CN111733093B - 根际假河杆菌、其培养分离方法和在烟草加香中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了根际假河杆菌(Pseudorivibacter rhizosphaerae)C1‑9，其16S rDNA部分序列如序列表所示，其保藏编号为CGMCC NO:1.13864。本发明还公开了所述根际假河杆菌(Pseudorivibacter rhizosphaerae)C1‑9培养分离方法和制备烟用香料的方法。本发明的根际假河杆菌为新的菌株，用其制备得到的烟用香料用于卷烟加香中，烟气的烟香丰富性显著增加，增加了烟气的细腻性，刺激性降低。

Description

根际假河杆菌、其培养分离方法和在烟草加香中的用途
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及根际假河杆菌、其分离方法和在烟草加香中的用途。
背景技术
香精香料在食品、饲料、化妆品、化工和制药等工业上具有重要地位，其来源主要包括天然与化学合成两种方式。其中，化学合成的香精香料约占整个产品的85％，但化学合成的方法具有副产物多、产率低、高成本、污染环境等缺点。随着绿色工业的倡导，天然香精香料越来越被人们所重视。天然香精香料主要来源于动物和植物，但动物、植物香料资源有限，提取成本高，远远满足不了日益增长的市场需求。
烟草行业是重要的消费品制造行业，通过降焦减害以提高卷烟的安全性已成为烟草行业的共同目标。但随着降低卷烟焦油量的下降，卷烟香气成分不足的问题也越发凸显。为弥补卷烟香气和吃味的不足，添加烟用香精香料成为完善卷烟产品风格的决定性因素和提高卷烟香气质量的一个有效手段。获取风格特征各异、且具有良好安全性能的烟用香精香料也成为了烟草制品研发的重要方向之一。
烟草香精香料按照来源，分为来自烟草本身的香精香料、非烟草的天然香精香料和人工合成的香精香料。通过微生物制备的天然香料是近年来新兴的烟用香料来源之一。微生物制备的香料是以天然原料为起始物，使用发酵技术、酶技术等产生的香料，也属于天然香料；由于微生物制备的香料具有生产周期短，不受气候影响，反应条件温和，产品分离后形成的“三废”少，对环境友好等多种优越性，使其逐渐成为产香植物的替代者。目前，通过微生物制备的烟用香料包括香兰素、2-苯乙醇、类胡萝卜素降解香料、多糖类及其他复合香料等。微生物制备香料具有原料易得，条件温和、选择性高等优势。但目前能用的制备香料的微生物的优势菌株种类并不多，所以筛选并开发应用新种类的产香微生物，以满足烟用香精香料研发和生产需求，具有现实的必要性。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种新的菌株根际假河杆菌、其培养分离和鉴别方法；本发明的目的还在于提供所述的根际假河杆菌在烟草加香中的用途。
本发明通过以下技术方案实现上述目的。
除非另有说明，本发明中所采用的百分数均为质量百分数。
本发明的技术方案如下：
本发明第一方面公开了根际假河杆菌(Pseudorivibacter rhizosphaerae)C1-9，其16S rDNA部分序列如序列表所示，其保藏编号为CGMCC NO:1.13864。
本发明第二方面公开了所述的根际假河杆菌C1-9培养分离的方法，包括以下步骤：
①从自然环境中取土壤样品，加无菌水，摇床振荡，加无菌水继续稀释并涂布于R2A平板培养基上进行培养，挑选单菌落，纯化，得到分离的微生物菌液，加入甘油、置于冰箱中备用；
②将步骤①分离的微生物菌液接种到R2A液体培养基中，摇床振荡，培养至菌液浓度为光密度OD＝2.0，制得种子液；
③将步骤②制得的每一待测菌株的种子液接种在筛选培养基中，摇床振荡，通过观察发酵液外观和香气变化情况，筛选能产生香气的微生物，即为根际假河杆菌(Pseudorivibacter rhizosphaerae)C1-9。
优选地，步骤③中所述筛选培养基的配方为：在R2A液体培养基的基础上添加0.1g/L的类胡萝卜素。
本发明第三方面公开了所述的根际假河杆菌C1-9制备烟用香料的方法，其特征在于，包括如下步骤：
将根际假河杆菌C1-9扩大培养后接种于发酵培养基中，28℃下摇瓶培养6～7天；然后对发酵液进行过滤，滤液用乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，减压浓缩后得到澄清黄色油性液体，即为烟用香料。
优选地，所述发酵培养基配方中包含玉米浆和胡萝卜泥，添加量分别为10～20g/L。
本发明第四方面公开了制得的烟用香料用于提升卷烟抽吸品质的用途。
本发明的微生物根际假河杆菌C1-9，其是从云南会泽烟草根际土壤中分离得到的，对其进行了形态学、生理生化性质和16S rDNA分析，鉴定结果表明其是一个新的菌种，微生物学分类命名为根际假河杆菌(拉丁文名称：Pseudorivibacter rhizosphaerae)C1-9，已于2019年8月9日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称：CGMCC)保藏，保藏编号为CGMCC NO:1.13864，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中国科学院微生物研究所。
本发明分离得到的根际假河杆菌C1-9菌株的主要形态特征和生理生化性质特征为：在大多数培养基上生长良好，在R2A琼脂培养基上，菌落边缘整齐，中间凸起，呈浅黄色。淀粉水解、纤维素水解，过氧化氢酶、酸性磷酸酶、胰蛋白酶、吐温20，40，60和80水解呈阳性，氧化酶，酪蛋白水解，α-半乳糖苷酶、脲酶呈阴性。能利用果糖、乳糖、柠檬酸、纤维二糖、岩藻糖、甜醇、蜜二糖、丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸。细胞膜的极性脂成分主要包括磷脂酰甘油、双磷脂酰甘油和磷脂酰乙醇胺，细胞的呼吸醌为泛醌-8(Q-8)。
本发明所分离得到的根际假河杆菌C1-9的16S rDNA基因核苷酸序列如下序列表所示，该序列已递交国际核苷酸序列数据库(GenBank)，序列检索号：MF687442。附序列表：
根际假河杆菌C1-9的16S rDNA部分序列如下：
Figure GDA0003538710330000031
Figure GDA0003538710330000041
本发明第二方面涉及的根际假河杆菌C1-9分离、培养和鉴别的方法，包括以下步骤：
a、从自然环境中取土壤样品，加无菌水，摇床振荡，加无菌水继续稀释并涂布于R2A平板培养基上进行培养，挑选单菌落，纯化，得到分离的微生物菌液，加入甘油、置于冰箱中备用；
b、将步骤a分离的微生物菌液接种到R2A液体培养基中，摇床振荡，培养至菌液浓度为光密度OD＝2.0，制得种子液；
c、将步骤b制得的每一待测菌株的种子液接种在筛选培养基中，摇床振荡，通过观察发酵液外观和香气变化情况，筛选能产生香气的微生物，构建系统发育树进行分子鉴别。
上述的步骤a中的土壤样品取自云南会泽烟草根际土壤样品；摇床振荡温度为30℃，振荡速度180rpm，振荡时间30min，用无菌水稀释至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5倍，在R2A平板培养基上的培养温度为30℃，培养时间48h，甘油的加入量为分离的微生物菌液体积的20％，冰箱温度为-80℃。
上述的步骤b中摇床振荡温度为30℃，振荡速度160rpm；步骤c中摇床振荡温度为30℃，振荡速度160rpm，振荡时间3-5天。
上述的步骤c中筛选培养基组成为：在R2A液体培养基的基础上添加0.1g/L的类胡萝卜素。所述类胡萝卜素可以为α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、叶黄素、玉米黄质、番茄红素中一种或多种的混合物。
本发明第三方面涉及所述的根际假河杆菌C1-9制备烟用香料的方法，包括如下步骤：
将根际假河杆菌C1-9扩大培养后接种于发酵培养基中，28℃下摇瓶培养6～7天；对发酵液进行过滤，滤液用乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯层萃取液，减压浓缩后所得澄清黄色油性液体，即为烟用香料。
所述发酵培养基配方中包含玉米浆和胡萝卜泥，玉米浆和胡萝卜泥为将新鲜玉米粒和胡萝卜洗净磨碎制得，添加量分别为10～20g/L。
本发明第四方面公开了制得的根际假河杆菌C1-9烟用香料用于提升卷烟抽吸品质的用途。加入到卷烟烟丝中能使卷烟具有特殊香气且刺激性降低。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明首次从云南会泽烟草根际土壤样品分离得到新的具有产香功能的试验菌种C1-9，经形态学、生理生化性质和16S rDNA分析测序分析表明该菌株是一种新的细菌，微生物学分类命名为根际假河杆菌(Pseudorivibacter rhizosphaerae)C1-9；
2、本发明得到的根际假河杆菌C1-9，其发酵提取物可以制备成烟用香料。加入到卷烟烟丝中能使卷烟具有特殊香气；烟气的烟香丰富性显著增加，增加了烟气的细腻性，刺激性降低。由根际假河杆菌C1-9发酵制备的香料非常适合卷烟中的加香用于提升卷烟抽吸品质的用途。
附图说明
图1为实施例1的根际假河杆菌C1-9在R2A培养基上的电镜照片；
图2为实施例1的根际假河杆菌C1-9及部分相关菌株依据16S rDNA基因序列构建的系统发育树。
图3为实施例2根际假河杆菌C1-9制得的烟用香料的GC-MS图谱。
具体实施方式
实施例1
1.根际假河杆菌(Pseudorivibacter rhizosphaerae)C1-9的分离、培养与鉴定
1.1根际假河杆菌C1-9的分离
从云南会泽烟草根际土壤样品取土样，塑料袋密封带回，4℃保存待用。准确称取10g上述土样，加入90mL无菌水，30℃、180rpm摇床震荡30min；用无菌水将浓度稀释至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5倍，将5个浓度的菌液分别取0.2mL涂布于R2A平板培养基上，每个浓度的菌液设置3个平行试验，30℃下培养48h，从每份土样的平板上挑取不同单菌落，在R2A平板培养基上纯化后按菌液体积20％加入甘油，置于-80℃冰箱保存备用。
将分离得到的微生物分别接种于R2A液体培养基中，30℃、160rpm摇床振荡培养，培养至菌液浓度为OD＝2.0，作为种子液备用；将每一个待测菌株的种子液按1％接种在筛选培养基中，于30℃、160rpm摇床振荡培养3-5天，每天观察发酵液外观和香气变化情况，筛选得到能够产生香气的微生物，编号C1-9。
其中所述的R2A平板培养基的组成如下：葡萄糖0.5g，酵母膏0.5g，蛋白胨0.5g，酸水解酪蛋白0.5g，可溶性淀粉0.5g，丙酮酸钠0.3g，磷酸氢二钾0.3g，硫酸镁0.05g，琼脂15g，蒸馏水定容到1000mL，pH7.2；待冷却至50-60℃时，倒制平板。
R2A液体培养基的组成如下：葡萄糖0.5g，酵母膏0.5g，蛋白胨0.5g，酸水解酪蛋白0.5g，可溶性淀粉0.5g，丙酮酸钠0.3g，磷酸氢二钾0.3g，硫酸镁0.05g，蒸馏水1000ml，pH7.2；121℃，20min高压灭菌。
筛选培养基组成为：在R2A液体培养基的基础上添加0.1g/L的类胡萝卜素。所述类胡萝卜素可以为α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、叶黄素、玉米黄质、番茄红素中一种或多种的混合物。
1.2根际假河杆菌C1-9的鉴定
对分离纯化的菌株C1-9进行形态学、生理生化性质和16S rDNA分析，鉴定结果表明其是一个新的菌种，微生物学分类命名为根际假河杆菌(Pseudorivibacterrhizosphaerae)C1-9。
根际假河杆菌C1-9在R2A培养基上的电镜照片如附图1所示。
根际假河杆菌C1-9在大多数培养基上生长良好，在R2A琼脂培养基上，菌落边缘整齐，中间凸起，呈浅黄色。淀粉水解、纤维素水解，过氧化氢酶、酸性磷酸酶、胰蛋白酶、吐温20，40，60和80水解呈阳性，氧化酶，酪蛋白水解，α-半乳糖苷酶、脲酶呈阴性。能利用果糖、柠檬酸、纤维二糖、岩藻糖、甜醇、蜜二糖、丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸。细胞膜的极性脂成分主要包括磷脂酰甘油、双磷脂酰甘油和磷脂酰乙醇胺，细胞的呼吸醌为泛醌-8(Q-8)。
根际假河杆菌C1-9的生理生化特征如表1所示：
表1根际假河杆菌C1-9的生理生化特征
Figure GDA0003538710330000061
Figure GDA0003538710330000071
注：“+”表示结果为阳性，“-”表示结果为阴性。
根际假河杆菌C1-9的碳氮利用情况如表2所示：
表2烟根际假河杆菌C1-9的碳氮源利用情况
碳源利用 结果 碳源或氮源利用 结果
明胶 + N-乙酰-D-葡糖胺 +
乙酰乙酸 + D-鼠李糖 -
α-D-乳糖 + 柠檬酸 +
L-丙氨酸 + L-组氨酸 +
D-果糖-6-PO<sub>4</sub> - 甘油 +
D-阿拉伯糖 - 甘露醇 +
L-精氨酸 + L-丝氨酸 +
注：“+”表示结果为阳性，“-”表示结果为阴性。
根际假河杆菌C1-9的16S rDNA部分序列如附图说明所示，该序列与GenBank数据库中的已知序列进行BLAST比较分析，并从数据库获得相关种属的16S rDNA基因序列，构建系统发育树，见附图2。经比较分析发现，本发明的根际假河杆菌C1-9与菌株(Rivibactersubsaxonicus DSM 19570T)亲缘关系最近，在系统进化树上形成独立的分枝，综合形态、生理生化、细胞化学和系统进化分析等特征，两者又有明显差距，表明本发明的根际假河杆菌C1-9是一个新物种，命名为Pseudorivibacter rhizosphaerae。
根际假河杆菌C1-9在GenBank数据库的16S rDNA基因核苷酸序列登录号为MF687442，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC NO:1.13864。根际假河杆菌C1-9及相关种属的16S rDNA基因序列构建的系统发育树如附图2所示。
实施例2
根际假河杆菌(Pseudorivibacter rhizosphaerae)C1-9烟用香料的制备
1.根际假河杆菌C1-9的培养
(1)试管斜面培养
采用斜面保藏培养基，培养基为R2A琼脂培养基，培养基的配方为：葡萄糖0.5g，酵母膏0.5g，蛋白胨0.5g，酸水解酪蛋白0.5g，可溶性淀粉0.5g，丙酮酸钠0.3g，磷酸氢二钾0.3g，硫酸镁0.05g，琼脂15g，蒸馏水定容到1000mL，pH7.2。将培养基在121℃下灭菌25分钟，摆成斜面，接种根际假河杆菌C1-9菌株，28℃下培养1周，获得试管菌种；
(2)种子培养
采用种子培养基，种子培养基为R2A液体培养基，配方为：葡萄糖0.5g，酵母膏0.5g，蛋白胨0.5g，酸水解酪蛋白0.5g，可溶性淀粉0.5g，丙酮酸钠0.3g，磷酸氢二钾0.3g，硫酸镁0.05g，蒸馏水1000mL，pH7.2。将培养基在121℃下灭菌25分钟，从步骤(1)的试管斜面上挑取部分菌丝体接入种子液中，30℃震荡培养48h，获得液体菌种；
(3)发酵培养
取5L发酵培养基，培养基的配方为：玉米浆10g；胡萝卜泥10g，葡萄糖10g；蛋白胨3g；氯化钠2.5g；碳酸钙2g；蒸馏水1000mL，pH7.2。将培养基在121℃下灭菌30min，将步骤(2)中的液体菌种按10％的接种量接到发酵培养基中，摇瓶培养2～3天，培养温度为28℃，得到发酵液。
2.烟用香料的制备和评价
(1)烟用香料的制备
对上述得到的发酵液进行过滤，滤液用乙酸乙酯进行萃取，连续萃取3次，合并乙酸乙酯层萃取液，并于50℃、0.06MPa条件下进行减压浓缩，最后得到一种带香味的澄清黄色油性液体，即为所需的烟用香料。
(2)烟用香料挥发性成分分析
所得烟用香料进行GC-MS分析，显示含有的主要挥发性物质如表3所示，包括：异戊醇、2-甲基丁醇、环戊酮、2-甲基四氢呋喃-3酮、2-乙酰基呋喃、己酸、苯乙醛、2-乙酰基吡咯、苯乙醇、辛酸、γ-壬内酯、(E)-β-大马酮、二氢猕猴桃内酯、巨豆三烯酮等，其中(E)-β-大马酮、二氢猕猴桃内酯、巨豆三烯酮一般为类胡萝卜素降解产生的降异戊二烯环合物。该发酵得到的烟用香料的GC-MS图谱如图3所示。
表3根际假河杆菌C1-9发酵得到烟用香料中的主要挥发性物质
Figure GDA0003538710330000081
Figure GDA0003538710330000091
(3)烟用香料的评价
将得到的烟用香料用微量喷雾器按0.3wt‰的量均匀地喷加在烟丝上，对照组加入等量蒸馏水，将加香烟丝和对照烟丝卷制成烟支，放入恒温恒湿箱内，在湿度60％±2，温度22℃±2条件下平衡24h后，由评吸专家组成的评吸小组进行感官评吸，评吸结果如表4所示。由评吸结果可知，与对照烟支相比，加香烟支具有较为特殊的花香甜香的香气，说明该烟用香料具有增加烟香、使香气柔和淡雅、增加细腻性、减少杂气、降低刺激性的作用。
表4根际假河杆菌C1-9发酵烟用香料的感官评吸比较
Figure GDA0003538710330000092
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 云南中烟工业有限责任公司
<120> 根际假河杆菌、其培养分离方法和在烟草加香中的用途
<130> RIE200323
<141> 2020-05-19
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1492
<212> DNA
<213> 根际假河杆菌(Rivibacter soli.C1-9)
<400> 1
agagtttgat cctggctcag attgaacgct ggcggcatgc cttacacatg caagtcgaac 60
ggcagcacgg gggcaaccct ggtggcgagt ggcgaacggg tgagtaatgc atcggaacgt 120
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atcggaatta ctgggcgtaa agcgtgcgca ggcggtcatg caagacagat gtgaaatccc 600
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accctggtag tccacgccct aaacgatgtc aactggttgt tggacggctt gctgttcagt 840
aacgaagcta acgcgtgaag ttgaccgcct ggggagtacg gccgcaaggt tgaaactcaa 900
aggaattgac ggggacccgc acaagcggtg gatgatgtgg tttaattcga tgcaacgcga 960
aaaaccttac ctacccttga catgccagga acttgccaga gatggcttgg tgctcgaaag 1020
agagcctgga cacaggtgct gcatggccgt cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta 1080
agtcccgcaa cgagcgcaac ccttgtcatt agttgctacg aaagggcact ctaatgagac 1140
tgccggtgac aaaccggagg aaggtgggga tgacgtcagg tcatcatggc ccttatgggt 1200
agggctacac acgtcataca atggccggta cagagggctg ccaacccgcg agggggagcc 1260
aatcccagaa aaccggtcgt agtccggatt gcagtctgca actcgactgc atgaagtcgg 1320
aatcgctagt aatcgcggat cagcttgccg cggtgaatac gttcccgggt cttgtacaca 1380
ccgcccgtca caccatggga gcgggttctg ccagaagtag ttagcctaac cgcaaggagg 1440
gcgattacca cggcagggtt cgtgactggg gtgaagtcgt aacaaggtaa cc 1492

Claims (4)

1.根际假河杆菌(Pseudorivibacter rhizosphaerae)C1-9，其特征在于，保藏编号为CGMCC NO:1.13864。
2.一种利用权利要求1所述的根际假河杆菌C1-9制备烟用香料的方法，其特征在于，包括如下步骤：
将根际假河杆菌C1-9扩大培养后接种于发酵培养基中，28℃下摇瓶培养6～7天；然后对发酵液进行过滤，滤液用乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，减压浓缩后得到澄清黄色油性液体，即为烟用香料。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基配方中包含玉米浆和胡萝卜泥，添加量分别为10～20g/L。
4.根据权利要求2或3所述的方法制得的烟用香料用于提升卷烟抽吸品质的用途。
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