CN113957019B - 一种类诺卡氏菌、其分离方法和应用 - Google Patents

一种类诺卡氏菌、其分离方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种类诺卡氏菌，其微生物学分类命名为类诺卡氏菌ST46，拉丁文学名为Nocardioides sp.；其16S rDNA部分序列如序列表所示；其保藏编号为CGMCC 4.7686。本发明还公开了所述类诺卡氏菌培养分离方法和制备烟用香料的用途。本发明的类诺卡氏菌为新的菌株，用其制备得到的烟用香料用于卷烟加香中，烟香丰富性和烟气丰满度显著增加，烟气劲头明显提升的同时，余味和舒适性良好。

Description

一种类诺卡氏菌、其分离方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及类诺卡氏菌、其分离方法和在烟草加香中的应用。
背景技术
烟用香精香料是卷烟生产中不可缺少的添加剂，其应用更是与卷烟品牌的树立及卷烟风格的形成发展休戚相关。但随着企业卷烟自主调香步伐的加快，现有香精香料的种类、数量、品质等已不能满足调香技术人员的需求。香精香料研究人员开发更多可应用于自主调香的香精香料，满足企业调香工作的实际情况与需求，已成为卷烟调香和卷烟产品研发面临的现实课题。
利用微生物发酵技术制备烟用香料，其成本相对较低，不受气候、土地资源的限制，在缩短生产周期的同时，还可提高香料的产量和品质，属于对环境友好、资源节约型的产品技术研发，符合企业绿色、环保、安全、节约减排的发展要求，是烟用香料开发的一个重要方向。但目前能用于制备烟用香料的微生物优势菌株仍然较少，所开发香料的香型和功效作用等较为单调，所以对新型产香微生物开展持续筛选并进行开发应用，以满足烟用香精香料研发和生产需求，具有现实必要性。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种新的菌株类诺卡氏菌、其培养分离和鉴别方法；本发明的目的还在于提供所述的类诺卡氏菌发酵生物香料用于在烟草加香中的用途。
本发明通过以下技术方案实现上述目的。
除非另有说明，本发明中所采用的百分数均为质量百分数。
本发明第一方面公开了一种具有产香功能的微生物类诺卡氏菌ST46，其是从云南昆明烟草种植基地烟草土壤样品中分离得到的，对其进行了形态学、生理生化性质和16SrDNA分析，鉴定结果表明其属于类诺卡氏菌，微生物学分类命名为类诺卡氏菌ST46，拉丁文学名为Nocardioides sp.。申请人已于2020年9月25日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称：CGMCC)保藏，保藏编号为CGMCC 4.7686，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中国科学院微生物研究所；于2020年10月15日给出存活证明。
本发明分离得到的类诺卡氏菌ST46菌株的主要形态特征和生理生化性质特征为：在大多数培养基上生长良好，在R2A琼脂培养基上，菌落边缘整齐，中间凸起，呈白色。明胶液化、L-精氨酸双水解酶、V-P反应、过氧化氢酶呈阳性，赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶、硝酸盐还原、色安酸脱氨酶呈阴性，不产生硫化氢。能利用D-纤维二糖、果糖、葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘油、L-组氨酸。细胞膜的极性脂成分主要包括磷脂酰甘油、双磷脂酰甘油和磷脂酰肌醇，细胞的呼吸醌为甲基萘醌-8(H4)(MK-8(H4))。
本发明所分离得到的类诺卡氏菌ST46的16S rDNA序列如序列表所示，具有1490bp个碱基，该序列已递交国际核苷酸序列数据库(GenBank)，序列检索号：MT559270。
本发明第二方面公开了一种分离、培养和鉴别如本发明第一方面所述的类诺卡氏菌ST46的方法，包括以下步骤：
①从自然环境中取土壤样品，加无菌水，摇床振荡，加无菌水继续稀释并涂布于LB平板培养基上进行培养，挑选单菌落，纯化，得到分离的微生物菌液，加入甘油、置于冰箱中备用；
②将步骤①得到的微生物菌液接种到LB液体培养基中，摇床振荡，培养至菌液浓度为光密度OD＝2.0，制得种子液；
③将步骤②制得的种子液接种在筛选培养基中，摇床振荡，筛选产生香气的微生物，构建系统发育树进行分子鉴别，得到所述的类诺卡氏菌。
优选地，步骤①中的土壤样品取自云南昆明烟草种植基地。
优选地，步骤①中摇床振荡温度为30℃，振荡速度180rpm，振荡时间30min，用无菌水稀释至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5倍，在LB平板培养基上的培养温度为30℃，培养时间48h，甘油的加入量为分离得到的微生物菌液体积的20％，冰箱温度为-80℃。
优选地，步骤①中摇床振荡温度为30℃，振荡速度180rpm，振荡时间30min，用无菌水稀释至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5倍，在LB平板培养基上的培养温度为30℃，培养时间48h，甘油的加入量为分离得到的微生物菌液体积的20％，冰箱温度为-80℃。
优选地，步骤③中筛选的培养基为R2A液体培养基。
本发明第三方面涉及一种利用本发明第一方面所述的类诺卡氏菌用于制备发酵生物香料的用途。
优选地，类诺卡氏菌用于制备发酵生物香料，包括如下步骤：
将类诺卡氏菌扩大培养后接种于发酵培养基中，28℃下摇瓶培养7天后，发酵液经离心或抽滤，滤液在50～65℃条件下浓缩得到密度0.8～1.5g/cm3的浓缩发酵液；浓缩发酵液用浓度30～40％乙醇浸提，其中浓缩发酵液与乙醇的体积比为V:V＝1:20；冷藏静置沉淀4～8h后进行过滤，滤液在50～65℃条件下浓缩得到密度1.0～1.5g/cm3的黄褐色液体，即为发酵生物香料。
本发明第四方面公开了类诺卡氏菌制备得到的发酵生物香料用于烟草加香的用途。将得到的发酵生物香料加入到卷烟烟丝中能使卷烟烟香丰富性和烟气丰满度显著增加，烟气劲头明显提升的同时，余味和舒适性良好。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明首次从云南昆明烟草种植基地烟草土壤样品中分离得到新的具有产香功能的试验菌种ST46，经形态学、生理生化性质和16S rDNA分析，鉴定结果表明该菌株是一种新的细菌，属于类诺卡氏菌，微生物学分类命名为类诺卡氏菌ST46，拉丁文学名为Nocardioidessp.。
2、本发明得到的类诺卡氏菌ST46，其发酵提取物可以制备成烟用香料。加入到卷烟烟丝中能使卷烟烟香丰富性和烟气丰满度显著增加，烟气劲头明显提升的同时，余味和舒适性良好。由类诺卡氏菌ST46发酵制备的香料非常适合卷烟加香，具有提升卷烟抽吸品质的用途。
附图说明
图1为本发明类诺卡氏菌ST46在R2A培养基上的电镜照片；
图2为本发明类诺卡氏菌ST46及部分相关菌株依据16S rDNA基因序列构建的系统发育树。
具体实施方式
以下通过实施例来详细说明本发明的技术方案，以下的实施例仅是示例性的，仅能用来解释和说明本发明的技术方案，而不能解释为是对本发明技术方案的限制。在本申请的各实施例中，没有注明具体技术或条件者，按照本领域内现有技术或条件进行，所使用的材料或设备未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。
实施例1
1.类诺卡氏菌ST46(Nocardioides sp.ST46)的分离、培养与鉴定
1.1类诺卡氏菌ST46的分离
从云南昆明烟草种植基地取烟草土壤样品，塑料袋密封带回，4℃保存待用。准确称取10g土样，加入90mL无菌水，30℃、180rpm摇床震荡30min；用无菌水将浓度稀释至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5倍，将5个浓度的菌液分别取0.2mL涂布于LB平板培养基上，每个浓度的菌液设置3个平行试验，30℃下培养48h，从每份土样的平板上挑取不同单菌落，在LB平板培养基上纯化后按菌液体积20％加入甘油、置于-80℃冰箱保存备用。
将分离得到的微生物分别接种于LB液体培养基中，30℃、160rpm摇床振荡培养，培养至菌液浓度为OD＝2.0，作为种子液备用。将每一个待测菌株的种子液按1％接种在筛选培养基，即R2A液体培养基中，于30℃、160rpm摇床振荡培养3-5天，每天观察发酵液外观和香气变化情况，筛选得到能够产生香气的微生物，编号ST46。
1.2类诺卡氏菌ST46的鉴定
对分离纯化的菌株ST46进行形态学、生理生化性质和16S rDNA分析，鉴定结果表明属于类诺卡氏菌(Nocardioides)ST46，其微生物学分类命名为类诺卡氏菌ST46，拉丁文学名为Nocardioidessp.。
类诺卡氏菌ST46在R2A培养基上的电镜照片如附图1所示。
类诺卡氏菌ST46在大多数培养基上生长良好，在R2A琼脂培养基上，菌落边缘整齐，中间凸起，呈白色。明胶液化、L-精氨酸双水解酶、V-P反应、过氧化氢酶呈阳性，赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶、硝酸盐还原、色安酸脱氨酶呈阴性，不产生硫化氢。能利用D-纤维二糖、果糖、葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘油、L-组氨酸。细胞膜的极性脂成分主要包括磷脂酰甘油、双磷脂酰甘油和磷脂酰肌醇，细胞的呼吸醌为甲基萘醌-8(H4)(MK-8(H4))。
类诺卡氏菌ST46的生理生化特征如表1所示。
表1类诺卡氏菌ST46的生理生化特征
实验 生长反应 实验 生长反应
明胶液化 +++++ L-精氨酸双水解酶 +++++
V-P反应 ++ 鸟氨酸脱羧酶 --
过氧化氢酶 ++ 硝酸盐还原 --
赖氨酸脱羧酶 -- 色安酸脱氨酶 --
注：“+”表示结果为阳性，“-”表示结果为阴性
类诺卡氏菌ST46的碳氮利用情况如表2所示。
表2类诺卡氏菌ST46的碳氮源利用情况
碳源利用 结果 碳源或氮源利用 结果
甘油 + N-乙酰-D-葡糖胺 +
麦芽糖 + 甘露醇 +
葡萄糖 + 果糖 +
纤维二糖 + 半乳糖 +
乳糖 + 鼠李糖 -
L-组氨酸 + 柠檬酸 -
蜜二糖 + 岩藻糖 -
注：“+”表示结果为阳性，“-”表示结果为阴性
类诺卡氏菌ST46的16S rDNA部分序列如序列表所示，该序列与GenBank数据库中的已知序列进行BLAST比较分析，并从数据库获得相关种属的16SrDNA基因序列，构建系统发育树，见附图2。经比较分析发现，本发明的类诺卡氏菌ST46与菌株(Nocardioideseburneiflavus MMS17-SY213T)亲缘关系最近，在系统进化树上形成独立的分枝，综合形态、生理生化、细胞化学和系统进化分析等特征，两者又有明显差距，表明本发明的类诺卡氏菌ST46是一个新物种，命名为Nocardioides sp.ST46。
类诺卡氏菌ST46在GenBank数据库的16S rDNA基因核苷酸序列登录号为MT559270，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC 4.7686。类诺卡氏菌ST46及相关种属的16S rDNA基因序列构建的系统发育树如附图2所示。
实施例2
1.类诺卡氏菌ST46发酵液生物香料的制备
1.1类诺卡氏菌ST46(Nocardioides sp.ST46)的培养
(1)试管斜面培养
采用斜面保藏培养基，培养基为R2A琼脂培养基，培养基的配方为：葡萄糖0.5g，酵母膏0.5g，蛋白胨0.5g，酸水解酪蛋白0.5g，可溶性淀粉0.5g，丙酮酸钠0.3g，磷酸氢二钾0.3g，硫酸镁0.05g，琼脂15g，蒸馏水定容到1000mL，pH7.2。将培养基在121℃下灭菌25分钟，摆成斜面，接种类诺卡氏菌ST46菌株，28℃下培养1周，获得试管菌种；
(2)种子培养
采用种子培养基，种子培养基的配方为：糊精120g，大豆粉40g，酵母膏2g，色氨酸0.5g，β-丙氨酸5g，硫酸镁0.5g，磷酸铵0.2g，蒸馏水定容到1000mL，pH7.2。将培养基在121℃下灭菌25分钟，从步骤(1)的试管斜面上挑取部分菌丝体接入种子液中，28℃摇瓶培养36h，获得液体菌种；
(3)发酵培养
取5L发酵培养基，培养基的配方为：黄豆饼浸出汁10mL；葡萄糖10g；蛋白胨3g；氯化钠2.5g；碳酸钙2g；蒸馏水1000mL，pH7.2。将培养基在121℃下灭菌30min，将步骤(2)中的液体菌种按10％的接种量接到发酵培养基中，摇瓶培养7天，培养温度为28℃，得到将类诺卡氏菌发酵液。
2.发酵提取液制备生物香料和评价
2.1发酵生物香料的制备
将类诺卡氏菌发酵液经离心取上层滤清液，滤清液在60℃条件下浓缩得到密度1.2g/cm3的浓缩发酵液；浓缩发酵液用浓度30v/v％乙醇浸提(发酵液与乙醇体积比V:V＝1:20)，于4℃下冷藏静置沉淀6h后进行过滤，滤液在60℃条件下浓缩得到密度1.2g/cm3的黄褐色液体，即为类诺卡氏菌发酵生物香料。
2.2发酵生物香料的评价
将得到的类诺卡氏菌发酵生物香料用微量喷雾器按烟丝0.3％的量均匀地喷加在烟丝上，对照组加入等量蒸馏水，将加香烟丝和对照烟丝卷制成烟支，放入恒温恒湿箱内，在湿度60％±2，温度22℃±2条件下平衡24h后，由评吸专家组成的评吸小组进行感官评吸，评吸结果如表3所示。由评吸结果可知，与对照烟支相比，加香烟支具有明显特殊的香气，烟香丰富性增加，烟气量和香气浓度明显提升，烟气劲头明显提升的同时，还能保持余味和舒适性良好，说明该发酵生物香料具有使卷烟增香，增加烟气丰满度，提高烟气劲头的功效，适宜在烟草加香中进行应用。
表3类诺卡氏菌ST46发酵生物香料的感官评吸比较
Figure BDA0003393955340000071
2.3发酵生物香料烟气成分分析
将步骤2.2制备的加香卷烟和对照卷烟分别进行主流烟气成分分析，结果如表4所示。由表可知，添加了类诺卡氏菌发酵生物香料的烟支，其主流烟气化学成分种类相比空白对照卷烟有所增加，对卷烟有增香作用的乙酰基呋喃、3-甲基-2(5H)-呋喃酮、四氢-2H-吡喃-2-酮、麦芽酚、4-羟基苯甲醛等呋喃类、吡喃类、醛类等物质的含量有明显增加，而引起烟气辛辣刺激的乙酸、丙酸、苯酚等酸类、酚类物质的含量有所下降或变化不明显，说明类诺卡氏菌发酵生物香料对卷烟在具增香提味，提升烟气劲头的同时，不会引起刺激性和余味的明显增加，适用于卷烟加香。
表4类诺卡氏菌ST46发酵生物香料加香卷烟与对照卷烟烟气成分分析
Figure BDA0003393955340000072
Figure BDA0003393955340000081
Figure BDA0003393955340000091
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Figure BDA0003393955340000092
Figure BDA0003393955340000101
序列表
<110> 云南中烟工业有限责任公司
<120> 一种类诺卡氏菌、其分离方法和应用
<130> RIB210612
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1490
<212> DNA
<213> 类诺卡氏菌ST46(Nocardioides sp. )
<400> 1
agagtttgat cctggctcag gacgaacgct ggcggcgtgc ttaacacatg caagtcgagc 60
ggaaaggcca cttcggtggt actcgagcgg cgaacgggtg agtaacacgt gagtaatctg 120
cccctggctt tgggatagcc accggaaacg gtgattaata ccggatatgc actgcttctc 180
gcatgggttg tggtggaaag tttttcggcc agggatgtgc tcgcggccta tcagcttgat 240
ggtgaggtaa tggctcacca tggcttcgac gggtagccgg cctgagaggg tgaccggtca 300
cactgggact gagacacggc ccagactcct acgggaggca gcagtgggga atattggaca 360
atgggcggaa gcctgatcca gcaacgccgc gtgagggatg acggccttcg ggttgtaaac 420
ctctttcagc agggacgaag cgcaagtgac ggtacctgca gaagaagcac cggccaacta 480
cgtgccagca gccgcggtaa tacgtagggt gcgagcgttg tccggaatta ttgggcgtaa 540
agggctcgta ggcggtttgt cgcgtcggga gtgaaaacgc cgtgcttaac acggcgcttg 600
ctttcgatac gggcagacta gaggtattca ggggagaacg gaattcctgg tgtagcggtg 660
aaatgcgcag atatcacgag gaacaccggt ggcgaaggcg ggtctctggg aatgacctga 720
cgctgaggag cgaaagtgtg gggagcgaac aggattagat accctggtag tccacaccgt 780
aaacgtgggc gctaggtgtg gggkycattc acggatccgt gcgcagctac gcattagcgc 840
cccgctgggg agtacgcgca gctaaactca ggatgacggg gcccgcacaa gcggcggagc 900
atgcggatta attcgatgca acgcgaagaa ccttacctgg gtttgacata caccctgccg 960
ctccagagat ggggcttctt ttgggggtgt acaggtggtg catggctgtc gtcagctcgt 1020
gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgcaac gagcgcaacc ctcgttctat gttgccagca 1080
cgtaatggtg gggactcata ggagactgcc ggggtcaact cggaggaagg tggggatgac 1140
gtcaagtcat catgcccctt atgtccaggg cttcacgcat gctacaatgg ccggtacaaa 1200
gggctgcgat cccgtaaggg tgagcgaatc ccaaaaagcc ggtctcagtt cggattgggg 1260
tctgcaactc gaccccatga agtcggagtc gctagtaatc gcagatcagc aacgctgcgg 1320
tgaatacgtt cccgggcctt gtacacaccg cccgtcacgt cacgaaagtc ggcaacaccc 1380
ggagccggtg gcccaaccct tgtggaggga gccgtcgaag gtggggctgg cgattgggac 1440
gaagtcgtaa caaggtagcc gtaccggaag gtgcggctgg atcacctcct 1490

Claims (4)

1.一种类诺卡氏菌，其特征在于，其微生物学分类命名为类诺卡氏菌ST46，拉丁文学名为Nocardioides sp.；其16S rDNA部分序列如序列表SEQ ID NO：1所示；其保藏编号为CGMCC 4.7686。
2.一种根据权利要求1所述类诺卡氏菌用于制备发酵生物香料的用途。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，类诺卡氏菌用于制备发酵生物香料，包括如下步骤：
将类诺卡氏菌扩大培养后接种于发酵培养基中，28℃下摇瓶培养7天后，发酵液经离心或抽滤，滤液在50～65℃条件下浓缩得到密度0.8～1.5g/cm3的浓缩发酵液；浓缩发酵液用浓度30～40％乙醇浸提，其中浓缩发酵液与乙醇的体积比为V:V＝1:20；冷藏静置沉淀4～8h后进行过滤，滤液在50～65℃条件下浓缩得到密度1.0～1.5g/cm3的黄褐色液体，即为发酵生物香料。
4.根据权利要求2所述用途，其特征在于，将制得的发酵生物香料用于卷烟加香的用途。
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