CN107475154B

CN107475154B - 用于降解烟叶中蛋白质的smxp-03菌株及其应用

Info

Publication number: CN107475154B
Application number: CN201710817212.2A
Authority: CN
Inventors: 杨宗灿; 刘向真; 冯颖杰; 许衡; 杨永锋; 彭玉富; 李家美; 张耀广
Original assignee: China Tobacco Henan Industrial Co Ltd
Current assignee: China Tobacco Henan Industrial Co Ltd
Priority date: 2017-09-12
Filing date: 2017-09-12
Publication date: 2020-06-23
Anticipated expiration: 2037-09-12
Also published as: CN107475154A

Abstract

本发明属于烟草微生物发酵技术领域，具体涉及一株用于降解烟叶中蛋白质的短小芽孢杆菌SMXP‑03菌株及其在烟叶发酵中的应用。该菌株为短小芽孢杆菌 SMXP‑03，现保藏于武汉中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2017291。本发明通过特定菌株的筛选，设计了较为简便的菌剂处理烟叶的技术方案，使得本发明具有：工艺流程较为简便，烟叶处理成本较低，且处理周期较短，可明显降低烟叶中的蛋白质含量等技术优点，因而在卷烟制造技术领域具有较好地推广应用价值。

Description

用于降解烟叶中蛋白质的SMXP-03菌株及其应用

技术领域

本发明属于烟草微生物发酵技术领域，具体涉及一株用于降解烟叶中蛋白质的短小芽孢杆菌SMXP-03菌株及其在烟叶发酵方面的应用。

背景技术

烟草是我国的重要经济作物之一，在国民经济中占有重要的地位。而烟叶是烟草行业发展的基础，持续提高烟叶质量水平是烟叶生产的重要目标之一，“提高质量、优化结构”一直以来也都是烟叶工作的重点。

蛋白质是烟叶中的重要化学成分，其含量的高低与烟草品质密切相关。蛋白质含量过高对于烟草制品的抽吸品质是不利的，在燃吸时会产生如同燃烧羽毛的臭味，同时还会产生辛辣、苦涩的感觉。因此，利用合适的方法将烟叶中的蛋白质降解成氨基酸等小分子物质，从而进一步参与美拉德反应产生致香物质及致香前体物，是提高烟叶品质的有效途径之一。

目前，国内烤烟蛋白含量普遍偏高，纯粹依赖烟草自身酶类的水解作用远不能满足卷烟工业对高品质烟叶原料的需求。因此，如何利用外源微生物制剂或者酶制剂，快速高效的降低烟叶中蛋白质含量，从而提高烟叶品质，已成为科技工作者普遍关注的热点课题。

发明内容

本发明目的在于提供了一株能够高效降解烟叶中蛋白质物质的短小芽孢杆菌SMXP-03菌株，从而能够有效促进烟叶中大分子蛋白质的降解，提高烟叶整体品质。

本申请所采取的详细技术方案如下。

一株用于降解烟叶中蛋白质的SMXP-03菌株，该菌株属于短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus），最初是由2013年三门峡产的复烤烟叶中分离而来，其保藏名称为：短小芽孢杆菌SMXP-03，分类学名称为Bacillus pumilus SMXP-03，已于2017年6月12日保藏于武汉中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号为CCTCC NO：M 2017291。

利用所述用于降解烟叶中蛋白质的SMXP-03菌株所制备的菌剂，通过如下步骤制备而成：

（1）活化菌种，将SMXP-03菌株置于NA固体培养基上，37℃条件下培养24 h~72 h；

（2）制备种子液，刮取步骤（1）中所培养的菌体，接种于液体NA培养基中，30℃摇床培养；

（3）扩大培养，将步骤（2）中种子液转接液体NA培养基，培养至OD₆₀₀=1.8~2.0；

（4）制备菌剂，将步骤（3）中发酵液离心，弃上清，然后加入无菌水进行悬浮，调整活菌数为（9~10）×10⁷个/mL。即为用于降解烟叶中蛋白质的菌剂。

制备过程中，培养基组分单位以g/L计，所述NA固体培养基组成为：胰蛋白胨10 ，牛肉膏3，NaCl 5，琼脂粉 12，pH=7.0左右；所述NA液体培养基组成为：胰蛋白胨10，牛肉膏3，NaCl 5，pH=7.0左右。

所述利用SMXP-03菌株所制备的菌剂在降解烟叶蛋白质中的应用，按烟叶质量的1~3%比例，将制备好的菌剂制均匀喷洒于烟叶表面，35~40℃、50~80%湿度条件下，发酵处理60~90h（优选处理条件为：35℃、75%湿度条件下，处理60h），发酵完成后，再将烟叶加热处理（70~100℃加热处理10~30min，优选80℃加热处理20min），使细菌及其产生的蛋白质酶失活。

一种降低烟叶中蛋白质含量的方法，包括如下步骤：

（1）制备处理菌剂，具体而言，以短小芽孢杆菌 SMXP-03发酵培养，制备成活菌数为（9~10）×10⁷个/mL的水剂；

（2）将步骤（1）中所制备处理菌剂均匀喷施于待处理烟叶表面，35~40℃、50~80%湿度条件下，发酵处理60 h ~90 h，发酵完成后，再将烟叶加热处理使细菌及其产生的蛋白酶失活。

本发明中以烟叶中含量较高的蛋白质为作用目标，通过特定菌株筛选，以及特定剂量使用，在较短时间内较好地降低了烟叶中的蛋白质含量。初步测定结果表明，烟叶中蛋白质的降解率可达50%以上，表现出较好地降低烟叶中蛋白质含量的技术效果。

总体而言，本发明通过特定菌株的筛选，设计了较为简便的菌剂处理烟叶的技术方案，使得本发明具有：工艺流程较为简便，烟叶处理成本较低，且处理周期较短，可明显降低烟叶中的蛋白质含量并改善烟叶品质等技术优点，因而在卷烟制造技术领域具有较好地推广应用价值。

附图说明

图1为SMXP-03菌株在油镜下的形态图；

图2为基于SMXP-03菌株 16S rDNA基因序列构建的系统发育进化树。

具体实施方式

下面结合实施例对本申请做进一步解释说明，在介绍具体实施例前就下述实施例中涉及部分物料、实验设备等情况简要介绍如下。

烟草物料：烟草醇化评吸时所采用烟草原料为2015年河南平顶山产复烤烟叶，由河南中烟有限责任公司提供。

实施例1

本实施例仅就SMXP-03菌株的筛选及鉴定过程简要介绍如下。

SMXP-03菌株，最初是由2013年三门峡产的复烤烟叶中分离获得。其菌落在NA培养平板上圆形或不规则，呈乳白色，没有光泽，菌落表面平整或出现不规则褶皱凸起，表面粗糙不光滑，菌落不透明。油镜下形态如图1所示，可观察到细菌分布均匀，为杆状，很少呈链状，大小为(0.7~0.9)×(1.6 ~2)μm。

采用16S rDNA基因片段为通用引物，对该菌株进行PCR以及克隆测序，可获得1416bp序列，进行系统进化分析，显示菌株SMXP-03与短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）的同源性高达99%，即，与短小芽孢杆菌的亲缘关系最近（如图2所示）。

进一步对菌株进行生理生化分析，结果如表1所示。

表1 SMXP-03的部分生理生化特性：

最终，鉴定认为SMXP-03菌株属芽孢杆菌属（Bacillus），其分类学名称为Bacillus pumilus SMXP-03，于2017年5月31日提交武汉中国典型培养物保藏中心（CCTCC）保藏（地址：武汉大学），2017年6月12日保藏鉴定为存活，其保藏编号为CCTCC NO：M 2017291。

实施例2

为将实施例1中筛选所得SMXP-03菌株用于降解烟叶中蛋白质，需首先将该菌株制备成易于使用的菌剂，具体制备过程如下。

（1）活化菌种：将SMXP-03菌株置于NA平板上，37℃条件下于生化气候箱中培养1~2d；

（2）制备种子液：在超净工作台中刮取步骤（1）中所培养的菌体，接种于含有5mL液体NA培养基的18×180的试管中，30℃、150 rpm条件于摇床过夜培养；

（3）扩大培养：将步骤（2）中种子液按1 mL菌悬液/100 ml NA培养基（1%的体积比）转接于含100mL液体NA培养基的灭菌的250mL锥形瓶中，30℃、150 rpm条件于培养至OD₆₀₀=2.0左右；

（4）制备菌剂：将步骤（3）中菌液3600 rpm离心10min，弃上清夜，然后加入无菌水充分悬浮，调整活菌数为9.6×10⁷个/mL左右后，即为用于降解烟叶中蛋白质的菌剂。

实施例3

利用实施例2中所制备菌剂处理烟叶时，具体步骤为：

处理烟叶时，按照2%的烟叶质量比，用喷雾器将上述菌剂均匀喷洒于烟叶表面，然后调整烟叶水分含量为25%；置于特定温湿度条件下发酵一定时间后，80℃处理20min，使细菌及其产生的蛋白质酶失活。

为确定菌剂的最佳作用温湿度条件及时间，发明人进行了正交实验设计，相关实验过程简要介绍如下。

烟叶样品：取抽取烟梗后的烟叶，分割成片状，然后均匀分成多份，每份100 g。

发酵时间、发酵温度、发酵湿度：分别以发酵时间、发酵温度、发酵湿度为影响因素，进了3因素水平设计，具体设计如下：

表2 因素水平表L₉（3³）

注：A为发酵时间；B为发酵温度；C为发酵湿度；

依据表2，进行了三因素三水平正交实验设计：

表3 正交设计表

同时设置空白对照CK。

烟叶处理完成后，对烟叶中的蛋白质含量采用考马斯亮蓝-G250法进行测定。根据蛋白质与考马斯亮蓝G-250的结合物在波长595nm处有最大吸收值，且吸收值与蛋白质含量成正比的原理可得：

蛋白质含量（mg/g）=（m×VT×n）/（M×VS×1000）

式中：m为根据样标准曲线查得蛋白质含量（μg）；VT为提取液总体积（mL）；n为稀释倍数；M为样品质量；VS为测定时加样量（mL）。

实施例4

根据实施例3中的烟叶蛋白质含量测定结果，进一步进行极差分析，结果如表4：

表4 极差分析表

结论：由于在一定范围内，烟叶蛋白质含量越低越好，而k₁＜k₃＜k₂，因此选择A₃为因素A（A代表时间）的优水平，同理B、C（分别代表温度、湿度）的优水平分别为B₁、C₃，所以最优水平组合为A₃B₁C₃，即时间为60 h、温度为35℃、湿度为75%；比较R值可知RB>RC>RA，即温度对整个作用条件的影响最大，其次是湿度，而时间的影响最小。

由于最优化组合并不在9组正交处理方案中，因此对优化处理方案进行了验证实验，结果如下表5：

表5 验证分析表

综上所述，当菌剂在时间为60 h、温度为35℃、湿度为75%条件下（此时，菌体数量为9.6×10⁷）施用于烟叶时，烟叶中的蛋白质降解率可达28.74%。因而本发明在降低烟叶中蛋白质含量，从而提升烟叶品质方面具有较好地应用前景。

总体而言，本申请中筛选获得的SMXP-03菌株，其来源于烟叶中原有菌株，当利用其所制备菌剂处理烟叶时，在确保对于烟叶中蛋白质降解同时，不具有明显的副作用，可较为有效的促进烟草中大分子物质降解形成各类有利于提高烟草品质的小分子物质，进而达到降低卷烟烟气中的有害成分，改善烟叶的内在品质的目的。

Claims

1.一株用于降解烟叶中蛋白质的SMXP-03菌株，其特征在于，该菌株属芽孢杆菌属Bacillus，保藏名称为：短小芽孢杆菌 SMXP-03，分类学名称为Bacillus subtilis SMXP-03，已于2017年6月12日保藏于武汉中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2017291。

2.利用权利要求1所述用于降解烟叶中蛋白质的SMXP-03菌株所制备的菌剂，其特征在于，通过如下步骤制备而成：

（1）活化菌种，将SMXP-03菌株置于NA固体培养基上，活化培养；

（3）扩大培养，将步骤（2）中种子液转接NA液体培养基，培养至OD₆₀₀=1.8~2.0；

（4）制备菌剂，将步骤（3）中扩大培养产物离心，弃上清，然后加入无菌水进行悬浮，调整活菌数为（9~10）×10⁷个/mL。

3.如权利要求2所述利用SMXP-03菌株所制备的菌剂，其特征在于，以g/L计，

所述NA固体培养基组成为：胰蛋白胨10，牛肉膏3，NaCl 5，琼脂粉 12；

所述NA液体培养基组成为：胰蛋白胨10，牛肉膏3，NaCl 5。

4.权利要求2或3所述利用SMXP-03菌株所制备的菌剂在烟叶中的应用，其特征在于，用于降解烟叶中蛋白质。

5.如权利要求4所述利用SMXP-03菌株所制备的菌剂在烟叶中的应用，其特征在于，按烟叶质量的1~3%比例，将制备好的菌剂均匀喷洒于烟叶表面，在温度35℃~40℃、50%~80%湿度条件下，发酵处理60 h ~90 h，发酵完成后，再将烟叶加热处理使细菌及其产生的蛋白质酶失活即可。

6.如权利要求5所述利用SMXP-03菌株所制备的菌剂在烟叶中的应用，其特征在于，将制备好的菌剂均匀喷洒于烟叶表面后，35℃、75%湿度条件下，处理60h。