CN113755384B - 一株不动杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物工程领域，涉及一种菌株，具体涉及一株不动杆菌及其应用。所述不动杆菌菌株已于2021年04月09日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为NO：22157。该菌可作为发酵菌株在复烤后烟叶发酵中发挥作用。本申请的不动杆菌发酵复烤后的低等级烟叶，可增加烟叶中的糠醛、4‑环戊烯‑1，3‑二酮、苯甲醛、苯甲醇、苯乙醛、2‑乙酰基吡咯、芳樟醇、苯乙醇、4‑氧代异佛尔酮、α‑大马酮、β‑大马酮、茄酮、二氢大马酮等香味物质含量，提高了烟叶的香气质和香气量、降低刺激性，能明显改善卷烟的吸食品质。

Description

一株不动杆菌及其应用

技术领域

本发明属于生物工程领域，涉及一种菌株，具体涉及一株不动杆菌及其应用。

背景技术

烟草工业企业目前普遍存在大量低等级烟叶，在生产中无法进入卷烟中高档产品。所谓低等级烟叶，是指由于烟叶存在的品质缺陷无法达到中高档烟叶使用标准的一类烟叶。造成低等级烟叶库存产生的主要原因是由于烟叶的农业生产供给和卷烟工业生产的需求之间的结构性矛盾。长期以来，低等级烟叶的使用出路是低档烟的生产利用，由于近年来卷烟消费结构的不断提高，加之卷烟企业竞争的不断加剧，利用低等级烟叶作为低档烟生产的出路已无法解决该问题。因此，如何开发相关的处理技术已经成为行业迫切需要解决的重大问题。

众所周知，烟叶本身作为一种生命载体，存在大量的微生物菌群，这些微生物在烟草从农田到卷烟的整个加工生产链条中，可以通过不同的外部条件变化发挥其作用。随着生物技术的不断发展，作为重要途径和工具的生物技术在烟草处理中的作用已经展现了良好应用前景，成为烟草工业生物技术重要的研究开发的重要内容。相关研究和应用表明，利用烟草源微生物对烟叶处理能够达到改善烟叶品质的作用效果。

专利CN101818123B公开一种不动杆菌，其能够用来降低烟草中尼古丁含量，以降低对环境的污染，然而其并未能够提高提升烟叶中香味物质含量，从而最终无法改善其评吸结果。

发明内容

本发明为提高烟叶香味品质，提供了一株不动杆菌(Acinetobacter sp.)及其应用。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

一株有效提高烟叶香味品质的不动杆菌，该不动杆菌的分类学命名为Acinetobacter sp.，所述不动杆菌菌株已于2021年04月09日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC NO.22157；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，电话：010-64807355。

在一些实施例中，前述不动杆菌的16S rDNA的核苷酸序列具有如SEQ ID NO.1所示的序列。

本发明进一步提供前述所述的不动杆菌的培养方法，该培养方法包括如下步骤：将权利要求1或2所述的不动杆菌按体积比1％～5％的接种量，接种到培养基中，温度28～35℃，转速100～150rpm，培养8～12h即可；在一些具体的实施例中，所述的培养基为LB液体培养基，具体的配方为酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L。

本发明再进一步提供前述不动杆菌在在发酵复烤后的低等级烟叶中的应用；在一些实施方式中，该应用包括如下步骤：将菌株进行培养获得发酵液，将发酵液喷洒在烟叶上进行发酵。

通过该不动杆菌对复烤后的低等级烟叶进行发酵后，能够显著提高香气质和香气量、降低刺激性，能明显改善发酵复烤后的烟叶的吸食品质。

在一些具体实施例中，该应用包括如下实施步骤：培养基的配方：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L；

1)菌株活化：将不动杆菌活化培养，得到不动杆菌活化液；菌株活化条件为：28～35℃、100～150r/min条件下震荡培养8～12h；

2)发酵液培养：将步骤2)中所得的活化菌液按体积比1％～5％接种到上述步骤1)中的培养基中形成发酵液，接种后的发酵培养条件同活化培养条件，培养至OD₆₀₀值为0.8～1；

3)将步骤3)中所得的发酵液在4℃、10000rpm/min条件下进行高速离心10min，进行复溶，按照处理菌量为0.22×10⁷～1.32×10⁷cfu/g将悬浮液均匀喷洒至烟叶上，保持喷洒后烟叶水分为22～26％。

4)将步骤4)中处理好的烟叶在温度为30～37℃，相对湿度为60％～80％的恒温恒湿箱中发酵16～30h。

在另一些实施方式中，将前述发酵好的烟叶打碎成粉末，并过40目筛；进一步将过筛后的烟叶粉末进行蒸馏萃取；再进一步地，利用GC-MS检测烟末中的中性香味成分后发现，糠醛、4-环戊烯-1，3-二酮、苯甲醛、苯甲醇、苯乙醛、2-乙酰基吡咯、芳樟醇、苯乙醇、4-氧代异佛尔酮、α-大马酮、β-大马酮、茄酮、二氢大马酮等的含量都有所提高。

糠醛具有甜，面包香味，苯甲醛具有樱桃香，杏仁香味，苯乙醛苯甲醛具有强烈的花香味，它们均可以显著改善卷烟香味；大马酮类化合物具有类似玫瑰的清甜香气可以赋予烟气清甜感，有新鲜萝卜样香味；茄酮能醇和、丰满烟气；二氢大马酮可以显著增加卷烟的清甜香、花草香气；4-环戊烯-1，3-二酮是重要的香味物质，4-氧代异佛尔酮具有甜，紫罗兰酮味，均有明显的致香作用；芳樟醇具有似鲜花气及香柠檬和薰衣草的香气，2-乙酰基吡咯、苯甲醇和苯乙醇可以增加烟气的花香香味。

本发明的有益效果在于：

(1)该不动杆菌可以在16～30h内对复烤后烟叶完成发酵，并且对其香味品质的改善明显。说明该菌可用于烟叶的发酵；发明人对烟叶中是否添加不动杆菌带来的效果进行了产品检测，选取了11个品烟人员进行品鉴，总结品烟人的品鉴评价如下表：

对照	香气量和香气质不足，刺激性较大，甜感不明显，余味差
		处理	香气质提升，香气量增加，刺激性降低，清甜感提升，余味变好

(2)在烟叶的陈化期间，本发明提供的不动杆菌可增加发酵复烤后的烟叶的香味物质，从而增加烟叶香味。

附图说明

图1为不动杆菌的平板图；

图2为不动杆菌的电镜图；

图3为不动肠杆菌的生长曲线；

图4空白烟叶总离子流图；

图5不动杆菌处理后烟叶的总离子流图。

具体实施方式

实施例1

本实施方式提供一株有效提高烟叶香味品质的不动杆菌，该不动杆菌的分类学命名为Acinetobacter sp.，所述不动杆菌菌株已于2021年04月09日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC NO.22157；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，电话：010-64807355。

所述的不动杆菌的16S rDNA的核苷酸序列具有如SEQ ID NO.1所示的序列。

所述不动杆菌菌株为革兰氏阴性菌，如图1与图2所示，菌株大小为(0.9～1.6)μm×(1.5～2.5)μm呈细杆状，无鞭毛，在平板上为白色圆斑状。

该不动杆菌的培养方法包括如下步骤，将不动杆菌按体积比1％～5％的接种量，接种到培养基中，温度28～35℃，转速100～150rpm，培养8～12h即可。

所述培养基的配方为：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L。

一株不动杆菌处理发酵复烤后的烟叶的应用。

本发明针对发酵复烤后的烟叶，提供一种不动杆菌作为产香菌发酵复烤后的烟叶的应用，发酵后提高香气质和香气量、降低刺激，能改善发酵复烤后的烟叶的香味品质。

一种不动杆菌对发酵复烤后的烟叶处理的方法，包括以下步骤：

1)培养基的配方：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L；

2)菌株活化：将不动杆菌7S-2活化培养，得到不动杆菌活化液；菌株活化条件为：28～35℃、100～150r/min条件下震荡培养8～12h；

3)发酵：将步骤2)中所得的活化菌液按体积比1％～5％接种到上述步骤1)中的培养基中形成发酵液，接种后的发酵培养条件同活化培养条件，培养至OD₆₀₀值为0.8～1；

4)将步骤3)中所得的发酵液在4℃、10000rpm/min条件下进行高速离心10min，进行复溶，按照处理菌量为0.22×107～1.32×107cfu/g将悬浮液均匀喷洒至烟叶上，保持喷洒后烟叶水分为22～26％。

5)将步骤4)中处理好的烟叶在温度为30～37℃，相对湿度为60％～80％的恒温恒湿箱中发酵16～30h。

6)将步骤5)中发酵好的烟叶打碎成粉末，并过40目筛。

7)将步骤6)过好筛的烟叶粉末进行同时蒸馏。

8)利用GC-MS检测发酵液中的香气成分后发现，糠醛、4-环戊烯-1，3-二酮、苯甲醛、苯甲醇、苯乙醛、2-乙酰基吡咯、芳樟醇、苯乙醇、4-氧代异佛尔酮、α-大马酮、β-大马酮、茄酮、二氢大马酮等的含量均有所提高。

为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例2

一、实验准备

液体LB培养基的公开配方：

酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L。

种子液的制备：

将保存在斜面中的不动杆菌(Acinetobacter sp.)接种到30mL的LB培养基中，培养12h后备用。

二、微生物处理

将不动杆菌(Acinetobacter sp.)菌株接种到液体LB培养基中，在28～35℃、100～150r/min的摇床上培养过夜；

将培养好的菌液于4℃、10000r/min下离心10min，弃去上清，用等量的无菌水进行复溶，再次在离心机中进行离心，弃去上清，用两倍的无菌水进行复溶。将复溶好的菌悬液摇匀，按照处理菌量为0.22×10⁷～1.32×10⁷cfu/g将悬浮液均匀喷洒于浙江中烟工业有限责任公司低等级烟叶(YN0117BEJ)表面，保持处理水分为22～26％；置于温度为30～37℃，相对湿度为60％～80％的恒温恒湿箱中发酵16～30h。，获得处理烟叶样品；用同等量的无菌水按照上述方法处理等量烟叶，制备对照烟叶样品。

称取适量处理烟叶样品，按照行业标准进行切丝，卷制成卷烟，将卷烟放到22℃，相对湿度为60％的恒温恒湿箱中平衡48h以上，用于评吸实验使用。

再称取适量处理烟叶样品和对照烟叶样品均切至成丝，将处理后的烟丝置于不高于40℃烘箱中干燥1～1.5h，直至可用手指碾碎，待烟丝烘干后，用多功能粉碎机粉碎成粉末状，过40目分样筛，倒入广口瓶密封备用，用于GC-MS检测。。

GC-MS的检测方法如下：色谱条件：Agilent 19091S-436HP-5MS毛细管柱(60m×250μm×0.25μm)；进行口温度：280℃；载气：99.999％高纯度氦气，流速：1.0ml/min；分流模式为不分流进样，进样量为1.0μL。

升温程序：初始温度为50℃，保持3min，然后以5℃/min的升温速度升至120℃，保持10min，以4℃/min升至180℃，保持10min，以0.6℃/min升至210℃，再以4℃/min升至280℃结束；

质谱条件：采用SCAN模式，传输线温度280℃；离子源温度为230℃；四极杆温度为150℃；离子源为XTR-EI源，电子能量为70eV；溶剂延迟时间为8min；扫描范围：35～500amu。

GC-MS检测结果如表1所示，结果显示，通过该不动杆菌发酵后，糠醛、4-环戊烯-1，3-二酮、苯甲醛、苯甲醇、苯乙醛、2-乙酰基吡咯、芳樟醇、苯乙醇、4-氧代异佛尔酮、α-大马酮、β-大马酮、茄酮、二氢大马酮等的含量提高。

表1不动杆菌处理前后烟叶中性香气物质对比图。

评吸实验结果如表2所示。

表2感官评吸评价

样品	处理效果
		对照烟叶组	香气量和香气质不足，刺激性较大，甜感不明显，余味差
处理烟叶组	香气质提升，香气量增加，刺激性降低，清甜感提升，余味变好

从表2评吸实验结果发现，通过该不动杆菌的发酵，使得复烤后的低等级烟叶香气质增强，香气量增加，刺激性降低，清甜感提升，余味变好。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。

序列表

<110> 浙江中烟工业有限责任公司

<120> 一株不动杆菌及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1436

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cgcaatgggg agcttaccat gcagtcgagc gggggaggta gcttgctacc ggacctagcg 60

gcggacgggt gagtaatgct taggaatctg cctattagtg ggggacaaca tctcgaaagg 120

gatgctaata ccgcatacgt cctacgggag aaagcagggg atcttcggac cttgcgctaa 180

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tggggagtac ggtcgcaaga ctaaaactca aatgaattga cgggggcccg cacaagcggt 900

ggagcatgtg gtttaattcg atgcaacgcg aagaacctta cctggccttg acatagtaag 960

aactttccag agatggattg gtgccttcgg gaacttacat acaggtgctg catggctgtc 1020

gtcagctcgt gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgcaac gagcgcaacc cttttcctta 1080

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cggattggag tctgcaactc gactccatga agtcggaatc gctagtaatc gcggatcaga 1320

atgccgcggt gaatacgttc ccgggccttg tacacaccgc ccgtcacacc atgggagttt 1380

gttgcaccag aagtagctag cctaactgca aagagggcgt accatcgtgc catttt 1436

Claims (7)

1.一株不动杆菌（Acinetobacter sp.）ZH-7，该菌株已于2021年04月09日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC NO. 22157。

2. 如权利要求1所述的不动杆菌的培养方法，其特征在于，该培养方法包括如下步骤：将权利要求1所述的不动杆菌按体积比1%~5%的接种量，接种到培养基中，温度28~35 ℃，转速100~150 rpm，培养8~12 h即可。

3. 如权利要求2所述的不动杆菌的培养方法，其特征在于，所述培养基的配方为：酵母粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化钠10 g/L。

4.如权利要求1的不动杆菌在发酵复烤后的低等级烟叶中的应用。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，该应用包括将菌株进行培养获得发酵液，将发酵液喷洒在烟叶上进行发酵。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，相较于发酵前的烟叶，发酵后烟叶的糠醛、4-环戊烯-1，3-二酮、苯甲醛、苯甲醇、苯乙醛、2-乙酰基吡咯、芳樟醇、苯乙醇、4-氧代异佛尔酮、α-大马酮、β-大马酮、茄酮、二氢大马酮含量提高。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，该应用包括以下步骤：

1） 培养基的配方：酵母粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化钠10 g/L；

2） 菌株活化：将不动杆菌活化培养，得到不动杆菌活化液；菌株活化条件为：28～35℃、100～150 r/min条件下震荡培养8~12 h；

3） 发酵液培养：将步骤2)中所得的活化菌液按体积比1%~5％接种到上述步骤1)中的培养基中形成发酵液，接种后的发酵培养条件同活化培养条件，培养至OD₆₀₀值为0.8~1；

4） 将步骤3)中所得的发酵液在4℃、10000 rpm/min条件下进行高速离心10 min，进行复溶，按照处理菌量为0.22×10⁷ ~1.32×10⁷ cfu/g将悬浮液均匀喷洒至烟叶上，保持喷洒后烟叶水分为22~26%；

5） 将步骤4）中处理好的烟叶在温度为30~37℃，相对湿度为60%~80%的恒温恒湿箱中发酵16~30 h。

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