CN106538867A - 一种具有保健功能的低分子大豆多肽的制备方法 - Google Patents

一种具有保健功能的低分子大豆多肽的制备方法 Download PDF

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职爱民
张小宇
高松
李建新
聂卉
闵玉涛
宋彦显
郭林
杨联芝
李靖靖
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Abstract

本发明公开了一种具有保健功能的低分子大豆多肽的制备方法，将豆粕超微粉碎，用纤维素酶、果胶酶酶、内切β‑葡聚糖酶和植酸酶的复合酶一次酶解，再加入中性蛋白酶二次酶解，制得二次酶解豆粕；再以二次酶解豆粕为基质，用丁酸梭菌固体发酵，即得。本发明采用酶解和生物发酵相结合的方式对豆粕进行生物转化，通过两次酶解及一次发酵工艺，使豆粕蛋白质先水解成低分子肽链，再以此为基质制备含有丁酸梭菌活菌制剂的低分子多肽产品，降低了豆粕中主要非淀粉多糖含量和蛋白质分子量，提高了豆粕中活菌制剂的含量。本发明的制备方法简单、原料来源广泛、生产成本低，易于工业化的推广，具有良好的社会和经济效益。

Description

一种具有保健功能的低分子大豆多肽的制备方法
技术领域
本发明涉及一种具有保健功能的低分子大豆多肽的制备方法，属于豆粕深加工技术领域。
背景技术
豆粕是畜禽饲粮的主要蛋白源，含有丰富的蛋白质、必需氨基酸等营养物质，在饲料行业中得到广泛应用。但是由于豆粕分子质量大且含有大量的非淀粉多糖、大豆抗原蛋白和残留的蛋白酶抑制因子等抗营养因子，因此豆粕需要经过胃肠道复杂的消化过程才能被吸收利用，还会对畜禽肠道特别是幼龄畜禽肠道造成损伤。研究表明，幼龄动物的营养性腹泻、免疫力低下等问题多与豆粕的特性有着密切关系，直接造成蛋白质利用率低、原料浪费、环境污染和养殖成本增加等问题的发生。
豆类原料中的非淀粉多糖主要是果胶、甘露聚糖和纤维素。玉米一豆粕型日粮中的主要抗营养因子是非淀粉多糖(如玉米中木聚糖为4.3％，豆粕中果胶为14.0％，甘露聚糖为1.85％-2.37％，NDF为11.5％和ADF为8.3％)和植酸；玉米、豆粕、菜粕中总的非淀粉多糖含量分别为9.32％、29.02％和39.79％；而家禽对饲料中非淀粉多糖(NSP)消化率仅为5-20％。
丁酸梭菌，又名酪酸菌，它是梭状芽抱菌属中的一个种，具有维持肠道菌群平衡、增加机体免疫力、产生益生物质(在肠道内能产生B族维生素、维生素K及淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶等物质)的作用，丁酸梭菌的主要代谢产物为丁酸，而丁酸是肠道上皮组织细胞的再生和修复的主要营养物质。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的目的是提供一种具有保健功能的低分子大豆多肽的制备方法，该低分子大豆多肽能够提高促进猪的生长、降低料肉比、减少发病率，节约生产成本。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
一种具有保健功能的低分子大豆多肽的制备方法，将豆粕超微粉碎，用纤维素酶、果胶酶酶、内切β-葡聚糖酶和植酸酶的复合酶一次酶解，再加入中性蛋白酶二次酶解，制得二次酶解豆粕；再以二次酶解豆粕为基质，用丁酸梭菌固体发酵，即得。
具体的，所述的具有保健功能的低分子大豆多肽的制备方法，包括以下步骤：
(1)豆粕粉碎
以豆粕为原料，利用超微粉碎机将豆粕进行超微粉碎，得到豆粕微粉；
(2)一次非淀粉多糖酶解豆粕
以豆粕微粉为底物，添加纤维素酶200-250U/g底物、果胶酶450-500U/g底物、内切β-葡聚糖酶500-600U/g底物和植酸酶200-300U/g底物，进行一次酶解，得到一次酶解豆粕；灭酶；
(3)二次蛋白酶酶解豆粕
以步骤(2)的一次酶解豆粕为底物，添加中性蛋白酶800-1000U/g底物，进行二次酶解，得到二次酶解豆粕；灭酶；
(4)固体发酵
以步骤(3)的二次酶解豆粕为基质，制备固体发酵培养基，具体为(质量分数)：0.5％的硫酸铵、0.3％的麦芽糖、0.01％的硫酸镁、40-50％的水，余量为二次酶解豆粕；再按照1-5％(v/m)的接种量接种丁酸梭菌菌液，进行固体发酵；将固体发酵产物风干，即得。
所述的豆粕微粉的粒径为过40-60目筛。
所述的一次酶解的条件为：在45-55℃，pH4-5的条件下，反应6-7h。
所述的灭酶的条件为：在85-95℃条件下烘干灭酶。
所述的二次酶解的条件为：在45-55℃，pH6.5-7.5的条件下，反应4-6h。
所述的丁酸梭菌菌液中活菌数量为4.9×108CFU/ml。
所述的固体发酵的温度为25-35℃，时间为20-30h。
所述的豆粕的粗蛋白含量为46％。
所述的风干温度为60-70℃。
本发明的有益效果：
1、本发明采用酶解和生物发酵相结合的方式对豆粕进行生物转化，通过两次酶解及一次发酵工艺，使豆粕蛋白质先水解成低分子肽链，再以此为基质制备含有丁酸梭菌活菌制剂的低分子多肽产品，降低了豆粕中主要非淀粉多糖含量和蛋白质分子量，提高了豆粕中活菌制剂的含量。
2、由于现有的酶解豆粕的方法都是将所有的酶作为复合酶制剂，一次性加入豆粕中，但是由于不同酶的反应条件(时间、pH)都存在明显差异，因此，不当的添加方式会直接影响酶解效果。本发明针对豆粕的特性，优化复合酶制剂的组成，并根据不同酶的特性，分批次加入至豆粕中。实验证明，本发明采用两次酶解，使豆粕中的蛋白质降解为低分子肽链，同时降低了豆粕中主要非淀粉多糖含量。其中，一次酶解采用特定酶活的纤维素酶、果胶酶、β-葡聚糖酶、植酸酶联合的复合酶制剂，能够保证非淀粉多糖酶的完全转化，再利用中性蛋白酶进行二次酶解，将豆粕中被掩盖的营养成分完全释放出来。
3、本发明利用丁酸梭菌对二次酶解豆粕进行固态发酵，能够使二次酶解豆粕综合丁酸梭菌的特点，增加其附加值。而且以本发明的二次酶解豆粕为基质进行固态发酵，又能够作用于丁酸梭菌，使丁酸梭菌的活菌数量进一步提高，从而提高本发明的产品的吸收效果和利用率。
4、本发明的制备方法简单、原料来源广泛、生产成本低，易于工业化的推广，具有良好的社会和经济效益。
附图说明
图1为试验组仔猪小肠绒毛的电镜图。
图2为空白组仔猪小肠绒毛的电镜图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
本发明所用的豆粕原料中粗蛋白含量为46％。
本发明所用的丁酸梭菌菌液的制备方法为：取﹣20℃保藏于甘油管的丁酸梭菌菌种200μl接种于装有9ml的增殖培养基(RCM)的试管中，再在培养基上覆2cm左右液体石蜡，在37℃条件下静置培养48h以形成芽抱。将上述芽抱培养物置于80℃水浴处理10min，再分别以1ml的接种量转接到灭过菌的装有9ml增殖培养基的试管中，培养16-20h到对数期可以用于接种到发酵培养基中。
种子培养基(梭菌增殖培养基，简称RCM培养基)：酵母浸膏3g、牛肉浸膏10g、胰蛋白陈10g、葡萄糖5g、可溶性淀粉1g、氯化钠5g、三水合乙酸钠3g、半胱氨酸盐酸盐0.5g、0.5％美蓝0.2mL、蒸馏水1000mL，调节pH7.1±0.1，115℃，20min灭菌备用。
实施例1
一种具有保健功能的低分子大豆多肽的制备方法，包括以下步骤：
(1)豆粕粉碎
以豆粕为原料，利用超微粉碎机将豆粕进行超微粉碎，过40目筛，得到豆粕微粉；
(2)一次非淀粉多糖酶解豆粕
以豆粕微粉为底物，纤维素酶200U/g底物、果胶酶500U/g底物、内切β-葡聚糖酶500U/g底物和植酸酶200U/g底物，在50℃，pH4.5的条件下，反应7h，得到一次酶解豆粕；在90℃条件下烘干灭酶；
(3)二次蛋白酶酶解豆粕
以步骤(2)的一次酶解豆粕为底物，添加中性蛋白酶800U/g底物，在50℃，pH7.0的条件下，反应5h，得到二次酶解豆粕；在90℃条件下烘干灭酶；
(4)固体发酵
以步骤(3)的二次酶解豆粕为基质，制备固体发酵培养基，具体为(质量分数)：0.5％的硫酸铵、0.3％的麦芽糖、0.01％的硫酸镁、50％的水，余量为二次酶解豆粕；再按照4％(v/m)的接种量接种丁酸梭菌菌液，丁酸梭菌菌液中活菌数量为4.9×108CFU/ml，在30℃条件下固体发酵24h；将固体发酵产物70℃风干，即得。
步骤(2)中的酶以酶液的形式加入，即根据底物的重量称取对应重量的纤维素酶、果胶酶、β-葡聚糖酶和植酸酶的酶粉，将称取的各酶粉加入底物重量5倍的水中。
步骤(3)中的酶以酶液的形式加入，即根据底物的重量称取对应重量的中性蛋白酶酶粉，将称取的酶粉加入底物重量5倍的水中。
实施例2
一种具有保健功能的低分子大豆多肽的制备方法，包括以下步骤：
(1)豆粕粉碎
以豆粕为原料，利用超微粉碎机将豆粕进行超微粉碎，过60目筛，得到豆粕微粉；
(2)一次非淀粉多糖酶解豆粕
以豆粕微粉为底物，添加纤维素酶250U/g底物、果胶酶450U/g底物、β-葡聚糖酶600U/g底物和植酸酶300U/g底物，在45℃，pH5的条件下，反应7h，得到一次酶解豆粕；在85℃条件下烘干灭酶；
(3)二次蛋白酶酶解豆粕
以步骤(2)的一次酶解豆粕为底物，添加中性蛋白酶1000U/g底物，在45℃，pH6.5的条件下，反应6h，得到二次酶解豆粕；在85℃条件下烘干灭酶；
(4)固体发酵
以步骤(3)的二次酶解豆粕为基质，制备固体发酵培养基，具体为(质量分数)：0.5％的硫酸铵、0.3％的麦芽糖、0.01％的硫酸镁、40％的水，余量为二次酶解豆粕；再按照5％(v/m)的接种量接种丁酸梭菌菌液，丁酸梭菌菌液中活菌数量为4.9×108CFU/ml，在25℃条件下固体发酵30h；将固体发酵产物60℃风干，即得。
实施例3
一种具有保健功能的低分子大豆多肽的制备方法，包括以下步骤：
(1)豆粕粉碎
以豆粕为原料，利用超微粉碎机将豆粕进行超微粉碎，过50目筛，得到豆粕微粉；
(2)一次非淀粉多糖酶解豆粕
以豆粕微粉为底物，添加纤维素酶200U/g底物、果胶酶500U/g底物、β-葡聚糖酶550U/g底物和植酸酶250U/g底物，在55℃，pH4的条件下，反应6h，得到一次酶解豆粕；在95℃条件下烘干灭酶；
(3)二次蛋白酶酶解豆粕
以步骤(2)的一次酶解豆粕为底物，添加中性蛋白酶900U/g底物，在55℃，pH7.5的条件下，反应4h，得到二次酶解豆粕；在95℃条件下烘干灭酶；
(4)固体发酵
以步骤(3)的二次酶解豆粕为基质，制备固体发酵培养基，具体为(质量分数)：0.5％的硫酸铵、0.3％的麦芽糖、0.01％的硫酸镁、45％的水，余量为二次酶解豆粕；再按照1％(v/m)的接种量接种丁酸梭菌菌液，丁酸梭菌菌液中活菌数量为4.9×108CFU/ml，在35℃条件下固体发酵20h；将固体发酵产物65℃风干，即得。
对照例1
一种低分子大豆多肽的制备方法，包括以下步骤：
(1)豆粕粉碎
以豆粕为原料，利用超微粉碎机将豆粕进行超微粉碎，过40目筛，得到豆粕微粉；
(2)一次非淀粉多糖酶解豆粕
以豆粕微粉为底物，添加纤维素酶200U/g底物、果胶酶500U/g底物、β-葡聚糖酶500U/g底物、植酸酶200U/g底物和中性蛋白酶800U/g底物，在50℃，pH4.5的条件下，反应7h，得到酶解豆粕；在90℃条件下烘干灭酶；
(3)固体发酵
以步骤(2)的酶解豆粕为基质，制备固体发酵培养基，具体为(质量分数)：0.5％的硫酸铵、0.3％的麦芽糖、0.01％的硫酸镁、50％的水，余量为二次酶解豆粕；再按照4％(v/m)的接种量接种丁酸梭菌菌液，丁酸梭菌菌液中活菌数量为4.9×108CFU/ml，在30℃条件下固体发酵24h；将固体发酵产物70℃风干，即得。
对照例2
一种低分子大豆多肽的制备方法，包括以下步骤：
(1)豆粕粉碎
以豆粕为原料，利用超微粉碎机将豆粕进行超微粉碎，过40目筛，得到豆粕微粉；
(2)蛋白酶酶解豆粕
以步骤(1)的豆粕微粉为底物，添加中性蛋白酶800U/g底物，在50℃，pH7.0的条件下，反应5h，得到酶解豆粕；在90℃条件下烘干灭酶；
(3)固体发酵
以步骤(2)的酶解豆粕为基质，制备固体发酵培养基，具体为(质量分数)：0.5％的硫酸铵、0.3％的麦芽糖、0.01％的硫酸镁、50％的水，余量为二次酶解豆粕；再按照4％(v/m)的接种量接种丁酸梭菌菌液，丁酸梭菌菌液中活菌数量为4.9×108CFU/ml，在30℃条件下固体发酵24h；将固体发酵产物70℃风干，即得。
对照例3
一种低分子大豆多肽的制备方法，包括以下步骤：
(1)豆粕粉碎
以豆粕为原料，利用超微粉碎机将豆粕进行超微粉碎，过40目筛，得到豆粕微粉；
(2)一次非淀粉多糖酶解豆粕
以豆粕微粉为底物，添加纤维素酶200U/g底物、果胶酶500U/g底物、β-葡聚糖酶500U/g底物和植酸酶200U/g底物，在50℃，pH4.5的条件下，反应7h，得到一次酶解豆粕；在90℃条件下烘干灭酶；
(3)二次蛋白酶酶解豆粕
以步骤(2)的一次酶解豆粕为底物，添加中性蛋白酶800U/g底物，在50℃，pH7.0的条件下，反应5h，得到二次酶解豆粕；在90℃条件下烘干灭酶；即得。
对照例4
一种低分子大豆多肽的制备方法，包括以下步骤：
(1)豆粕粉碎
以豆粕为原料，利用超微粉碎机将豆粕进行超微粉碎，过50目筛，得到豆粕微粉；
(2)一次酶解
以豆粕微粉为底物，添加淀粉酶600U/g底物和植酸酶250U/g底物，在55℃，pH4的条件下，反应6h，得到一次酶解豆粕；在95℃条件下烘干灭酶；
(3)二次酶解
以步骤(2)的一次酶解豆粕为底物，添加甘露糖苷酶400U/g底物、过氧化氢酶500U/g底物和中性蛋白酶900U/g底物，在55℃，pH7.5的条件下，反应4h，得到二次酶解豆粕；在95℃条件下烘干灭酶；
(4)固体发酵
以步骤(3)的二次酶解豆粕为基质，制备固体发酵培养基，具体为(质量分数)：0.5％的硫酸铵、0.3％的麦芽糖、0.01％的硫酸镁、45％的水，余量为二次酶解豆粕；再按照1％(v/m)的接种量接种丁酸梭菌菌液，丁酸梭菌菌液中活菌数量为4.9×108CFU/ml，在35℃条件下固体发酵20h；将固体发酵产物65℃风干，即得。
应用例1
本应用例在济源某规模猪场完成，试验期45天。
试验设计：采用单因子设计试验，选用192头30日龄仔猪随机分成六组，每组32头，每组4个重复，每个重复8头猪。
试验日粮：空白组喂饲规模猪场原仔猪饲料配方，配方中20％豆粕。试验组为用实施例1的低分子大豆多肽替代原配方中5％的豆粕，对照组1-4分别用对照例1-4的低分子大豆多肽替代原配方中5％的豆粕。
测定指标：初重、末重、日增重、料肉比、发病率。
测试结果具体数据如下表：
项目 空白组 试验组 对照组1 对照组2 对照组3 对照组4
均只初重(kg) 6.54 6.44 6.56 6.48 6.51 6.47
均只末重(kg) 23.24 26.03 23.69 24.47 24.64 24.95
日增重(g) 371 435 381 400 403 410
料肉比 1.42 1.25 1.38 1.33 1.30 1.35
发病率(％) 5.42 2.61 4.89 4.52 3.85 3.09
试验结果表明：在仔猪饲料里添加5％本发明的低分子大豆多肽能够提高猪的日增重、降低料肉比、减少发病率，显著优于其他方法制备的低分子大豆多肽。
对试验组和空白组的仔猪小肠绒毛进行电镜观察和对比(图1-2)，结果可知，小肠绒毛高度空白组不如试验组效果好，充分说明本产品比豆粕具有明显的保健及促生长功能。
应用例2
本应用例在焦作某规模猪场完成，试验期45天。
试验设计：采用单因子设计试验，选用144头30日龄刚断奶仔猪随机分成六组，每组24头，每组3个重复，每个重复8头猪。
试验日粮：空白组饲喂规模猪场原仔猪饲料配方，配方中22％豆粕。试验组为用实施例1的低分子大豆多肽替代原配方中6％的豆粕。对照组1-4分别用对照例1-4的低分子大豆多肽替代原配方中6％的豆粕。
测定指标：初重、末重、日增重、料肉比、发病率。
测试结果具体数据如下表：
试验结果表明：在仔猪饲料里添加6％本发明的低分子大豆多肽能够提高猪的日增重、降低料肉比、减少发病率，充分说明本产品与豆粕以及其他方法制备的低分子大豆多肽相比，具有更加明显的保健及促生长功能。
应用例3
本应用例在卫辉某规模猪场完成，试验期45天。
试验设计：采用单因子设计试验，选用240头30日龄刚断奶仔猪随机分成六组，每组40头，每组4个重复，每个重复10头猪。
试验日粮：空白组饲喂规模猪场原仔猪饲料配方，配方中18％豆粕。试验组为用实施例1的低分子大豆多肽替代原配方中5％的豆粕。对照组1-4分别用对照例1-4的低分子大豆多肽替代原配方中6％的豆粕。
测定指标：初重、末重、日增重、料肉比、发病率。
测试结果具体数据如下表：
项目 空白组 试验组 对照组1 对照组2 对照组3 对照组4
均只初重(kg) 6.91 6.89 6.85 6.73 6.81 6.83
均只末重(kg) 24.90 27.11 25.31 25.62 25.81 25.90
日增重(g) 400 449 410 420 422 424
料肉比 1.32 1.18 1.29 1.27 1.28 1.28
发病率(％) 5.25 2.11 4.14 3.78 3.54 3.14
试验结果表明：在仔猪饲料里添加5-6％本发明的低分子大豆多肽能够显著提高猪的日增重、降低料肉比、减少发病率，充分说明本产品与豆粕以及其他方法制备的低分子大豆多肽相比，具有更加明显的保健及促生长功能。

Claims (10)

1.一种具有保健功能的低分子大豆多肽的制备方法，其特征在于，将豆粕超微粉碎，用纤维素酶、果胶酶酶、内切β-葡聚糖酶和植酸酶的复合酶一次酶解，再加入中性蛋白酶二次酶解，制得二次酶解豆粕；再以二次酶解豆粕为基质，用丁酸梭菌固体发酵，即得。
2.根据权利要求1所述的具有保健功能的低分子大豆多肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)豆粕粉碎
以豆粕为原料，利用超微粉碎机将豆粕进行超微粉碎，得到豆粕微粉；
(2)一次非淀粉多糖酶解豆粕
以豆粕微粉为底物，添加纤维素酶200-250U/g底物、果胶酶450-500U/g底物、内切β-葡聚糖酶500-600U/g底物和植酸酶200-300U/g底物，进行一次酶解，得到一次酶解豆粕；灭酶；
(3)二次蛋白酶酶解豆粕
以步骤(2)的一次酶解豆粕为底物，添加中性蛋白酶800-1000U/g底物，进行二次酶解，得到二次酶解豆粕；灭酶；
(4)固体发酵
以步骤(3)的二次酶解豆粕为基质，制备固体发酵培养基，具体为(质量分数)：0.5％的硫酸铵、0.3％的麦芽糖、0.01％的硫酸镁、40-50％的水，余量为二次酶解豆粕；再按照1-5％(v/m)的接种量接种丁酸梭菌菌液，进行固体发酵；将固体发酵产物风干，即得。
3.根据权利要求2所述的具有保健功能的低分子大豆多肽的制备方法，其特征在于，所述的豆粕微粉的粒径为过40-60目筛。
4.根据权利要求2所述的具有保健功能的低分子大豆多肽的制备方法，其特征在于，所述的一次酶解的条件为：在45-55℃，pH4-5的条件下，反应6-7h。
5.根据权利要求2所述的具有保健功能的低分子大豆多肽的制备方法，其特征在于，所述的灭酶的条件为：在85-95℃条件下烘干灭酶。
6.根据权利要求2所述的具有保健功能的低分子大豆多肽的制备方法，其特征在于，所述的二次酶解的条件为：在45-55℃，pH6.5-7.5的条件下，反应4-6h。
7.根据权利要求2所述的具有保健功能的低分子大豆多肽的制备方法，其特征在于，所述的丁酸梭菌菌液中活菌数量为4.9×108CFU/ml。
8.根据权利要求2所述的具有保健功能的低分子大豆多肽的制备方法，其特征在于，所述的固体发酵的温度为25-35℃，时间为20-30h。
9.根据权利要求2-8任一项所述的具有保健功能的低分子大豆多肽的制备方法，其特征在于，所述的豆粕的粗蛋白含量为46％。
10.根据权利要求9所述的具有保健功能的低分子大豆多肽的制备方法，其特征在于，所述的风干温度为60-70℃。
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