵温度调至35-45℃，转速调整至200-300rpm/min，发酵24-36h后收获营养细胞及孢子。
上述的凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)HEW-B379具有以下微生物学特征：厚壁菌门，杆菌纲，芽孢杆菌目，芽孢杆菌科，芽孢杆菌属的凝结芽孢杆菌，该菌革兰氏染色呈阳性，在MRS，LB培养基能够良好生长，有良好的产乳酸性能，又能产生芽孢；
上述的凝结芽孢杆菌HEW-B379，已于2016年5月27日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.12553，分类命名为凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)。
本发明的凝结芽孢杆菌的产孢方法具有以下优点：本发明通过对控制培养基初始碳源浓度，降低培养过程底物浓度，消除底物抑制，发酵过程中，通过补加碳源，实现菌种的二次生长，提高了生产效率，发酵后期通过加入促孢因子，改变发酵过程控制参数，提高产孢率，相较于普通MRS培养基培养，营养细胞活菌数4.0-6.0×1010cfu/ml，提高了20倍及以上，实现了凝结芽孢杆菌高密度发酵并提高产孢率，相较于传统发酵方法，缩短生产周期，从而提高生产效率。
附图说明
图1为本发明实施例1所述凝结芽孢杆菌的发酵曲线。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明为达成预定发明目的所采取的技术手段及功效，以下结合较佳实施例进行说明。
以下各种材料或试剂，若非特别说明，均为市售。
一种凝结芽孢杆菌的产孢方法，包括如下步骤：
一、菌种的活化
从-70℃保藏的甘油管中吸取凝结芽孢杆菌菌悬液于固体营养琼脂培养基，划线，35℃-45℃条件下培养24-36h，挑取平板单菌落于斜面培养基，35-45℃培养12-24h后获得斜面培养物；
二、种子液的制备
使用1-3ml无菌生理盐水冲洗斜面培养物菌苔，以0.1-0.7％的接种量(v/v)接种于种子培养基，35-45℃，转速160-320rpm/min，培养16-30h后获得种子培养液；所述种子培养基的各成分为:葡萄糖10-40g/L，蛋白胨5.0-15g/L，酵母粉1.0-5.0g/L，NH4Cl 0.5-1.5g/L，MgSO4 0.1-0.3g/L，CaCO30.5-2.0g/L，pH7.0-8.0。
三、发酵及发酵过程控制
将培养好的种子培养液以3.0-7.0％(v/v)的接种量接种于装有35L发酵培养基的50L发酵罐中，发酵初始pH7.5-8.5，转速150-250rpm/min，溶氧控制在30-50％，温度40-50℃，发酵6-12h，当所述发酵培养基中残糖下降至0.1-0.5g/L或以下时，补加葡萄糖至终浓度8-12g/L，发酵14-20h之后，残糖低于0.3-0.7g/L或以下时，添加促孢因子后，发酵温度调至35-45℃，转速调整至200-300rpm/min，发酵24-36h后收获营养细胞及孢子。所述发酵培养基的各成分为：葡萄糖5-20g/L，大豆蛋白胨10-20g/L，酵母膏5.0-15/L，硫酸镁2.0-5.0g/L，pH7.5-8.5。所述促孢因子的成分为：1.5-2.5g/L碳酸钙+0.05-0.2mg/L异亮氨酸。
实施例1
从-70℃甘油管中吸取凝结芽孢杆菌菌悬液于固体营养琼脂培养基，划线，37℃条件下培养36h，挑取平板单菌落于斜面培养基，从37℃培养16h的斜面培养基中，使用2ml无菌生理盐水冲洗菌苔，然后以0.5％(v/v)的接种量接种于种子培养基，种子培养基成分为:葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5.0g/L，NH4Cl 1.0g/L，MgSO4 0.2g/L，CaCO31.0g/L，pH7.5，40℃，转速200rpm/min，培养24h后获得种子培养液。然后按照体积比5％接种于装有35L发酵培养基的50L发酵罐中，发酵培养基成分为：葡萄糖20g/L，大豆蛋白胨15g/L，酵母膏10g/L，硫酸镁3.0g/L，pH8.0，转速230rpm/min，溶氧保持在40％，温度50℃，发酵8h后检测残糖与pH，残糖量低于0.5g/L时，补加葡萄糖至发酵罐中总糖终浓度12g/L，继续发酵至残糖低于0.1g/L，此时添加2g/L碳酸钙+0.05mg/L异亮氨酸至发酵培养基，同时发酵温度调整至40℃，转速调整至280rpm/min，30h后发酵结束，检测活菌与芽孢分别达到5.61×1010cfu/ml，5.35×1010cfu/ml，产孢率95.4％。发酵曲线如图1所示，发酵2h后达到对数期，培养基中糖量减少，pH降低，OD增加较快，菌体繁殖迅速，8h后达到稳定期，培养基中糖消耗完全，菌体量达到最大，此时，在培养基中补加葡萄糖，经过短暂的延迟期后，菌体进行二次生长，至糖消耗完全，达到最大菌量。
实施例2
从-70℃保藏的甘油管中吸取凝结芽孢杆菌菌悬液于固体营养琼脂培养基，划线，37℃条件下培养36h，挑取平板单菌落于斜面培养基，从37℃培养36h的斜面培养基中，使用2ml无菌生理盐水冲洗菌苔，然后以0.3％(v/v)的接种量接种于种子培养基，种子培养基成分为:葡萄糖20g/L，蛋白胨5.0g/L，酵母粉5.0g/L，NH4Cl 1.0g/L，MgSO40.2g/L，CaCO31.0g/L，pH7.5，40℃，转速200rpm/min，培养24h后获得种子培养液。然后按照体积比5％接种于装有35L发酵培养基的50L发酵罐中，发酵培养基成分为：葡萄糖20g/L，大豆蛋白胨10g/L，酵母膏5.0g/L，硫酸镁3.0g/L，pH8.0，转速250rpm/min，溶氧保持在45％，温度45℃，发酵8h后检测残糖与pH，残糖量低于0.5g/L时，补加葡萄糖至发酵罐中总糖终浓度8g/L，继续发酵至残糖低于0.1g/L，此时添加2g/L碳酸钙+0.05mg/L异亮氨酸至发酵培养基，同时发酵温度调整至40℃，转速调整至280rpm/min，30h后发酵结束，检测活菌与芽孢分别达到5.53×1010cfu/ml，5.04×1010cfu/ml，产孢率91.1％。
实施例3
从-70℃保藏的甘油管中吸取凝结芽孢杆菌菌悬液于固体营养琼脂培养基，划线，45℃条件下培养36h，挑取平板单菌落于斜面培养基，从45℃培养36h的斜面培养基中，使用3ml无菌生理盐水冲洗菌苔，然后以0.5％(v/v)的接种于种子培养基，种子培养基成分为葡萄糖30g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉4.0g/L，NH4Cl 1.5g/L，MgSO40.3g/L，CaCO32.0g/L，pH8.0，45℃，转速150rpm/min，培养30h后获得种子培养液。然后按照体积比7.0％接种于装有35L发酵培养基的50L发酵罐中，发酵培养基成分为：葡萄糖10g/L，大豆蛋白胨20g/L，酵母膏5.0g/L，硫酸镁2.0g/L，pH7.5，转速200rpm/min，溶氧保持在50％，温度40℃，发酵6h后检测残糖与pH，残糖量低于0.3g/L时，补加葡萄糖至发酵罐中总糖终浓度12g/L，继续发酵至14h没有残糖，此时添加1.5g/L碳酸钙+0.1mg/L异亮氨酸至发酵培养基，同时发酵温度调整至40℃，转速调整至300rpm/min，26h后发酵结束，检测活菌与芽孢分别达到5.71×1010cfu/ml，5.26×1010cfu/ml，产孢率92.1％。
实施例4
从-70℃保藏的甘油管中吸取凝结芽孢杆菌菌悬液于固体营养琼脂培养基，划线，37℃条件下培养24h，挑取平板单菌落于斜面培养基，从37℃培养48h的斜面培养基中，使用3ml无菌生理盐水冲洗菌苔，然后以0.7％(v/v)的接种量接种于种子培养基，种子培养基成分为:葡萄糖40g/L，蛋白胨15g/L，酵母粉5.0g/L，NH4Cl 0.5g/L，MgSO40.1g/L，CaCO30.5g/L，pH8.0，45℃，转速160rpm/min，培养16h后获得种子培养液。然后按照体积比5％接种于装有35L发酵培养基的50L发酵罐中，发酵培养基成分为：葡萄糖20g/L，大豆蛋白胨10g/L，酵母膏5.0g/L，硫酸镁3.0g/L，pH8.0，转速250rpm/min，溶氧保持在50％，温度40℃，发酵10h后检测残糖与pH，残糖量低于0.3g/L时，补加葡萄糖至发酵罐中总糖终浓度9g/L，继续发酵至16h没有残糖时，发酵温度调整至45℃，转速调整至250rpm/min，30h后发酵结束，检测活菌与芽孢分别达到5.12×1010cfu/ml，4.61×1010cfu/ml，产孢率90.0％。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (9)

1.一种凝结芽孢杆菌的产孢方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)将试管保存的凝结芽孢杆菌菌悬液吸取到固体营养琼脂培养基，划线，35℃-45℃条件下培养24-36h，培养完成后，挑取平板单菌落于固体斜面培养基，35-45℃培养12-24h后获得斜面培养物；
2)使用1-3ml无菌生理盐水冲洗斜面培养物菌苔，以0.1-0.7％(v/v)的接种量接种于种子培养基，35-45℃，转速160-320rpm/min，培养16-30h后获得种子培养液；
3)将培养好的种子培养液以3.0-7.0％(v/v)的接种量接种于装有35L发酵培养基的50L发酵罐中，进行发酵，之后添加促孢因子，收获营养细胞及孢子。
2.如权利要求1所述的凝结芽孢杆菌的产孢方法，其特征在于，步骤1)中，所述凝结芽孢杆菌是从-70℃保藏的甘油管中吸取的凝结芽孢杆菌菌悬液。
3.如权利要求1所述的凝结芽孢杆菌的产孢方法，其特征在于，步骤2)中，所述种子培养基的各成分为:葡萄糖5-20g/L，蛋白胨5.0-15g/L，酵母粉1.0-5.0g/L，NH4Cl 0.5-1.5g/L，MgSO4 0.1-0.3g/L，CaCO30.5-2.0g/L，pH7.0-8.0。
4.如权利要求1所述的凝结芽孢杆菌的产孢方法，其特征在于，步骤3)中，所述发酵的初始pH值为7.5-8.5，转速为150-250rpm/min。
5.如权利要求4所述的凝结芽孢杆菌的产孢方法，其特征在于，步骤3)中，当所述发酵培养基中残糖下降至0.1-0.5g/L或以下时，补加葡萄糖至终浓度8-12g/L。
6.如权利要求5所述的凝结芽孢杆菌的产孢方法，其特征在于，步骤3)中，促孢因子的添加时间为发酵14-20h后，添加所述促孢因子后，发酵温度调至35-45℃，转速调整至250-300rpm/min，发酵30-40h后收获营养细胞及孢子。
7.如权利要求6所述的凝结芽孢杆菌的产孢方法，其特征在于，步骤3)中，所述发酵培养基各成分为：葡萄糖5-20g/L，大豆蛋白胨10-20g/L，酵母膏5-15/L，硫酸镁2.0-5.0g/L，pH7.5-8.5。
8.如权利要求7所述的凝结芽孢杆菌的产孢方法，其特征在于，步骤3)中，所述促孢因子的成分为：1.5-2.5g/L碳酸钙+0.05-0.2mg/L异亮氨酸。
9.如权利要求1所述的凝结芽孢杆菌的产孢方法，其特征在于，步骤3)具体包括：将培养好的种子培养液以3.0-7.0％(v/v)的接种量接种于装有35L发酵培养基的50L发酵罐中，发酵初始pH7.5-8.5，转速150-250rpm/min，溶氧控制在30-50％，温度40-50℃，发酵6-12h，当所述发酵培养基中残糖下降至0.1-0.5g/L或以下时，补加葡萄糖至终浓度8-12g/L，发酵14-20h之后，残糖低于0.3-0.7g/L或以下时，添加促孢因子，发酵温度调至35-45℃，转速调整至200-300rpm/min，发酵24-36h后收获营养细胞及孢子。
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