CN102220269B - 一种丁酸梭菌及丁酸梭菌饲料添加剂的生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种丁酸梭菌及丁酸梭菌饲料添加剂的生产方法，名称为TK2，分类名称Clostridium butyricum，保藏编号为：CGMCC No.4729，保藏日期：2011年4月2日，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，提供了一种生产方法为固态发酵培养法。本发明中丁酸梭菌TK2菌株经过液体种子培养将冻藏菌种活化，再经优化后的固态发酵培养基培养，并对其活菌浓度及芽孢浓度测定，用本方法生产的丁酸梭菌活菌数为4.35×109cfu/g，芽孢转化率85％，基于本菌种开发了新型的低成本的丁酸梭菌活菌制剂生产方法。
Description
技术领域
本发明属于微生物发酵领域，涉及一种丁酸梭菌及丁酸梭菌饲料添加剂的生产方法。
背景技术
丁酸梭菌是一类具有内生芽孢结构的厌氧杆菌，是对宿主有益的正常微生物，经特殊工艺而制成的制剂，通过动物消化道中生物的竞争性排斥作用，可抑制有害菌生长，形成优势菌群或通过增强非特异性免疫功能来预防疾病，可达到调整体内微生态平衡的目的，促进动物生长及提高饲料转化率，降低粪便的臭味。在使用抗生素的弊端日益凸显的背景下，丁酸梭菌活菌制剂所具备的诸多优势使其在预防治疗肠道疾病中具有重要意义。
目前所报道的丁酸梭菌的培养方法主要是液体深层静置培养，其固态发酵培养方法国内外未见报道，但是液态培养的成本较高，对设备和环境的要求也相对较高。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种成本低、培养基来源广泛、操作简单的丁酸梭菌及丁酸梭菌饲料添加剂的生产方法。
本发明实现目的的技术方案如下：
一种丁酸梭菌，其特征在于：名称为TK2，分类名称Clostridium butyricum，保藏编号为：CGMCC No.4729，保藏日期：2011年4月2日，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
一种丁酸梭菌饲料添加剂的生产方法，生产方法为固态发酵培养法。
而且，所述固态发酵培养基为重量百分比：酶解氮源20-30、米糠5-15、葡萄糖1-2、啤酒酵母粉2-3、CaCO3 0.01-0.1、加水至100％，所述酶解氮源的制备方法为：豆粕加水重量比为1∶2，中性蛋白酶用量1000u每克豆粕，酶解3h，所述酶解氮源为：酶解豆粕、酶解花生粕、酶解黄豆粕、酶解棉籽粕。
而且，所述固态发酵培养基的重量百分比为：酶解豆粕27；米糠9；葡萄糖1.5；啤酒酵母粉2.5；CaCO3 0.02；水60。
而且，所述固态发酵培养条件为：接种量10％，37±1℃静置厌氧培养40-55h。
而且，固态发酵培养前进行液体种子培养，其中液体种子培养基为g/L：葡萄糖5-10；胰蛋白胨5-15；酵母膏26、K2HPO4 3-7、MgSO4·7H2O 0.1-0.5、MnSO4·H2O 0.1-0.5g、溶剂为水，培养条件为pH7.4，培养18小时，培养温度为37℃，厌氧培养。
而且，固态发酵培养的活菌菌体浓度及芽孢率均分别为4.35×109cfu/g和85％。
本发明的优点和积极效果是：
1、本发明中丁酸梭菌TK2菌株经过液体种子培养将冻藏菌种活化，再经优化后的固态发酵培养基培养，并对其活菌浓度及芽孢浓度测定，用本方法生产的丁酸梭菌活菌数为4.35×109cfu/g，芽孢转化率85％，基于本菌种开发了新型的低成本的丁酸梭菌活菌制剂生产方法。
2、本发明首次采用固态发酵法发酵厌氧型丁酸梭菌，与原液态发酵相比，固态发酵能耗小、培养基来源广泛、设备相对简单、产物浓度高，具有投资少、操作简单、物质损耗小、能耗低、发酵管理简单的优势。
3、本发明确定了在最适固态发酵培养基组成和固定其他培养条件下，接种量为10％时活菌数及芽孢率最为理想，分别可达4.35×109cfu/g，85％，无机盐成分对菌体的生长影响不明显；碳酸钙用以中和其产生的酸性成分，有利于菌体生长。
4、本发明首次提供了丁酸梭菌TK2利用廉价的豆粕、花生粕、黄豆粕、棉籽粕作为氮源，用中性蛋白酶处理后，其利用率得到了很大的提高，尤其是经水解3h后的豆粕，效果显著，活菌数高达4.35×109cfu/g，为丁酸梭菌规模化生产极大的降低了成本，中性蛋白酶水解3h的豆粕作为氮源为最优选择。
附图说明
图1为本发明各氮源水解时间对丁酸梭菌活菌数的影响；
图2为本发明含水量对丁酸梭菌活菌数的影响；
图3为本发明接种量对丁酸梭菌活菌数及芽孢浓度的影响；
图4为本发明培养时间对丁酸梭菌芽孢浓度的影响。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
一种丁酸梭菌TK2，分类名称Clostridium butyricum，保藏编号为：CGMCC No.4729，保藏日期：2011年4月2日，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，以下叙述均基于该菌株。
1.丁酸梭菌TK2的筛选
(1)以土壤作为样品；(2)涂布梭菌分离培养基平板，初步得到纯菌株；(3)影印好氧与厌氧培养，除去好氧和兼性厌氧菌，得到严格厌氧菌；(4)镜检，依据《伯杰氏细菌手册》，从菌落形态及个体形态以及严格厌氧型能鉴定到属，对所得到的菌株进行明胶液化试验及芽孢位置染色试验，可以鉴定到群，在群内进行蜜二糖、松三糖、淀粉利用试验，鉴定到种。(5)将分离出的丁酸梭菌于甘油管中-70℃冻藏。
2.菌体的种子制备：
将甘油管冻藏的菌种接到装有液体种子培养基的试管中，37℃静置厌氧培养18h。
其中液体种子培养基(g/L)为：葡萄糖8g；胰蛋白胨10g；酵母膏4g；K2HPO4 5g；MgSO4·7H2O 0.2g；MnSO4·H2O 0.2g；pH 7.4，培养18小时，培养温度为37℃厌氧培养。
3.培养基制备：
豆粕加水比为1∶2，中性蛋白酶用量1000u/g(豆粕)，酶解3h后加入固态发酵培养基与其他成分一并于115℃灭菌30分钟。所用中性蛋白酶ZDB-G-20购自天津诺奥科技发展有限公司。
固态发酵培养基为(重量百分比)：中性蛋白酶水解3h的豆粕27％；米糠9％；葡萄糖1.5％；啤酒酵母粉2.5％；CaCO3 0.02％；水60％，pH自然。
4.固态发酵：
将培养至对数期中期的液体种子以10％的接种量接到固态发酵培养基中，然后在厌氧培养箱中37±1℃静置培养48h。
5.菌体浓度的测定
采用高层半固体琼脂试管活菌计数法，其流程为：称取固态发酵鲜曲10g，放入盛有90mL无菌生理盐水(含数粒玻璃珠)的150mL三角瓶中，置摇床180r/min振荡20min，使其分散均匀，用移液管取1mL菌液加进9mL半固体琼脂试管培养基中，振荡搅匀，依次做10倍梯度稀释，稀释管和计数管于同一管，选择合适稀释度做三个平行，厌氧培养箱37℃培养24h。
6.芽孢浓度的测定
取混匀后的菌液5ml于80℃水浴加热10min，杀死营养体细胞，经适当的10倍梯度稀释，其后同活菌计数法。
以下是对发酵培养基的确定，包括无机盐、氮源、发酵培养基含水量等参数的确定，以及发酵培养条件的优化选择
一、固态发酵条件的筛选：
1、丁酸梭菌TK2发酵培养基无机盐的确定
筛选实例1
固态发酵培养基(％)：未水解豆粕27；米糠9；葡萄糖1.5；啤酒酵母粉2.5；CaCO3 0.02；MgSO4 0.02；MnSO4 0.02；K2HpO4 0.06；水60。
接种与培养条件：接种量10％(v/w)，pH自然，培养温度37±1℃，培养时间48h。
测得的活菌数为4.5×108cfu/g。
筛选实例2
固态发酵培养基(％)：未水解豆粕27；米糠9；葡萄糖1.5；啤酒酵母粉2.5；CaCO3 0.02；水60。
接种与培养条件：接种量10％(v/w)，pH自然，培养温度37±1℃，培养时间48h。
测得的活菌数为3.45×108cfu/g。
结果
无机盐成分对菌体的生长影响不明显；碳酸钙用以中和其产生的酸性成分，有利于菌体生长。
2、发酵培养基氮源的确定
筛选实例1
固态发酵培养基(％)：中性蛋白酶水解1h的豆粕27；米糠9；葡萄糖1.5；啤酒酵母粉2.5；CaCO3 0.02；水60。
接种与培养条件：接种量10％(v/w)，pH自然，培养温度37±1℃，培养时间48h。
测得的活菌数为1.5×109cfu/g。
筛选实例2
固态发酵培养基(％)：中性蛋白酶水解3h的豆粕27；米糠9；葡萄糖1.5；啤酒酵母粉2.5；CaCO3 0.02；水60。
接种与培养条件：接种量10％(v/w)，pH自然，培养温度37±1℃，培养时间48h。
测得的活菌数为4.35×109cfu/g。
筛选实例3
固态发酵培养基(％)：中性蛋白酶水解1h的花生粕27；米糠9；葡萄糖1.5；啤酒酵母粉2.5；CaCO3 0.02；水60。
接种与培养条件：接种量10％(v/w)，pH自然，培养温度37±1℃，培养时间48h。
测得的活菌数为0.92×108cfu/g。
筛选实例4
固态发酵培养基(％)：中性蛋白酶水解3h的花生粕27；米糠9；葡萄糖1.5；啤酒酵母粉2.5；CaCO3 0.02；水60。
接种与培养条件：接种量10％(v/w)，pH自然，培养温度37±1℃，培养时间48h。
测得的活菌数为3.8×108cfu/g。
筛选实例5
固态发酵培养基(％)：中性蛋白酶水解1h的黄豆粕27；米糠9；葡萄糖1.5；啤酒酵母粉2.5；CaCO3 0.02；水60。
接种与培养条件：接种量10％(v/w)，pH自然，培养温度37±1℃，培养时间48h。
测得的活菌数为0.92×109cfu/g。
筛选实例6
固态发酵培养基(％)：中性蛋白酶水解3h的黄豆粕27；米糠9；葡萄糖1.5；啤酒酵母粉2.5；CaCO3 0.02；水60。
接种与培养条件：接种量10％(v/w)，pH自然，培养温度37±1℃，培养时间48h。
测得的活菌数为2.2×109cfu/g。
筛选实例7
固态发酵培养基(％)：中性蛋白酶水解1h的棉籽粕27；米糠9；葡萄糖1.5；啤酒酵母粉2.5；CaCO3 0.02；水60。
接种与培养条件：接种量10％(v/w)，pH自然，培养温度37±1℃，培养时间48h。
测得的活菌数为1.16×109cfu/g。
筛选实例8
固态发酵培养基(％)：中性蛋白酶水解3h的棉籽粕27；米糠9；葡萄糖1.5；啤酒酵母粉2.5；CaCO3 0.02；水60。
接种与培养条件：接种量10％(v/w)，pH自然，培养温度37±1℃，培养时间48h。
测得的活菌数为2.25×109cfu/g。
结果
丁酸梭菌TK2利用廉价的豆粕、花生粕、黄豆粕、棉籽粕作为氮源，用中性蛋白酶处理后，其利用率得到了很大的提高，尤其是经水解3h后的豆粕(附图1)，效果显著，活菌数高达4.35×109cfu/g，为丁酸梭菌规模化生产极大的降低了成本。因此选择中性蛋白酶水解3h的豆粕作为氮源。
3、发酵培养基含水量的确定
筛选实例1
固态发酵培养基(％)：中性蛋白酶水解3h的豆粕27；米糠9；葡萄糖1.5；啤酒酵母粉2.5；CaCO3 0.02；水40。
接种与培养条件：接种量10％(v/w)，pH自然，培养温度37±1℃，培养时间48h。
测得的活菌数为3.4×108cfu/g。
筛选实例2
固态发酵培养基(％)：中性蛋白酶水解3h的豆粕27；米糠9；葡萄糖1.5；啤酒酵母粉2.5；CaCO3 0.02；水50。
接种与培养条件：接种量10％(v/w)，pH自然，培养温度37±1℃，培养时间48h。
测得的活菌数为1.6×109cfu/g。
结果
含水量为60％时，测得的活菌数最高(附图2)，达4.35×109cfu/g。结论
最终得以优化的固态发酵培养基成分为：中性蛋白酶水解3h的豆粕27；米糠9；葡萄糖1.5；啤酒酵母粉2.5；CaCO3 0.02；水60。
二、丁酸梭菌TK2发酵培养条件
1、接种量的确定
筛选实例1
将菌种培养于已优化的固态发酵培养基中
接种量与培养条件：接种量5％(v/w)，pH自然，培养温度37±1℃，培养时间48h。
测得的活菌数为7.4×108cfu/g；测得的芽孢率为34.6％。
筛选实例2
将菌种培养于已优化的固态发酵培养基中
接种量与培养条件：接种量8％(v/w)，pH自然，培养温度37±1℃，培养时间48h。
测得的活菌数为8.25×108cfu/g；测得的芽孢率为61.8％。
结果
在最适固态发酵培养基组成和固定其他培养条件下，接种量为10％时测得的活菌数及芽孢率最为理想(附图3)，分别可达4.35×109cfu/g，85％。
2、培养时间的确定
筛选实例1
将菌种培养于已优化的固态发酵培养基中
接种量与培养条件：接种量10％(v/w)，pH自然，培养温度37±1℃，培养时间36h。
测得的活菌数为3.68×109cfu/g；测得芽孢率为57％。
筛选实例2
将菌种培养于已优化的固态发酵培养基中
接种量与培养条件：接种量10％(v/w)，pH自然，培养温度37±1℃，培养时间60h。
测得的活菌数为4.41×109cfu/g；测得芽孢率为85.3％。
结果
在最适固态发酵培养基组成和固定其他培养条件下，选择培养时间为48h最合适(附图4)，延长培养时间并未使活菌数及芽孢率有明显提高，理想的活菌数及芽孢率分别为4.35×109cfu/g，85％。
结论
最终得以优化的固态发酵培养条件为：接种量10％，pH自然，37±1℃静置厌氧培养48h。
三、丁酸梭菌TK2菌体浓度的测定
筛选实例1
取1mL混匀后菌液加进9mL半固体琼脂试管培养基中，振荡搅匀，做10倍梯度稀释，稀释管和计数管于同一管，厌氧培养箱37℃培养24h。
测得的活菌数为：4.35×109cfu/g。
筛选实例2
取1mL混匀后菌液加进9mL无菌生理盐水中，做10倍梯度稀释，倾注法于培养皿中固体培养基，厌氧箱37℃培养24h。
测得的活菌数为：3.7×109cfu/g。
结果
采用高层半固体琼脂试管法测定丁酸梭菌的活菌数，简便快捷，减少菌体在氧气中暴漏的时间，可更有效的反映活菌浓度。
四、丁酸梭菌TK2芽孢率的测定
筛选实例1
取混匀后的菌液5mL于80℃水浴加热10min，杀死营养体细胞，经适当的10倍梯度稀释，其后同菌体浓度的测定例1。
测得的芽孢率：芽孢率85％。
筛选实例2
取混匀后的菌液5mL于80℃水浴加热10min，杀死营养体细胞，经适当的10倍梯度稀释，其后同菌体浓度的测定例2。
测得的芽孢率：芽孢率83.5％。
结果
采用高层半固体琼脂试管计数法可更有效的反映丁酸梭菌TK2的芽孢浓度。
结论
本实验采用的低成本固态发酵工艺生产丁酸梭菌，其培养基成分及培养条件经优化后，活菌菌体浓度及芽孢率均可达到理想水平，分别为4.35×109cfu/g和85％。
Claims (2)
1.一种丁酸梭菌，其特征在于：名称为TK2，分类名称Clostridium butyricum，保藏编号为：CGMCC No. 4729，保藏日期：2011年4月2日，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
2.一种利用如权利要求1所述的丁酸梭菌生产丁酸梭菌饲料添加剂的生产方法，其特征在于：生产方法为固态发酵培养法；
所述固态发酵培养基为重量百分比：酶解氮源 20-30、米糠5-15、葡萄糖1-2、啤酒酵母粉2-3、CaCO3 0.01-0.1、加水至100%，所述酶解氮源的制备方法为：豆粕加水重量比为1:2，中性蛋白酶用量1000u每克豆粕，酶解3h；
所述固态发酵培养条件为：接种量10%，37±1℃静置厌氧培养40-55h。
3、根据权利要求2所述的丁酸梭菌饲料添加剂的生产方法，其特征在于：所述固态发酵培养基的重量百分比为:酶解豆粕27；米糠9；葡萄糖1.5；啤酒酵母粉2.5；CaCO3 0.02；水60。
4、根据权利要求2所述的丁酸梭菌饲料添加剂的生产方法，其特征在于：固态发酵培养前进行液体种子培养，其中液体种子培养基为g/L：葡萄糖5-10；胰蛋白胨5-15；酵母膏26、K2HPO4 3-7、MgSO4·7H2O 0.1-0.5、MnSO4·H2O 0.1-0.5、溶剂为水，培养条件为pH7.4，培养18小时，培养温度为37℃，厌氧培养。
5、根据权利要求2所述的丁酸梭菌饲料添加剂的生产方法，其特征在于：固态发酵培养的活菌菌体浓度及芽孢率均分别为4.35×109cfu/g 和85%。
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