CN113846125B - 枯草芽孢杆菌、红发夫酵母和根霉混合烟草发酵方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种混合烟草发酵方法，该方法将枯草芽孢杆菌、红发夫酵母分别接种于LB琼脂培养基、YPD琼脂培养基上，分别在37℃培养24h、22℃培养5‑7天，得到枯草芽孢杆菌、红发夫酵母的单菌落；将单菌落分别接种到LB液体培养基、YPD液体培养基中，并分别于37℃培养20h、22℃培养28‑29h，得到枯草芽孢杆菌、红发夫酵母种子液并将其等体积混合得到混合菌液；之后对混合菌液离心并收集菌体洗涤；洗涤后的菌体进行重悬，得到菌悬液；往烟叶中加入菌悬液和根霉粉，在25℃下发酵7‑10天。本发明中枯草芽孢杆菌、红发夫酵母和根霉复配混合能够将烟叶中淀粉、蛋白质等对烟叶品质有负面影响的大分子降解为醇类、脂类、醛类及致香小分子物质，有效改善烟叶的品质。
Description
技术领域
本发明涉及一种枯草芽孢杆菌、红发夫酵母和根霉混合烟草发酵方法，属于微生物技术领域。
背景技术
烟叶发酵是烟叶经调制之后在自然或人工干预条件下进行的改善烟叶品质的重要方法。经过调制之后的烟叶感官品质虽有所提升，但刺激性较大、青杂气重、香气质单调、香气量不足，不能直接用来生产卷烟。而用微生物对烟叶进行发酵能显著改善上述缺陷，提高卷烟质量。同时为了满足加热不燃烧卷烟在低温下能够释放更多的香味物质，既能降低普通卷烟点燃燃烧带来的危害，又能满足消费者的抽吸感。微生物可以通过产生许多具有生物活性的酶来降解烟叶中的大分子物质，产生醇类、脂类、醛类及多种有机酸致香小分子物质，从而改善烟叶的感官品质。同时，微生物发酵还能降低烟叶中烟碱、烟草特有亚硝胺(TSNA)以及烟气中焦油等有害物质的含量，降低卷烟燃吸的危害。
发明内容
针对上述问题，本发明提出一种枯草芽孢杆菌、红发夫酵母和根霉混合烟草发酵方法，该方法包括如下步骤：
S1：将枯草芽孢杆菌接种于LB琼脂培养基上，在37℃培养24h；将红发夫酵母接种于YPD琼脂培养基上，在22℃培养5-7天，得到枯草芽孢杆菌、红发夫酵母的单菌落；
S2：将步骤S1中枯草芽孢杆菌、红发夫酵母的单菌落分别接种到LB液体培养基、YPD液体培养基中，并分别于37℃培养20h、22℃培养28-29h，分别得到枯草芽孢杆菌种子液与红发夫酵母种子液；
S3：将枯草芽孢杆菌种子液与红发夫酵母种子液等体积混合得到混合菌液；
S4：将步骤S3的混合菌液离心并收集菌体；
S5：对步骤S4收集的菌体进行洗涤；
S6：对步骤S5洗涤后的菌体进行重悬，得到菌悬液；
S7：往烟叶中加入步骤S6的菌悬液和根霉粉，在25℃下发酵7-10天。
进一步地，步骤S1中的LB琼脂培养基成分为胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠10g/L、琼脂20g/L；YPD琼脂培养基成分为葡萄糖20g/L、胰蛋白胨20g/L、酵母粉10g/L、琼脂20g/L。
进一步地，步骤S2中的LB液体培养基成分为胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠10g/L；所述YPD液体培养基成分为葡萄糖20g/L、胰蛋白胨20g/L、酵母粉10g/L。
进一步地，步骤S7中的烟叶在发酵前粉碎成粉末，过200目筛。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明烟叶发酵中的枯草芽孢杆菌能够产生高酶活力的蛋白酶，快速降解烟叶中的蛋白质，改善烟叶的感官品质；红发夫酵母首次应用于烟叶发酵中，能够产生多种香气物质，提高烟叶的香气质和香气量；同时枯草芽孢杆菌、红发夫酵母和根霉复配混合能够将烟叶中淀粉、蛋白质、纤维素等对烟叶品质有负面影响的大分子降解为醇类、脂类、醛类及多种有机酸致香小分子物质，改善烟叶的品质。
本发明设计的本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。本发明的目的和其他优点可通过在说明书、权利要求书以及附图中所指出的结构来实现和获得。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1示出了本发明实施例中的枯草芽孢杆菌、红发夫酵母、根霉混合发酵烟叶发酵后烟叶表面的形态变化，图1(a)为发酵前枯草芽孢杆菌、红发夫酵母、根霉混合发酵烟叶表面形态图，图1(b)为发酵后枯草芽孢杆菌、红发夫酵母、根霉混合发酵烟叶表面形态图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地说明，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1枯草芽孢杆菌、根霉与红发夫酵母混合发酵烟叶
(1)菌种活化：将枯草芽孢杆菌(DES-59)、红发夫酵母(Y119)分别接种于LB琼脂培养基、YPD琼脂培养基上进行平板划线活化，分别于37℃培养24h、22℃培养5-7天；
(2)制备种子液：将步骤(1)平板中枯草芽孢杆菌、红发夫酵母的单菌落接种到LB液体培养基、YPD液体培养基中，分别于37℃培养20h、22℃培养28-29h，OD600分别为1.6-1.8，1.8-2.0；
(3)制备混合菌液：将枯草芽孢杆菌种子液与红发夫酵母种子液等体积混合得到混合菌液；
(4)离心：将步骤(3)的混合菌液在转速10000rpm下离心5-10min，收集菌体；
(5)洗涤：往步骤(4)收集的菌体中加入去离子水进行洗涤，并重复步骤(4)两次；
(6)重悬：将步骤(5)洗涤后的菌体用去离子水重悬，得到菌悬液；
(7)烟叶发酵：往烟叶中加入0.4mL/g的菌悬液、0.02g的根霉粉，置于 25℃环境中发酵7-10天；烟叶在发酵前粉碎成粉末，过200目筛；
(8)烟叶薄片制备与评吸：将发酵后的烟叶用造纸稠浆法制备成烟叶薄片，并请评吸专家用MC烟具进行评吸，评吸结果如表1所示，经过评吸发现发酵后的烟叶香气香味、协调性、刺激性和口感方面分别提高了1.5、1.0、0.5和1.5 分；
(9)发酵前后扫描电镜分析：通过电镜扫描分析发酵前后烟叶表面的形态变化，如图1(a)所示为枯草芽孢杆菌、根霉与红发夫酵母混合发酵烟叶发酵前的烟叶形态，图1(b)所示为混合发酵烟叶发酵后的烟叶形态，对比可知：发酵前的烟叶表面结构紧密且有许多凹凸不平的不规则区域，而发酵后的烟叶表面结构较为疏松平整且出现了一些孔洞，这主要是由于这三种微生物可以产生多种活性酶，将烟叶中一些如淀粉、蛋白质等大分子分解，有利于烟草物质的释放。
表1枯草芽孢杆菌、红发夫酵母、根霉混合烟叶发酵前后评吸数据
本实施例的上述步骤中，步骤(1)中所述的LB琼脂培养基成分为胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠10g/L、琼脂20g/L；YPD琼脂培养基成分为葡萄糖20g/L、胰蛋白胨20g/L、酵母粉10g/L、琼脂20g/L。
步骤(2)中所述的LB液体培养基成分为胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠10g/L；YPD液体培养基成分为葡萄糖20g/L、胰蛋白胨20g/L、酵母粉 10g/L。
对比例1：枯草芽孢杆菌发酵烟叶
(1)菌种活化：将枯草芽孢杆菌接种于LB琼脂培养基上进行平板划线活化，于37℃培养24h；
(2)将步骤(1)平板中枯草芽孢杆菌的单菌落接种到LB液体培养基，于37℃培养20h，OD600(细菌细胞密度)为1.6-1.8；
(3)将步骤(2)的枯草芽孢杆菌种子液在转速10000rpm下离心5-10min，收集枯草芽孢杆菌；
(4)洗涤：往步骤(3)收集的菌体中加入去离子水进行洗涤，并重复步骤(3)两次；
(5)重悬：将步骤(4)洗涤后的菌体用去离子水重悬，得到菌悬液；
(6)烟叶发酵：往烟叶中加入0.4mL/g的菌悬液，置于25℃环境中发酵 7-10天。
(7)烟叶薄片制备与评吸：将发酵后的烟叶用造纸稠浆法制备成烟叶薄片，并请评吸专家用MC烟具进行评吸，评吸数据见表2。结果发现，经过评吸发现发酵后的烟叶香气香味方面增加了0.5分。
表2枯草芽孢杆菌烟叶发酵前后评吸数据
本实施例的上述步骤中，步骤(1)中所述的LB琼脂培养基成分为胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠10g/L、琼脂20g/L；步骤(2)中所述的LB液体培养基成分为胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠10g/L。
对比例2：根霉发酵烟叶
(1)根霉烟叶发酵：往烟叶中加入0.04g的根霉粉、0.4mL/g的去离子水，置于25℃环境中发酵7-10天。
(2)烟叶薄片制备与评吸：将发酵后的烟叶用造纸稠浆法制备成烟叶薄片，并请评吸专家用MC烟具进行评吸，评吸数据见表3。结果发现，经过评吸发现发酵后的烟叶协调性方面增加了0.5分。
表3根霉烟叶发酵前后评吸数据
对比例3：红发夫酵母发酵烟叶
(1)菌种活化：将红发夫酵母接种于YPD琼脂培养基上进行平板划线活化，于22℃培养5-7天；
(2)将步骤(1)平板中红发夫酵母的单菌落接种到YPD液体培养基，于 22℃培养28-29h，OD600为1.8-2.0；
(3)将步骤(2)的红发夫酵母种子液在10000rpm离心5-10min，收集红发夫酵母菌体；
(4)洗涤：往步骤(3)收集的红发夫酵母菌体中加入去离子水进行洗涤，并重复步骤(3)两次；
(5)重悬：将步骤(4)洗涤后的红发夫酵母菌体用去离子水重悬，得到菌悬液；
(6)烟叶发酵：往烟叶中加入0.4mL/g的菌悬液，置于25℃环境中发酵 7-10天。
(7)烟叶薄片制备与评吸：将发酵后的烟叶用造纸稠浆法制备成烟叶薄片，并请评吸专家用MC烟具进行评吸，评吸数据见表4。结果发现，经过评吸发现发酵后的烟叶香气香味分值增加了1.0分，同时协调性方面增加了0.5分。
表4红发夫酵母烟叶发酵前后评吸数据
本实施例的上述步骤中，步骤(1)中的YPD琼脂培养基成分为葡萄糖20 g/L、胰蛋白胨20g/L、酵母粉10g/L、琼脂20g/L；步骤(2)中的YPD液体培养基成分为葡萄糖20g/L、胰蛋白胨20g/L、酵母粉10g/L。
对比例4枯草芽孢杆菌与红发夫酵母混合发酵烟叶
(1)菌种活化：将枯草芽孢杆菌、红发夫酵母分别接种于LB琼脂培养基、 YPD琼脂培养基上进行平板划线活化，分别于37℃培养24h、22℃培养5-7天；
(2)制备种子液：将步骤(1)平板中枯草芽孢杆菌、红发夫酵母的单菌落接种到LB液体培养基、YPD液体培养基中，分别于37℃培养20h、22℃培养28-29h，OD600分别为1.6-1.8，1.8-2.0；
(3)制备混合菌液：将枯草芽孢杆菌种子液与红发夫酵母种子液等体积混合得到混合菌液；
(4)离心：将步骤(3)的混合菌液在10000rpm离心5-10min，收集菌体；
(5)洗涤：往步骤(4)收集的菌体中加入去离子水进行洗涤，并重复步骤(4)两次；
(6)重悬：将步骤(5)洗涤后的菌体用去离子水重悬，得到菌悬液；
(7)烟叶发酵：往烟叶中加入0.4mL/g的菌悬液，置于25℃环境中发酵 7-10天。
(8)烟叶薄片制备与评吸：将发酵后的烟叶用造纸稠浆法制备成烟叶薄片，并请评吸专家用MC烟具进行评吸，评吸数据见表5。经过评吸发现发酵后的烟叶香气香味、协调性、刺激性和口感方面分别提高了1.0、0.5、0.5和1.0分。
表5枯草芽孢杆菌与红发夫酵母混合烟叶发酵前后评吸数据
本实施例的上述步骤中，步骤(1)中所述的LB琼脂培养基成分为胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠10g/L、琼脂20g/L；YPD琼脂培养基成分为葡萄糖20g/L、胰蛋白胨20g/L、酵母粉10g/L、琼脂20g/L。
步骤(2)中所述的LB液体培养基成分为胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠10g/L；YPD液体培养基成分为葡萄糖20g/L、胰蛋白胨20g/L、酵母粉 10g/L。
本发明实施例中使用的根霉粉购买自安琪酵母股份有限公司市售的甜酒曲；使用的枯草芽孢杆菌已在专利文献(CN103013961A)中公开，使用的红发夫酵母已在专利文献(CN108013441B)中公开。
综上所述，本发明烟叶发酵中的枯草芽孢杆菌能够产生高酶活力的蛋白酶，快速降解烟叶中的蛋白质，改善烟叶的感官品质；红发夫酵母首次应用于烟叶发酵中，能够产生多种香气物质，提高烟叶的香气质和香气量；同时枯草芽孢杆菌，红发夫酵母和根霉复配混合能够将烟叶中淀粉、蛋白质、纤维素等对烟叶品质有负面影响的大分子降解为醇类、脂类、醛类及多种有机酸致香小分子物质，改善烟叶的品质。
尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (4)
1.一种枯草芽孢杆菌、红发夫酵母和根霉混合发酵烟草的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：将枯草芽孢杆菌接种于LB琼脂培养基上，在37℃培养24 h；将红发夫酵母接种于YPD琼脂培养基上，在22℃培养5-7天；得到枯草芽孢杆菌、红发夫酵母的单菌落；
S2：将步骤S1中枯草芽孢杆菌、红发夫酵母的单菌落分别接种到LB液体培养基、YPD液体培养基中，并分别于37℃培养20h、22 ℃培养28-29h，分别得到枯草芽孢杆菌种子液与红发夫酵母种子液；
S3：将枯草芽孢杆菌种子液与红发夫酵母种子液等体积混合得到混合菌液；
S4：将步骤S3的混合菌液离心并收集菌体；
S5：对步骤S4收集的菌体进行洗涤；
S6：对步骤S5洗涤后的菌体进行重悬，得到菌悬液；
S7：往烟叶中加入步骤S6的菌悬液和根霉粉，在25℃下发酵7-10天；
所述烟叶、菌悬液、根霉粉之间的比例为1g：0.4ml:0.02g；
所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌AS1.398，所述红发夫酵母为红发夫酵母ATCC74220，所述根霉粉为购买自安琪酵母股份有限公司市售的甜酒曲。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
步骤S1中所述的LB琼脂培养基成分为胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠10g/L、琼脂20g/L；YPD琼脂培养基成分为葡萄糖20g/L、胰蛋白胨20g/L、酵母粉10g/L、琼脂20g/L。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤S2中所述的LB液体培养基成分为胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠10g/L；所述YPD液体培养基成分为葡萄糖20g/L、胰蛋白胨20g/L、酵母粉10g/L。
4.根据权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于：步骤S7中所述的烟叶在发酵前粉碎成粉末，过200目筛。
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