CN103013961A - 利用木薯渣发酵生产中性蛋白酶和饲料添加剂的方法 - Google Patents
利用木薯渣发酵生产中性蛋白酶和饲料添加剂的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103013961A CN103013961A CN2012105494051A CN201210549405A CN103013961A CN 103013961 A CN103013961 A CN 103013961A CN 2012105494051 A CN2012105494051 A CN 2012105494051A CN 201210549405 A CN201210549405 A CN 201210549405A CN 103013961 A CN103013961 A CN 103013961A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- neutral protease
- fermentation
- centrifugal
- fodder additives
- manioc waste
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Fodder In General (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开一种利用木薯渣发酵生产中性蛋白酶和饲料添加剂的方法。该方法为将斜面活化的枯草芽孢杆菌接种到种子培养基中，再接种到发酵培养基中进行摇瓶发酵或是发酵罐发酵，发酵培养基：木薯渣10～80g/L，豆粕粉10～40g/L，麸皮10～40g/L，Na2HPO44g/L，KH2PO40.3g/L，pH为7.5～8.5；将发酵液离心，上清为中性蛋白酶粗液，沉淀干燥即为含枯草芽孢干菌的饲料添加剂。所使用的木薯渣是木薯淀粉工业加工的废弃物，含有颗粒细小的淀粉和纤维素，有利于产酶微生物在不经过预处理的情况下直接水解和利用，不需外加酶水解即可用于中性蛋白酶发酵，具有负成本的特点，变废为宝，解决木薯淀粉工业中的环境污染问题。
Description
技术领域
本发明涉及微生物发酵生产领域，特别涉及一种利用木薯渣发酵生产中性蛋白酶和饲料添加剂的方法。
背景技术
中性蛋白酶是最早为人类所发现并应用于工业化生产的蛋白酶制剂之一，目前工业上主要利用枯草芽孢杆菌，以玉米粉为主要原料发酵生产。粮食的紧张和价格的波动导致中性蛋白酶价格的波动，阻碍了中性蛋白酶产业的发展。国家政策规划要求不与人争粮，解决成本和政策上的巨大挑战最有希望的途径就是以工农业废弃物为原料进行中性蛋白酶的生产。
木薯作为我国南方的主要经济作物，年产量约为600万吨，主要用于生产淀粉。每年加工淀粉产出大量的木薯渣，干木薯渣中残留了35%～45%的淀粉。目前大量的木薯渣未得到有效利用，既造成资源浪费又污染了环境。木薯渣中有大量的残留淀粉和蛋白质，可以代替玉米粉用于中性蛋白酶发酵。目前利用木薯渣为碳源生产高附加值产品中性蛋白酶的研究还未见报道。
原材料成本在中性蛋白酶发酵生产中占有较大比重，以工业废弃物——木薯渣为原料进行直接发酵，降低原料成本对于中性蛋白酶发酵生产具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种利用木薯渣发酵生产中性蛋白酶和饲料添加剂的方法。该方法以木薯渣为原料不仅省去了原材料、预处理以及酶解糖化的费用，具有经济可行性，而且可以变废为宝，解决木薯淀粉工业的环境污染问题。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种利用木薯渣发酵生产中性蛋白酶和饲料添加剂的方法，包含以下步骤：
（1）菌种的活化：将枯草芽孢杆菌接种到斜面培养基上，进行活化；斜面培养基组成为：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，琼脂20g/L，pH值为8.0；
（2）种子液的制备：将活化的枯草芽孢杆菌接种到种子培养基中，25～30℃、150～200rpm培养至OD600为1.4～1.6；再以体积百分比5%的接种量转接种子培养基中，25～30℃、150～200rpm培养5～10h；将菌液离心，取沉淀，用生理盐水悬浮沉淀，即得种子液；种子培养基组成为：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，pH值为8.0；
（3）中性蛋白酶发酵：中性蛋白酶发酵通过摇瓶好氧发酵或是发酵罐发酵进行：
①摇瓶好氧发酵：将步骤（2）制备的种子液以体积百分比5%的接种量接到发酵培养基中，25～30℃、150～200rpm摇瓶好氧培养至少36小时；
②发酵罐发酵：将步骤（2）制备的种子液以体积百分比5%的接种量接到发酵培养基中，控制转速200～1000rpm，通气量0.5～2.0vvm，使溶氧控制在30%，当pH值下降到6.5以下时，流加1mol/L盐酸控制pH在6.5，使用体积百分比25%的泡敌进行泡沫控制，培养至少36小时；
发酵培养基：木薯渣10～80g/L，豆粕粉10～40g/L，麸皮10～40g/L，Na2HPO44g/L，KH2PO40.3g/L，pH为7.5～8.5；
（4）粗酶液分离及饲料添加剂的制备：将步骤（3）得到的发酵液离心，上清液为中性蛋白酶粗酶液；沉淀干燥后，得到饲料添加剂；
所述的利用木薯渣发酵生产中性蛋白酶和饲料添加剂的方法，还包含以下步骤：（5）中性蛋白酶的提取：将步骤（4）得到的中性蛋白酶粗酶液置于冰水浴中，边搅拌边加入硫酸铵，使达到40%饱和度，置于4℃下静置过夜，离心，取上清，在上清液补加硫酸铵至60%饱和度，置于4℃下静置过夜，离心，收集沉淀；将沉淀真空冷冻干燥，得到中性蛋白酶；
步骤（1）中所述的枯草芽孢杆菌优选为枯草芽孢杆菌AS1.398；
步骤（2）中所述的离心的条件优选为4℃、5000rpm离心10min；
步骤（3）①中所述的摇瓶好氧培养的时间优选为36～72h；
步骤（3）②中所述的培养的时间优选为36～60h；
步骤（4）中所述的离心的条件优选为4℃、10000rpm下离心20min；
步骤（5）中所述的离心的条件优选为4℃、10000rpm离心30min。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
本发明中发酵所用的原料是木薯淀粉工业中的废弃物——木薯渣，含有颗粒细小的淀粉，具有较大的比表面积，有利于产酶微生物在不经过预处理的情况下直接水解和利用，而且具有负成本的特点。因此，以木薯渣为原料发酵同时生产中性蛋白酶和饲料添加剂不仅省去了原材料、预处理及酶的费用，具有经济可行性，而且可以变废为宝，解决木薯淀粉工业中的环境污染问题，具有极大的示范和推广价值。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
利用木薯渣发酵生产中性蛋白酶和饲料添加剂的方法，具体过程如下：
（1）菌种的活化：将枯草芽孢杆菌AS1.398（中国微生物菌种保藏中心）接种到斜面培养基上，培养48h，进行活化；斜面培养基组成为：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，琼脂20g/L，pH值为8.0，121℃灭菌20min。
（2）种子液的制备：挑取在试管斜面培养基活化48h的枯草芽孢杆菌菌苔2环到10mL种子培养基，25℃、150rpm培养10h（OD600约为1.4），以体积百分比5%的接种量（即2.5ml菌液）转接到47.5mL种子培养基中，25℃、200rpm培养7h，4℃、5000rpm离心10min去上清，用等量生理盐水悬浮沉淀，即得种子液。种子培养基组成为：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，调节pH到8.0，121℃灭菌20min。
（3）中性蛋白酶发酵：将步骤（2）制备的种子液以体积百分比5%的接种量接到发酵培养基中，25℃、150rpm摇瓶（500mL摇瓶装50mL发酵培养基）好氧（摇瓶好氧培养即为能从空气中获得氧气）培养36h；发酵培养基：木薯渣（广西武鸣淀粉厂废弃物）10g/L，豆粕粉10g/L，麸皮10g/L，Na2HPO44g/L，KH2PO40.3g/L，加入0.5mol/L NaOH调节pH，使121℃灭菌30min后的起始pH为8.5左右。
（4）粗酶液分离及饲料添加剂的制备：取步骤（3）得到的发酵液在4℃、10000rpm下离心20min，收集上清液，即为中性蛋白酶粗酶液。分离残渣直接喷雾干燥即得饲料添加剂，枯草芽孢杆菌菌数为8.2×109个/g。
（5）中性蛋白酶的提取：将步骤（4）得到的中性蛋白酶粗酶液置于冰水浴中，边搅拌边加入适量的硫酸铵固体使达到40%饱和度，置于4℃下静置过夜，4℃、10000rpm离心30min，取上清液。在上清液补加硫酸铵至60%饱和度，置于4℃下静置过夜，4℃、10000rpm离心30min收集沉淀。沉淀真空冷冻干燥24h后，即得中性蛋白酶产品，酶活为21万U/g，中性蛋白酶活力回收率为59.8%，纯度为3201U/mg。酶活力、蛋白及菌数的测定方法见参考文献【陈鸿图，傅金磊，杨月明，梁颖婕，谢文化，朱明军，枯草芽孢杆菌产中性蛋白酶的特性及补料研究，食品与发酵工业，2012,38（3）：43-48）】。
实施例2
利用木薯渣发酵生产中性蛋白酶和饲料添加剂的方法，具体过程如下：
（1）菌种的活化：同实施例1步骤（1）。
（2）种子液的制备：挑取在试管斜面培养基活化48h的枯草芽孢杆菌菌苔2环到10mL种子培养基，30℃、200rpm培养10h（OD600约为1.6），以体积百分比5%的接种量（即2.5ml菌液）转接到47.5mL种子培养基中，30℃、200rpm培养5h，4℃、5000rpm离心10min去上清，用等量生理盐水悬浮沉淀，即得种子液。种子培养基组成为：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，调节pH到8.0，121℃灭菌20min。
（3）中性蛋白酶发酵：将步骤（2）制备的种子液以体积百分比5%的接种量发酵培养基中，30℃、200rpm摇瓶（500mL摇瓶装50mL发酵培养基）好氧培养72h；发酵培养基：木薯渣80g/L，豆粕粉40g/L，麸皮40g/L，Na2HPO44g/L，KH2PO40.3g/L，加入0.5mol/L NaOH调节pH，使121℃灭菌30min后的起始pH为7.5左右。
（4）粗酶液分离及饲料添加剂的制备：取步骤（3）得到的发酵液在4℃、10000rpm下离心20min，收集上清液，即为中性蛋白酶粗酶液。分离残渣直接喷雾干燥即得饲料添加剂，枯草芽孢杆菌菌数为5.1×1010个/g。
（5）中性蛋白酶的提取：将步骤（4）得到的中性蛋白酶粗酶液置于冰水浴中，边搅拌边加入适量的硫酸铵固体使达到40%饱和度，置于4℃下静置过夜，4℃、10000rpm离心30min，取上清液。在上清液补加硫酸铵至60%饱和度，置于4℃下静置过夜，4℃、10000rpm离心30min收集沉淀。沉淀真空冷冻干燥24h后，即得中性蛋白酶产品，酶活为23万U/g，中性蛋白酶活力回收率为61.2%，纯度为3152U/mg。酶活力、蛋白及菌数的测定方法见参考文献【陈鸿图，傅金磊，杨月明，梁颖婕，谢文化，朱明军，枯草芽孢杆菌产中性蛋白酶的特性及补料研究，食品与发酵工业，2012,38（3）：43-48）】。
实施例3
利用木薯渣发酵生产中性蛋白酶和饲料添加剂的方法，具体过程如下：
（1）菌种的活化：同实施例1步骤（1）。
（2）种子液的制备：挑取在试管斜面培养基活化48h的枯草芽孢杆菌菌苔2环到10mL种子培养基，28℃、180rpm培养10h（OD600约为1.5），以体积百分比5%的接种量（即2.5ml菌液）转接到47.5mL种子培养基中，28℃、180rpm培养10h，4℃、5000rpm离心10min去上清，用等量生理盐水悬浮沉淀，即得种子液。种子培养基组成为：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，调节pH到8.0，121℃灭菌20min。
（3）中性蛋白酶发酵：将步骤（2）制备的种子液以体积百分比5%的接种量接到发酵培养基中，28℃、180rpm摇瓶（500mL摇瓶装50mL发酵培养基）好氧培养42h；发酵培养基：木薯渣60g/L，豆粕粉40g/L，麸皮30g/L，Na2HPO44g/L，KH2PO40.3g/L，加入0.5mol/L NaOH调节pH，使121℃灭菌30min后的起始pH为8.0左右。
（4）粗酶液分离及饲料添加剂的制备：取步骤（3）得到的发酵液在4℃、10000rpm下离心20min，收集上清液，即为中性蛋白酶粗酶液。分离残渣直接喷雾干燥即得饲料添加剂，枯草芽孢杆菌菌数为7.2×1010个/g。
（5）中性蛋白酶的提取：将步骤（4）得到的中性蛋白酶粗酶液置于冰水浴中，边搅拌边加入适量的硫酸铵固体使达到40%饱和度，置于4℃下静置过夜，4℃、10000rpm离心30min，取上清液。在上清液补加硫酸铵至60%饱和度，置于4℃下静置过夜，4℃、10000rpm离心30min收集沉淀。沉淀真空冷冻干燥24h后，即得中性蛋白酶产品，酶活为25万U/g，中性蛋白酶活力回收率为60.4%，纯度为3058U/mg。酶活力、蛋白及菌数的测定方法见参考文献【陈鸿图，傅金磊，杨月明，梁颖婕，谢文化，朱明军，枯草芽孢杆菌产中性蛋白酶的特性及补料研究，食品与发酵工业，2012,38（3）：43-48）】。
实施例4
利用木薯渣发酵生产中性蛋白酶和饲料添加剂的方法，具体过程如下：
（1）菌种的活化：同实施例1步骤（1）。
（2）种子液的制备：挑取在试管斜面培养基活化48h菌苔2环到10mL种子培养基，30℃、200rpm培养10h（OD600约为1.5），以5%的接种量转接到47.5mL的种子培养基中，30℃、200rpm培养6h，4℃、5000rpm离心10min去上清，用等量生理盐水悬浮，即得种子液。种子培养基组成为：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，调节pH到8.0，121℃灭菌20min。
（3）中性蛋白酶发酵：将步骤（2）制备的种子液以体积百分比5%的接种量接到发酵培养基中，发酵罐（5L发酵罐装3L发酵培养基）培养时控制温度30℃，转速控制在200～1000rpm（发酵罐的转速在发酵过程中是波动的），通气量0.5～2.0vvm（通气量在发酵过程中也是波动的），使溶氧控制在30%，当pH值下降到6.5以下时，流加1mol/L盐酸控制pH在6.5，使用体积百分比为25%的泡敌进行泡沫控制，培养时间为37h。发酵培养基制备及灭菌：木薯渣50g/L，豆粕粉40g/L，麸皮20g/L，Na2HPO44g/L，KH2PO40.3g/L，加入0.5mol/L NaOH，使121℃灭菌30min后的起始pH为8.0左右。
（4）粗酶液分离及饲料添加剂的制备：取步骤（3）得到的发酵液在4℃、10000rpm下离心20min，收集上清液，即为中性蛋白酶粗酶液。分离残渣直接喷雾干燥即得饲料添加剂，枯草芽孢杆菌菌数为6.8×1010个/g。
（5）中性蛋白酶的提取：将步骤（4）得到的中性蛋白酶粗酶液置于冰水浴中，边搅拌边加入适量的硫酸铵固体使达到40%饱和度，置于4℃下静置过夜，4℃、10000rpm离心30min，取上清液。在上清液补加硫酸铵至60%饱和度，置于4℃下静置过夜，4℃、10000rpm离心30min收集沉淀。沉淀真空冷冻干燥24h后，即得中性蛋白酶产品，酶活为31万U/g，中性蛋白酶活力回收率为59.6%，纯度为3146U/mg。酶活力、蛋白及菌数的测定方法见参考文献【陈鸿图，傅金磊，杨月明，梁颖婕，谢文化，朱明军，枯草芽孢杆菌产中性蛋白酶的特性及补料研究，食品与发酵工业，2012,38（3）：43-48）】。
对比例1
利用木薯渣发酵生产中性蛋白酶和饲料添加剂的方法，具体过程如下：
（1）菌种的活化：同实施例1步骤（1）。
（2）种子液的制备：挑取在试管斜面培养基活化48h菌苔2环到10mL种子培养基，30℃、200rpm培养10h（OD600约为1.5），以5%的接种量转接到47.5mL的种子培养基中，30℃、200rpm培养6h，4℃、5000rpm离心10min去上清，用等量生理盐水悬浮，即得种子液。种子培养基组成为：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，调节pH到8.0，121℃灭菌20min。
（3）中性蛋白酶发酵：将步骤（2）制备的种子液以体积百分比5%的接种量接到发酵培养基中，发酵罐（5L发酵罐装3L发酵培养基）培养时控制温度30℃，转速控制在200～1000rpm（发酵罐的转速在发酵过程中是波动的，控制溶氧为30%），通气量0.5～2.0vvm（通气量在发酵过程中也是波动的），使溶氧控制在10%，当pH值下降到6.5以下时，流加1mol/L盐酸控制pH在6.5，使用体积百分比为25%的泡敌进行泡沫控制，培养时间为84h。发酵培养基制备及灭菌：木薯渣40g/L，豆粕粉40g/L，麸皮20g/L，Na2HPO44g/L，KH2PO40.3g/L，加入0.5mol/L NaOH，使121℃灭菌30min后的起始pH为8.0左右。
（4）粗酶液分离及饲料添加剂的制备：取步骤（3）得到的发酵液在4℃、10000rpm下离心20min，收集上清液，即为中性蛋白酶粗酶液。分离残渣直接喷雾干燥即得饲料添加剂，枯草芽孢杆菌菌数为4.8×108个/g。
（5）中性蛋白酶的提取：将步骤（4）得到的中性蛋白酶粗酶液置于冰水浴中，边搅拌边加入适量的硫酸铵固体使达到40%饱和度，置于4℃下静置过夜，4℃、10000rpm离心30min，取上清液。在上清液补加硫酸铵至60%饱和度，置于4℃下静置过夜，4℃、10000rpm离心30min收集沉淀。沉淀真空冷冻干燥24h后，即得中性蛋白酶产品，酶活为16万U/g，中性蛋白酶活力回收率为53.8%，纯度为2846U/mg。酶活力、蛋白及菌数的测定方法见参考文献【陈鸿图，傅金磊，杨月明，梁颖婕，谢文化，朱明军，枯草芽孢杆菌产中性蛋白酶的特性及补料研究，食品与发酵工业，2012,38（3）：43-48）】。
该对比例说明溶氧过小，影响枯草芽孢杆菌的生长和中性蛋白酶的生成。
对比例2
利用木薯渣发酵生产中性蛋白酶和饲料添加剂的方法，具体过程如下：
（1）菌种的活化：同实施例1步骤（1）。
（2）种子液的制备：挑取在试管斜面培养基活化48h的枯草芽孢杆菌菌苔2环到10mL种子培养基，30℃、200rpm培养10h（OD600约为1.6），以体积百分比5%的接种量（即2.5ml菌液）转接到47.5mL种子培养基中，30℃、200rpm培养5h，4℃、5000rpm离心10min去上清，用等量生理盐水悬浮沉淀，即得种子液。种子培养基组成为：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，调节pH到8.0，121℃灭菌20min。
（3）中性蛋白酶发酵：将步骤（2）制备的种子液以体积百分比5%的接种量发酵培养基中，30℃、200rpm摇瓶（500mL摇瓶装50mL发酵培养基）好氧培养72h；发酵培养基：葡萄糖40g/L，胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，加入0.5mol/L NaOH调节pH，使121℃灭菌30min后的起始pH为8.0左右。
（4）粗酶液分离及饲料添加剂的制备：取步骤（3）得到的发酵液在4℃、10000rpm下离心20min，收集上清液，即为中性蛋白酶粗酶液。分离残渣直接喷雾干燥即得饲料添加剂，枯草芽孢杆菌菌数为4.9×109个/g。
（5）中性蛋白酶的提取：将步骤（4）得到的中性蛋白酶粗酶液置于冰水浴中，边搅拌边加入适量的硫酸铵固体使达到40%饱和度，置于4℃下静置过夜，4℃、10000rpm离心30min，取上清液。在上清液补加硫酸铵至60%饱和度，置于4℃下静置过夜，4℃、10000rpm离心30min收集沉淀。沉淀真空冷冻干燥24h后，即得中性蛋白酶产品，酶活为18万U/g，中性蛋白酶活力回收率为59.3%，纯度为2818U/mg。酶活力、蛋白及菌数的测定方法见参考文献【陈鸿图，傅金磊，杨月明，梁颖婕，谢文化，朱明军，枯草芽孢杆菌产中性蛋白酶的特性及补料研究，食品与发酵工业，2012,38（3）：43-48）】。
该对比例说明发酵培养基的成分影响枯草芽孢杆菌产酶，特别是木薯渣、豆粕粉和麸皮对产酶非常重要。
对比例3
利用木薯渣发酵生产中性蛋白酶和饲料添加剂的方法，具体过程如下：
（1）菌种的活化：同实施例1步骤（1）。
（2）种子液的制备：挑取在试管斜面培养基活化48h的枯草芽孢杆菌菌苔2环到10mL种子培养基，30℃、200rpm培养10h（OD600约为1.6），以体积百分比5%的接种量（即2.5ml菌液）转接到47.5mL种子培养基中，30℃、200rpm培养5h，4℃、5000rpm离心10min去上清，用等量生理盐水悬浮沉淀，即得种子液。种子培养基组成为：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，调节pH到8.0，121℃灭菌20min。
（3）中性蛋白酶发酵：将步骤（2）制备的种子液以体积百分比5%的接种量发酵培养基中，30℃、200rpm摇瓶（500mL摇瓶装50mL发酵培养基）好氧培养72h；发酵培养基：木薯渣40g/L，胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，加入0.5mol/L NaOH调节pH，使121℃灭菌30min后的起始pH为8.0左右。
（4）粗酶液分离及饲料添加剂的制备：取步骤（3）得到的发酵液在4℃、10000rpm下离心20min，收集上清液，即为中性蛋白酶粗酶液。分离残渣直接喷雾干燥即得饲料添加剂，枯草芽孢杆菌菌数为5.6×109个/g。
（5）中性蛋白酶的提取：将步骤（4）得到的中性蛋白酶粗酶液置于冰水浴中，边搅拌边加入适量的硫酸铵固体使达到40%饱和度，置于4℃下静置过夜，4℃、10000rpm离心30min，取上清液。在上清液补加硫酸铵至60%饱和度，置于4℃下静置过夜，4℃、10000rpm离心30min收集沉淀。沉淀真空冷冻干燥24h后，即得中性蛋白酶产品，酶活为20万U/g，中性蛋白酶活力回收率为59.3%，纯度为2818U/mg。酶活力、蛋白及菌数的测定方法见参考文献【陈鸿图，傅金磊，杨月明，梁颖婕，谢文化，朱明军，枯草芽孢杆菌产中性蛋白酶的特性及补料研究，食品与发酵工业，2012,38（3）：43-48）】。
该对比例与对比例2相比，说明发酵培养基中的木薯渣与葡萄糖相比，可以促进枯草芽孢杆菌产酶；与实施例相比，说明豆粕粉和麸皮对产酶非常重要。
对比例4
利用木薯渣发酵生产中性蛋白酶和饲料添加剂的方法，具体过程如下：
（1）菌种的活化：同实施例1步骤（1）。
（2）种子液的制备：挑取在试管斜面培养基活化48h的枯草芽孢杆菌菌苔2环到10mL种子培养基，30℃、200rpm培养10h（OD600约为1.6），以体积百分比5%的接种量（即2.5ml菌液）转接到47.5mL种子培养基中，30℃、200rpm培养5h，4℃、5000rpm离心10min去上清，用等量生理盐水悬浮沉淀，即得种子液。种子培养基组成为：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，调节pH到8.0，121℃灭菌20min。
（3）中性蛋白酶发酵：将步骤（2）制备的种子液以体积百分比5%的接种量发酵培养基中，37℃、200rpm摇瓶（500mL摇瓶装50mL发酵培养基）好氧培养72h；发酵培养基：木薯渣80g/L，豆粕粉40g/L，麸皮20g/L，Na2HPO44g/L，KH2PO40.3g/L，加入0.5mol/L NaOH调节pH，使121℃灭菌30min后的起始pH为8.0左右。
（4）粗酶液分离及饲料添加剂的制备：取步骤（3）得到的发酵液在4℃、10000rpm下离心20min，收集上清液，即为中性蛋白酶粗酶液。分离残渣直接喷雾干燥即得饲料添加剂，枯草芽孢杆菌菌数为3.5×108个/g。
（5）中性蛋白酶的提取：将步骤（4）得到的中性蛋白酶粗酶液置于冰水浴中，边搅拌边加入适量的硫酸铵固体使达到40%饱和度，置于4℃下静置过夜，4℃、10000rpm离心30min，取上清液。在上清液补加硫酸铵至60%饱和度，置于4℃下静置过夜，4℃、10000rpm离心30min收集沉淀。沉淀真空冷冻干燥24h后，即得中性蛋白酶产品，酶活为12万U/g，中性蛋白酶活力回收率为59.3%，纯度为2818U/mg。酶活力、蛋白及菌数的测定方法见参考文献【陈鸿图，傅金磊，杨月明，梁颖婕，谢文化，朱明军，枯草芽孢杆菌产中性蛋白酶的特性及补料研究，食品与发酵工业，2012,38（3）：43-48）】。
该对比例说明发酵温度对枯草芽孢杆菌生长和产酶有很大的影响。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种利用木薯渣发酵生产中性蛋白酶和饲料添加剂的方法，其特征在于包含以下步骤：
（1）菌种的活化：将枯草芽孢杆菌接种到斜面培养基上，进行活化；斜面培养基组成为：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，琼脂20g/L，pH值为8.0；
（2）种子液的制备：将活化的枯草芽孢杆菌接种到种子培养基中，25～30℃、150～200rpm培养至OD600为1.4～1.6；再以体积百分比5%的接种量转接种子培养基中，25～30℃、150～200rpm培养5～10h；将菌液离心，取沉淀，用生理盐水悬浮沉淀，即得种子液；种子培养基组成为：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，pH值为8.0；
（3）中性蛋白酶发酵：中性蛋白酶发酵通过摇瓶好氧发酵或是发酵罐发酵进行：
①摇瓶好氧发酵：将步骤（2）制备的种子液以体积百分比5%的接种量接到发酵培养基中，25～30℃、150～200rpm摇瓶好氧培养至少36小时；
②发酵罐发酵：将步骤（2）制备的种子液以体积百分比5%的接种量接到发酵培养基中，控制转速200～1000rpm，通气量0.5～2.0vvm，使溶氧控制在30%，当pH值下降到6.5以下时，流加1mol/L盐酸控制pH在6.5，使用体积百分比为25%的泡敌进行泡沫控制，培养至少36小时；
发酵培养基：木薯渣10～80g/L，豆粕粉10～40g/L，麸皮10～40g/L，Na2HPO44g/L，KH2PO40.3g/L，pH为7.5～8.5；
（4）粗酶液分离及饲料添加剂的制备：将步骤（3）得到的发酵液离心，上清液为中性蛋白酶粗酶液；沉淀干燥后，得到饲料添加剂。
2.根据权利要求1所述的利用木薯渣发酵生产中性蛋白酶和饲料添加剂的方法，其特征在于还包含以下步骤：（5）中性蛋白酶的提取：将步骤（4）得到的中性蛋白酶粗酶液置于冰水浴中，边搅拌边加入硫酸铵，使达到40%饱和度，置于4℃下静置过夜，离心，取上清，在上清液补加硫酸铵至60%饱和度，置于4℃下静置过夜，离心，收集沉淀；将沉淀真空冷冻干燥，得到中性蛋白酶。
3.根据权利要求2所述的利用木薯渣发酵生产中性蛋白酶和饲料添加剂的方法，其特征在于：步骤（5）中所述的离心的条件为4℃、10000rpm离心30min。
4.根据权利要求1所述的利用木薯渣发酵生产中性蛋白酶和饲料添加剂的方法，其特征在于：步骤（1）中所述的枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌AS1.398。
5.根据权利要求1所述的利用木薯渣发酵生产中性蛋白酶和饲料添加剂的方法，其特征在于：步骤（2）中所述的离心的条件为4℃、5000rpm离心10min。
6.根据权利要求1所述的利用木薯渣发酵生产中性蛋白酶和饲料添加剂的方法，其特征在于：步骤（3）①中所述的摇瓶好氧培养的时间为36～72h。
7.根据权利要求1所述的利用木薯渣发酵生产中性蛋白酶和饲料添加剂的方法，其特征在于：步骤（3）②中所述的培养的时间为36～60h。
8.根据权利要求1所述的利用木薯渣发酵生产中性蛋白酶和饲料添加剂的方法，其特征在于：步骤（4）中所述的离心的条件为4℃、10000rpm下离心20min。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2012105494051A CN103013961A (zh) | 2012-12-17 | 2012-12-17 | 利用木薯渣发酵生产中性蛋白酶和饲料添加剂的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2012105494051A CN103013961A (zh) | 2012-12-17 | 2012-12-17 | 利用木薯渣发酵生产中性蛋白酶和饲料添加剂的方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103013961A true CN103013961A (zh) | 2013-04-03 |
Family
ID=47963076
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN2012105494051A Pending CN103013961A (zh) | 2012-12-17 | 2012-12-17 | 利用木薯渣发酵生产中性蛋白酶和饲料添加剂的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103013961A (zh) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103865907A (zh) * | 2013-12-13 | 2014-06-18 | 湖南鸿鹰生物科技有限公司 | 一种强热稳定性的中性蛋白酶 |
| CN103865701A (zh) * | 2013-12-13 | 2014-06-18 | 湖南鸿鹰生物科技有限公司 | 一种含中性蛋白酶的啤酒复合酶 |
| CN103918874A (zh) * | 2014-04-11 | 2014-07-16 | 四川农业大学 | 一种利用混菌发酵技术改善木薯渣品质的方法 |
| CN104560783A (zh) * | 2014-12-05 | 2015-04-29 | 广西大学 | 一种枯草芽孢杆菌富集培养基及其使用 |
| CN113846125A (zh) * | 2021-09-06 | 2021-12-28 | 云南省烟草农业科学研究院 | 枯草芽孢杆菌、红发夫酵母和根霉混合烟草发酵方法 |
| CN115316549A (zh) * | 2022-08-25 | 2022-11-11 | 李雄 | 一种提高公鸡繁殖能力的饲料添加剂及其制备方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102210386A (zh) * | 2011-04-28 | 2011-10-12 | 陈跃辉 | 一种木薯渣猪用生物饲料添加剂及其制备方法 |
| CN102599344A (zh) * | 2012-04-18 | 2012-07-25 | 重庆市中药研究院 | 一种木薯渣发酵饲料及其制备方法 |
| CN102696875A (zh) * | 2012-06-26 | 2012-10-03 | 广西九通王环保生物工程有限公司 | 以木薯渣为原料制备生物饲料的方法 |
-
2012
- 2012-12-17 CN CN2012105494051A patent/CN103013961A/zh active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102210386A (zh) * | 2011-04-28 | 2011-10-12 | 陈跃辉 | 一种木薯渣猪用生物饲料添加剂及其制备方法 |
| CN102599344A (zh) * | 2012-04-18 | 2012-07-25 | 重庆市中药研究院 | 一种木薯渣发酵饲料及其制备方法 |
| CN102696875A (zh) * | 2012-06-26 | 2012-10-03 | 广西九通王环保生物工程有限公司 | 以木薯渣为原料制备生物饲料的方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 朱明军等: "枯草芽孢杆菌产中性蛋白酶的特性及补料研究", 《食品与发酵工业》 * |
| 邓靖等: "米曲霉M3中性蛋白酶的提取及酶学特性研究", 《中国食品添加剂》 * |
Cited By (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103865907A (zh) * | 2013-12-13 | 2014-06-18 | 湖南鸿鹰生物科技有限公司 | 一种强热稳定性的中性蛋白酶 |
| CN103865701A (zh) * | 2013-12-13 | 2014-06-18 | 湖南鸿鹰生物科技有限公司 | 一种含中性蛋白酶的啤酒复合酶 |
| CN103865907B (zh) * | 2013-12-13 | 2016-01-20 | 湖南鸿鹰生物科技有限公司 | 一种强热稳定性的中性蛋白酶 |
| CN103865701B (zh) * | 2013-12-13 | 2016-04-06 | 湖南鸿鹰生物科技有限公司 | 一种含中性蛋白酶的啤酒复合酶 |
| CN103918874A (zh) * | 2014-04-11 | 2014-07-16 | 四川农业大学 | 一种利用混菌发酵技术改善木薯渣品质的方法 |
| CN103918874B (zh) * | 2014-04-11 | 2015-10-21 | 四川农业大学 | 一种利用混菌发酵技术改善木薯渣品质的方法 |
| CN104560783A (zh) * | 2014-12-05 | 2015-04-29 | 广西大学 | 一种枯草芽孢杆菌富集培养基及其使用 |
| CN113846125A (zh) * | 2021-09-06 | 2021-12-28 | 云南省烟草农业科学研究院 | 枯草芽孢杆菌、红发夫酵母和根霉混合烟草发酵方法 |
| CN113846125B (zh) * | 2021-09-06 | 2024-01-30 | 云南省烟草农业科学研究院 | 枯草芽孢杆菌、红发夫酵母和根霉混合烟草发酵方法 |
| CN115316549A (zh) * | 2022-08-25 | 2022-11-11 | 李雄 | 一种提高公鸡繁殖能力的饲料添加剂及其制备方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN103013961A (zh) | 利用木薯渣发酵生产中性蛋白酶和饲料添加剂的方法 | |
| CN102220269B (zh) | 一种丁酸梭菌及丁酸梭菌饲料添加剂的生产方法 | |
| CN102229920B (zh) | 一种提高里氏木霉纤维素酶液体深层发酵水平的方法 | |
| CN102424831B (zh) | 一种利用餐厨垃圾生产乳酸的方法 | |
| CN103409347B (zh) | 一种产碱性蛋白酶的菌株及其工业化液体发酵方法 | |
| CN106811438B (zh) | 一种秸秆降解酸化菌剂及其制备方法 | |
| CN102851239A (zh) | 一株壳聚糖酶生产菌株及应用该菌株生产壳寡糖的方法 | |
| CN103045566A (zh) | 一种利用底物诱导调控纤维素酶生产的方法 | |
| CN102154243B (zh) | 一种微生物混合发酵生产液体纤维素酶的方法 | |
| CN102899375A (zh) | 一种利用氧载体提高发酵液中杆菌肽效价的方法 | |
| CN103739315B (zh) | 一种绿色微生态复合肥的制备方法 | |
| CN104403953A (zh) | 一种饲料用酿酒酵母菌高密度发酵培养基配方及其应用 | |
| CN101933439A (zh) | 一种利用植物油提高桑黄液体培养菌丝量的方法 | |
| CN103739321B (zh) | 一种绿色微生态复合肥 | |
| CN103627739A (zh) | 利用蔗渣纤维素发酵生产l-乳酸的方法 | |
| CN105713851B (zh) | 一株拜氏梭菌及其应用 | |
| CN104673675A (zh) | 一种绿色微生态复合肥及其制备方法 | |
| CN108424896B (zh) | 一种混菌发酵玉米秸秆糠醛渣生产纤维素酶的方法 | |
| Chandra et al. | Optimization of extraction of β-endoglucanase from the fermented bran of Aspergillus niger | |
| CN102173879B (zh) | 利用纤维素酶发酵废菌丝体和沼渣生产生物钾肥的方法 | |
| CN112029681A (zh) | 一种酒糟腐熟专用液态复合菌剂的制备 | |
| CN103952447A (zh) | 一种利用厌氧条件下发酵生产丁二酸的方法 | |
| JP5352882B2 (ja) | クロストリジウム属微生物を利用したセルロース分解酵素の生産方法及びクロストリジウム属微生物の培養増殖方法。 | |
| CN104805029B (zh) | 一种微生态肥的制备方法 | |
| CN107541474B (zh) | 解淀粉芽孢杆菌的固态发酵物及其制备方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20130403 |