发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处,提供一种成本低、培养基来源广泛、操作简单的丁酸梭菌及丁酸梭菌饲料添加剂的生产方法。
本发明实现目的的技术方案如下:
一种丁酸梭菌,其特征在于:名称为TK2,分类名称Clostridium butyricum,保藏编号为:CGMCC No.4729,保藏日期:2011年4月2日,保藏地址为:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
一种丁酸梭菌饲料添加剂的生产方法,生产方法为固态发酵培养法。
而且,所述固态发酵培养基为重量百分比:酶解氮源20-30、米糠5-15、葡萄糖1-2、啤酒酵母粉2-3、CaCO3 0.01-0.1、加水至100%,所述酶解氮源的制备方法为:豆粕加水重量比为1∶2,中性蛋白酶用量1000u每克豆粕,酶解3h,所述酶解氮源为:酶解豆粕、酶解花生粕、酶解黄豆粕、酶解棉籽粕。
而且,所述固态发酵培养基的重量百分比为:酶解豆粕27;米糠9;葡萄糖1.5;啤酒酵母粉2.5;CaCO3 0.02;水60。
而且,所述固态发酵培养条件为:接种量10%,37±1℃静置厌氧培养40-55h。
而且,固态发酵培养前进行液体种子培养,其中液体种子培养基为g/L:葡萄糖5-10;胰蛋白胨5-15;酵母膏26、K2HPO4 3-7、MgSO4·7H2O 0.1-0.5、MnSO4·H2O 0.1-0.5g、溶剂为水,培养条件为pH7.4,培养18小时,培养温度为37℃,厌氧培养。
而且,固态发酵培养的活菌菌体浓度及芽孢率均分别为4.35×109cfu/g和85%。
本发明的优点和积极效果是:
1、本发明中丁酸梭菌TK2菌株经过液体种子培养将冻藏菌种活化,再经优化后的固态发酵培养基培养,并对其活菌浓度及芽孢浓度测定,用本方法生产的丁酸梭菌活菌数为4.35×109cfu/g,芽孢转化率85%,基于本菌种开发了新型的低成本的丁酸梭菌活菌制剂生产方法。
2、本发明首次采用固态发酵法发酵厌氧型丁酸梭菌,与原液态发酵相比,固态发酵能耗小、培养基来源广泛、设备相对简单、产物浓度高,具有投资少、操作简单、物质损耗小、能耗低、发酵管理简单的优势。
3、本发明确定了在最适固态发酵培养基组成和固定其他培养条件下,接种量为10%时活菌数及芽孢率最为理想,分别可达4.35×109cfu/g,85%,无机盐成分对菌体的生长影响不明显;碳酸钙用以中和其产生的酸性成分,有利于菌体生长。
4、本发明首次提供了丁酸梭菌TK2利用廉价的豆粕、花生粕、黄豆粕、棉籽粕作为氮源,用中性蛋白酶处理后,其利用率得到了很大的提高,尤其是经水解3h后的豆粕,效果显著,活菌数高达4.35×109cfu/g,为丁酸梭菌规模化生产极大的降低了成本,中性蛋白酶水解3h的豆粕作为氮源为最优选择。
具体实施方式
下面结合实施例,对本发明进一步说明,下述实施例是说明性的,不是限定性的,不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
一种丁酸梭菌TK2,分类名称Clostridium butyricum,保藏编号为:CGMCC No.4729,保藏日期:2011年4月2日,保藏地址为:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,以下叙述均基于该菌株。
1.丁酸梭菌TK2的筛选
(1)以土壤作为样品;(2)涂布梭菌分离培养基平板,初步得到纯菌株;(3)影印好氧与厌氧培养,除去好氧和兼性厌氧菌,得到严格厌氧菌;(4)镜检,依据《伯杰氏细菌手册》,从菌落形态及个体形态以及严格厌氧型能鉴定到属,对所得到的菌株进行明胶液化试验及芽孢位置染色试验,可以鉴定到群,在群内进行蜜二糖、松三糖、淀粉利用试验,鉴定到种。(5)将分离出的丁酸梭菌于甘油管中-70℃冻藏。
2.菌体的种子制备:
将甘油管冻藏的菌种接到装有液体种子培养基的试管中,37℃静置厌氧培养18h。
其中液体种子培养基(g/L)为:葡萄糖8g;胰蛋白胨10g;酵母膏4g;K2HPO4 5g;MgSO4·7H2O 0.2g;MnSO4·H2O 0.2g;pH 7.4,培养18小时,培养温度为37℃厌氧培养。
3.培养基制备:
豆粕加水比为1∶2,中性蛋白酶用量1000u/g(豆粕),酶解3h后加入固态发酵培养基与其他成分一并于115℃灭菌30分钟。所用中性蛋白酶ZDB-G-20购自天津诺奥科技发展有限公司。
固态发酵培养基为(重量百分比):中性蛋白酶水解3h的豆粕27%;米糠9%;葡萄糖1.5%;啤酒酵母粉2.5%;CaCO3 0.02%;水60%,pH自然。
4.固态发酵:
将培养至对数期中期的液体种子以10%的接种量接到固态发酵培养基中,然后在厌氧培养箱中37±1℃静置培养48h。
5.菌体浓度的测定
采用高层半固体琼脂试管活菌计数法,其流程为:称取固态发酵鲜曲10g,放入盛有90mL无菌生理盐水(含数粒玻璃珠)的150mL三角瓶中,置摇床180r/min振荡20min,使其分散均匀,用移液管取1mL菌液加进9mL半固体琼脂试管培养基中,振荡搅匀,依次做10倍梯度稀释,稀释管和计数管于同一管,选择合适稀释度做三个平行,厌氧培养箱37℃培养24h。
6.芽孢浓度的测定
取混匀后的菌液5ml于80℃水浴加热10min,杀死营养体细胞,经适当的10倍梯度稀释,其后同活菌计数法。
以下是对发酵培养基的确定,包括无机盐、氮源、发酵培养基含水量等参数的确定,以及发酵培养条件的优化选择
一、固态发酵条件的筛选:
1、丁酸梭菌TK2发酵培养基无机盐的确定
筛选实例1
固态发酵培养基(%):未水解豆粕27;米糠9;葡萄糖1.5;啤酒酵母粉2.5;CaCO3 0.02;MgSO4 0.02;MnSO4 0.02;K2HpO4 0.06;水60。
接种与培养条件:接种量10%(v/w),pH自然,培养温度37±1℃,培养时间48h。
测得的活菌数为4.5×108cfu/g。
筛选实例2
固态发酵培养基(%):未水解豆粕27;米糠9;葡萄糖1.5;啤酒酵母粉2.5;CaCO3 0.02;水60。
接种与培养条件:接种量10%(v/w),pH自然,培养温度37±1℃,培养时间48h。
测得的活菌数为3.45×108cfu/g。
结果
无机盐成分对菌体的生长影响不明显;碳酸钙用以中和其产生的酸性成分,有利于菌体生长。
2、发酵培养基氮源的确定
筛选实例1
固态发酵培养基(%):中性蛋白酶水解1h的豆粕27;米糠9;葡萄糖1.5;啤酒酵母粉2.5;CaCO3 0.02;水60。
接种与培养条件:接种量10%(v/w),pH自然,培养温度37±1℃,培养时间48h。
测得的活菌数为1.5×109cfu/g。
筛选实例2
固态发酵培养基(%):中性蛋白酶水解3h的豆粕27;米糠9;葡萄糖1.5;啤酒酵母粉2.5;CaCO3 0.02;水60。
接种与培养条件:接种量10%(v/w),pH自然,培养温度37±1℃,培养时间48h。
测得的活菌数为4.35×109cfu/g。
筛选实例3
固态发酵培养基(%):中性蛋白酶水解1h的花生粕27;米糠9;葡萄糖1.5;啤酒酵母粉2.5;CaCO3 0.02;水60。
接种与培养条件:接种量10%(v/w),pH自然,培养温度37±1℃,培养时间48h。
测得的活菌数为0.92×108cfu/g。
筛选实例4
固态发酵培养基(%):中性蛋白酶水解3h的花生粕27;米糠9;葡萄糖1.5;啤酒酵母粉2.5;CaCO3 0.02;水60。
接种与培养条件:接种量10%(v/w),pH自然,培养温度37±1℃,培养时间48h。
测得的活菌数为3.8×108cfu/g。
筛选实例5
固态发酵培养基(%):中性蛋白酶水解1h的黄豆粕27;米糠9;葡萄糖1.5;啤酒酵母粉2.5;CaCO3 0.02;水60。
接种与培养条件:接种量10%(v/w),pH自然,培养温度37±1℃,培养时间48h。
测得的活菌数为0.92×109cfu/g。
筛选实例6
固态发酵培养基(%):中性蛋白酶水解3h的黄豆粕27;米糠9;葡萄糖1.5;啤酒酵母粉2.5;CaCO3 0.02;水60。
接种与培养条件:接种量10%(v/w),pH自然,培养温度37±1℃,培养时间48h。
测得的活菌数为2.2×109cfu/g。
筛选实例7
固态发酵培养基(%):中性蛋白酶水解1h的棉籽粕27;米糠9;葡萄糖1.5;啤酒酵母粉2.5;CaCO3 0.02;水60。
接种与培养条件:接种量10%(v/w),pH自然,培养温度37±1℃,培养时间48h。
测得的活菌数为1.16×109cfu/g。
筛选实例8
固态发酵培养基(%):中性蛋白酶水解3h的棉籽粕27;米糠9;葡萄糖1.5;啤酒酵母粉2.5;CaCO3 0.02;水60。
接种与培养条件:接种量10%(v/w),pH自然,培养温度37±1℃,培养时间48h。
测得的活菌数为2.25×109cfu/g。
结果
丁酸梭菌TK2利用廉价的豆粕、花生粕、黄豆粕、棉籽粕作为氮源,用中性蛋白酶处理后,其利用率得到了很大的提高,尤其是经水解3h后的豆粕(附图1),效果显著,活菌数高达4.35×109cfu/g,为丁酸梭菌规模化生产极大的降低了成本。因此选择中性蛋白酶水解3h的豆粕作为氮源。
3、发酵培养基含水量的确定
筛选实例1
固态发酵培养基(%):中性蛋白酶水解3h的豆粕27;米糠9;葡萄糖1.5;啤酒酵母粉2.5;CaCO3 0.02;水40。
接种与培养条件:接种量10%(v/w),pH自然,培养温度37±1℃,培养时间48h。
测得的活菌数为3.4×108cfu/g。
筛选实例2
固态发酵培养基(%):中性蛋白酶水解3h的豆粕27;米糠9;葡萄糖1.5;啤酒酵母粉2.5;CaCO3 0.02;水50。
接种与培养条件:接种量10%(v/w),pH自然,培养温度37±1℃,培养时间48h。
测得的活菌数为1.6×109cfu/g。
结果
含水量为60%时,测得的活菌数最高(附图2),达4.35×109cfu/g。结论
最终得以优化的固态发酵培养基成分为:中性蛋白酶水解3h的豆粕27;米糠9;葡萄糖1.5;啤酒酵母粉2.5;CaCO3 0.02;水60。
二、丁酸梭菌TK2发酵培养条件
1、接种量的确定
筛选实例1
将菌种培养于已优化的固态发酵培养基中
接种量与培养条件:接种量5%(v/w),pH自然,培养温度37±1℃,培养时间48h。
测得的活菌数为7.4×108cfu/g;测得的芽孢率为34.6%。
筛选实例2
将菌种培养于已优化的固态发酵培养基中
接种量与培养条件:接种量8%(v/w),pH自然,培养温度37±1℃,培养时间48h。
测得的活菌数为8.25×108cfu/g;测得的芽孢率为61.8%。
结果
在最适固态发酵培养基组成和固定其他培养条件下,接种量为10%时测得的活菌数及芽孢率最为理想(附图3),分别可达4.35×109cfu/g,85%。
2、培养时间的确定
筛选实例1
将菌种培养于已优化的固态发酵培养基中
接种量与培养条件:接种量10%(v/w),pH自然,培养温度37±1℃,培养时间36h。
测得的活菌数为3.68×109cfu/g;测得芽孢率为57%。
筛选实例2
将菌种培养于已优化的固态发酵培养基中
接种量与培养条件:接种量10%(v/w),pH自然,培养温度37±1℃,培养时间60h。
测得的活菌数为4.41×109cfu/g;测得芽孢率为85.3%。
结果
在最适固态发酵培养基组成和固定其他培养条件下,选择培养时间为48h最合适(附图4),延长培养时间并未使活菌数及芽孢率有明显提高,理想的活菌数及芽孢率分别为4.35×109cfu/g,85%。
结论
最终得以优化的固态发酵培养条件为:接种量10%,pH自然,37±1℃静置厌氧培养48h。
三、丁酸梭菌TK2菌体浓度的测定
筛选实例1
取1mL混匀后菌液加进9mL半固体琼脂试管培养基中,振荡搅匀,做10倍梯度稀释,稀释管和计数管于同一管,厌氧培养箱37℃培养24h。
测得的活菌数为:4.35×109cfu/g。
筛选实例2
取1mL混匀后菌液加进9mL无菌生理盐水中,做10倍梯度稀释,倾注法于培养皿中固体培养基,厌氧箱37℃培养24h。
测得的活菌数为:3.7×109cfu/g。
结果
采用高层半固体琼脂试管法测定丁酸梭菌的活菌数,简便快捷,减少菌体在氧气中暴漏的时间,可更有效的反映活菌浓度。
四、丁酸梭菌TK2芽孢率的测定
筛选实例1
取混匀后的菌液5mL于80℃水浴加热10min,杀死营养体细胞,经适当的10倍梯度稀释,其后同菌体浓度的测定例1。
测得的芽孢率:芽孢率85%。
筛选实例2
取混匀后的菌液5mL于80℃水浴加热10min,杀死营养体细胞,经适当的10倍梯度稀释,其后同菌体浓度的测定例2。
测得的芽孢率:芽孢率83.5%。
结果
采用高层半固体琼脂试管计数法可更有效的反映丁酸梭菌TK2的芽孢浓度。
结论
本实验采用的低成本固态发酵工艺生产丁酸梭菌,其培养基成分及培养条件经优化后,活菌菌体浓度及芽孢率均可达到理想水平,分别为4.35×109cfu/g和85%。