CN109602070B - Smxp-58菌株在降低烟梗纤维素含量方面的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于卷烟原料生产加工技术领域，具体涉及一株特定的枯草芽孢杆菌SMXP‑58菌株在降解烟梗中纤维素方面的应用专利申请。应用时，将枯草芽孢杆菌SMXP‑58菌株制备成含有活菌的微生物菌剂，与烟梗混合后通过发酵处理，用于降解烟梗中的纤维素，进而降低烟梗中纤维素含量。本申请属于现有已知菌株的新用途开发。初步研究结果表明，枯草芽孢杆菌SMXP‑58不仅能够较好降低烟梗中果胶含量，还能在较短时间内较好降低烟梗中的纤维素含量，而且烟梗中纤维素的降解率可达30%以上，表现出较好地降低烟梗中纤维素含量的技术效果。本申请同时也对现有微生物菌株新用途开发都提供了较好借鉴和应用示范，具有较好的实用价值。
Description
技术领域
本发明属于卷烟原料生产加工技术领域，具体涉及一株特定的枯草芽孢杆菌SMXP-58菌株在降解烟梗中纤维素方面的应用专利申请。
背景技术
烟梗是烟叶之粗硬叶脉，在烟叶中约占25%，是制作在烟支中具有支撑作用的梗丝的主要原料。早期卷烟制备中，一般认为烟梗杂质较多，燃烧后可吸性较差，因而仅用于制备低档卷烟。但随着卷烟制备技术及健康意识的更新，现有卷烟制备中，一般认为适当含量梗丝的应用，不仅能提高烟丝的填充性，改善卷烟燃烧性，降低烟叶原料消耗，而且能有效降低卷烟焦油、烟碱、CO等有害物质的含量，其在叶组配方中的使用比例也呈逐渐增加的趋势。目前在卷烟产品中的使用比例已有普遍提高，甚至已成为卷烟配方中的重要组分之一。
成分分析表明，纤维素与半纤维素、木质素、果胶等物质是烟梗中的主要成分。烟支应用研究表明，纤维素含量的高低与烟梗应用品质密切相关，纤维素含量过高，会使烟梗在燃吸时产生较大刺激感，从而制约卷烟制品整体品质的提高；再次，大量的纤维素在超过600℃的温度下会热裂解生成稠环芳烃（PAH），进而影响烟支产品的吸食安全性。基于这些研究，为改善烟梗使用质量，提升卷烟原料品质，需要对烟梗中的纤维素含量进行适当降解和控制，以使其含量保持在合理范围。
现有技术中，一般认为烟叶的重要性要远高于烟梗的重要性，因此一般通过自然醇化或人工醇化技术对烟叶中纤维素、蛋白质、淀粉等物质含量进行调节控制以提高烟支产品质量。但由于烟梗与烟叶在具体物质结构、物质含量方面等方面存在一些明显差异，因而以往烟叶中降解技术能否用于烟梗中、以及具体应用后的技术效果如何，是存在一定不确定性的。例如，烟梗中纤维素含量明显高于烟叶中纤维素含量，而由于纤维素物质结构的稳定性，在利用烟叶中自然醇化技术来处理时烟梗时，其处理效果非常有限，自然醇化处理过程中烟梗中纤维素很难被降解。而随着梗丝应用的普遍推广，及对其重要性认识的逐步提升，研究和开发新的烟梗处理技术，对提高卷烟品质，增加企业经济效益具有广泛而现实的意义。
发明内容
在现有微生物菌株筛选基础上，发明人以前期筛选SMXP-58菌株为基础，发现将其用于烟草原料——烟梗后，同样具有较好地降低纤维素含量的效果，因而可以促进卷烟原料品质的提升。
本申请所采取的技术方案详述如下。
枯草芽孢杆菌SMXP-58菌株在降低烟梗纤维素含量方面的应用，应用时，将枯草芽孢杆菌SMXP-58菌株制备成含有活菌的微生物菌剂，与烟梗混合后通过发酵处理，用于降解烟梗中的纤维素，进而降低烟梗中纤维素含量。
进一步而言，将枯草芽孢杆菌SMXP-58菌株制备成活菌数为（9~10）×107个/mL的液态微生物菌剂，按烟梗（梗丝）1~3%的质量比例，均匀喷洒于梗丝表面，在35℃~39℃、湿度65~75%的条件下，发酵处理48~96h（优选处理工艺条件为：在37℃、湿度70%的条件下，发酵处理96 h）；然后将梗丝加热处理（例如80℃条件下保温10~20min）后使细菌及其产生的纤维素酶失活后即可；失活处理后梗丝即可按现有技术用于制备卷烟。
所述枯草芽孢杆菌SMXP-58菌株，属芽孢杆菌属（Bacillus），最初由2013年河南三门峡C2F烟叶中分离而来，其保藏名称为：枯草芽孢杆菌 SMXP-58，分类学名称为Bacillus subtilis SMXP-58，现保藏于武汉中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号为CCTCCNO：M 2016083，保藏地址为：武汉市武汉大学。
利用所述枯草芽孢杆菌SMXP-58菌株所制备的液态微生物菌剂，具体可通过如下步骤制备而成：
（1）活化菌种，将枯草芽孢杆菌SMXP-58菌株置于LB平板上，37℃条件下活化培养1~2d；
（2）制备种子液，刮取收集步骤（1）中活化培养后菌体，接种于液体LB培养基中，30℃、150 rpm条件于摇床培养过夜；
（3）扩大培养，将步骤（2）中种子液按1%的体积比转接液体LB培养基，30℃、150rpm条件于培养至OD600=2.0左右；
（4）制备菌剂，将步骤（3）中发酵液3600 rpm离心10min，弃上清夜，然后加入无菌水进行充分悬浮，调整活菌数至适当数量后，即为用于降解烟梗中纤维素的微生物菌剂。
就本申请所采用的枯草芽孢杆菌SMXP-58这一特定菌株而言，现有研究中发现，该菌株对烟梗中果胶具有较好的降解效果，同时与其他生物酶复合后可较好用于烟草薄片中果胶降解。但是关于该特定菌株在其他方面的用途，尚未见到较好报道。而由于微生物发酵过程中代谢产物的多样性，以及烟草物料（主要是烟叶和烟梗）成分调节的重要性，如果能够基于一种微生物菌株发挥多种成分调节作用，无论对于最终烟草产品的安全性、还是对于烟草物料的实际处理工艺都是具有重要影响的。
总体而言，本申请属于现有已知菌株的新用途开发。初步研究结果表明，枯草芽孢杆菌SMXP-58不仅能够较好降低烟梗中果胶含量，还能在较短时间内较好降低烟梗中的纤维素含量，而且烟梗中纤维素的降解率可达30%以上，表现出较好地降低烟梗中纤维素含量的技术效果。而结合本申请的新用途开发，在采用枯草芽孢杆菌SMXP-58降解处理烟梗物料时，只需通过部分工艺调整，即可同时实现降低果胶含量和降低纤维素含量的目的，无论对于确保最终烟支产品的安全性，还是对于简化生产加工处理工艺都具有较好的实用价值，同时也为新的微生物菌株筛选、或者对现有微生物菌株新用途开发都提供了较好借鉴和应用示范，因而具有较好的实用价值和推广应用意义。
具体实施方式
下面结合实施例对本申请做进一步解释说明，在介绍具体实施例前就下述实施例中涉及部分物料、实验设备等情况简要介绍如下。
烟草物料：所用烟梗为2015年河南复烤后长烟梗，由河南中烟有限责任公司提供；
微生物菌株：枯草芽孢杆菌SMXP-58菌株，属芽孢杆菌属（Bacillus），最初由2013年河南三门峡C2F烟叶中分离而来，其保藏名称为：枯草芽孢杆菌 SMXP-58，分类学名称为Bacillus subtilis SMXP-58，现保藏于武汉中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号为CCTCC NO：M 2016083，保藏地址为：武汉市武汉大学；该菌株属于一种可公开获得性菌株，发明人保藏有该菌株的原始备份材料。
实施例1
为将SMXP-58菌株用于降解烟梗中纤维素，需首先将该菌株制备成易于使用的菌剂，具体制备过程如下。
（1）活化菌种：将SMXP-58菌株置于LB平板上，37℃条件下于生化气候箱中活化培养1d；
（2）制备种子液：在超净工作台中刮取步骤（1）中所培养的菌体，接种于含有5mL液体LB培养基的18×180的试管中，30℃、150 rpm条件于摇床过夜培养；
（3）扩大培养：将步骤（2）中种子液按1 mL菌悬液/100 ml LB培养基（1%的体积比）转接于含100mL液体LB培养基的灭菌的250mL锥形瓶中，30℃、150 rpm条件于培养至OD600=2.0左右；
（4）制备菌剂：将步骤（3）中菌液3600 rpm离心10min，弃上清夜，然后加入无菌水充分悬浮，调整活菌数为9.6×107个/mL左右后，即为用于降解烟梗中纤维素的菌剂。
实施例2
利用实施例1中所制备菌剂处理烟梗时，具体步骤为：
在制丝线上取供试梗丝，梗丝样品参数为：平均厚度为0.16 mm，平均长度为3.5mm，然后均匀分成多份，每份100 g；
用喷雾器将实施例1所制备微生物菌剂均匀喷洒于梗丝表面，然后调整梗丝水分含量为25%。
为获得菌制剂的最佳作用条件，分别以菌制剂作用温度、湿度，以及时间为影响因素，进了3因素3水平正交试验设计（水平因素表（L9(3)3）），具体设计如下表1：
表1 正交试验因素水平L9(33)
注：A为作用温度；B为作用湿度；C为作用时间。
依据上述3因素水平设计，进行了三因素三水平正交实验设计（表2）：
表2正交试验设计L9(33)
注：A为作用温度；B为作用湿度；C为作用时间；同时，设置空白对照组（喷施等量蒸馏水作为对照）CK。
检测评价：
梗丝处理完成后，对其纤维素含量进行测定，并换算纤维素降解率，以确定最优菌制剂作用条件，并进一步将处理后梗丝按一定比例添加入配方烟丝中，评价其感官质量。
（一）纤维素含量的测定
梗丝处理完成后，采用流动分析法测定梗丝中纤维素含量，并换算降解率，并进一步进行极差分析。
具体计算结果如下表3：
表3 梗丝纤维素降解率的极差分析
注：A为作用温度；B为作用湿度；C为作用时间。
对上表分析可以看出：由于在一定范围内，梗丝纤维素降解率越高越好，而k 2 ＞k 1 ＞k 3 ，因此选择A2为因素A（A代表作用温度）的优水平，同理B、C（分别代表作用湿度、作用时间）的优水平分别为B1、C1，所以最优水平组合为A2B1C1，即作用温度为37℃，作用湿度为70%，作用时间为96 h。
由于最优化组合并不在9组正交处理方案中，因此对优化处理方案进行了验证实验，通过换算纤维素降解率发现，此处理下梗丝纤维素降解率达到最高，为33.7%。
综上所述，当菌剂在作用温度为37℃，作用湿度为70%，作用时间为96 h的条件下处理梗丝时，纤维素降解率可达33.7%。
（二）感官质量评价
按照15%的比例将菌制剂处理（最优条件处理）后的梗丝添加入配方烟丝中，经恒温恒湿箱平衡后，由专业评委对香气质（A）、香气量（B）、浓度（C）、柔细度（D）、余味（E）、杂气（F）、刺激度（G）等指标进行评定，每项指标均按9分制打分，感官评吸总分为各分项得分总和。评价结果如表4：
表4 感官评价结果
从表4中数据可以看出，按照15%的比例将菌制剂处理完成后的梗丝添加入配方烟丝中，与对照样品相比，处理后香气量、香气质有所提升，柔细度、杂气、刺激明显改善，总得分提高1.06分，整体感官质量提升较为明显。
总体而言，本申请中筛选获得的SMXP-58菌株，其来源于烟草原料中原有菌株，当利用其所制备菌剂处理烟梗时，在确保对于烟梗中纤维素降解同时，不具有明显的副作用，可较为有效的促进烟草中大分子物质降解形成各类有利于提高烟草品质的小分子物质，进而达到降低卷烟烟气中的有害成分，改善烟梗的内在品质的目的。
Claims (5)
1.枯草芽孢杆菌SMXP-58菌株在降低烟梗纤维素含量方面的应用，其特征在于，应用时，将枯草芽孢杆菌SMXP-58菌株制备成含有活菌的微生物菌剂，与烟梗混合后通过发酵处理，用于降解烟梗中的纤维素，进而降低烟梗中纤维素含量；
所述含有活菌的微生物菌剂，其中活菌数为（9~10）×107个/mL；应用时，将微生物菌剂按烟梗1~3%的质量比例应用。
2.如权利要求1所述枯草芽孢杆菌SMXP-58菌株在降低烟梗纤维素含量方面的应用，其特征在于，所述发酵处理为：在35℃~39℃、湿度65~75%的条件下，发酵处理48~96h。
3.如权利要求2所述枯草芽孢杆菌SMXP-58菌株在降低烟梗纤维素含量方面的应用，其特征在于，所述发酵处理为：在37℃、湿度70%的条件下，发酵处理96h。
4.如权利要求1所述枯草芽孢杆菌SMXP-58菌株在降低烟梗纤维素含量方面的应用，其特征在于，所述含有活菌的微生物菌剂，具体可通过如下步骤制备而成：
（1）活化菌种，将枯草芽孢杆菌SMXP-58菌株置于LB平板上，37℃条件下活化培养1~2d；
（2）制备种子液，刮取收集步骤（1）中活化培养后菌体，接种于液体LB培养基中，30℃、150 rpm条件于摇床培养过夜；
（3）扩大培养，将步骤（2）中种子液按1%的体积比转接液体LB培养基，30℃、150 rpm条件于培养至OD600=2.0；
（4）制备菌剂，将步骤（3）中发酵液3600 rpm离心10min，弃上清夜，然后加入无菌水进行充分悬浮，调整活菌数至适当数量后，即为用于降解烟梗中纤维素的微生物菌剂。
5.如权利要求1~4任一项所述枯草芽孢杆菌SMXP-58菌株在降低烟梗纤维素含量方面的应用，其特征在于，所述烟梗，为制丝线上以复烤后长烟梗为原料加工后梗丝，梗丝规格参数为：平均厚度为0.16 mm，平均长度为3.5 mm。
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