CN109136146B - 一种烟草土壤戴氏菌及其分离方法和应用 - Google Patents

一种烟草土壤戴氏菌及其分离方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种烟草土壤戴氏菌及其分离方法和应用，该细菌的微生物学分类命名为烟草土壤戴氏菌Dyellatabacisoli L4‑6，已于2018年6月19日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC 1.16273。本发明从土壤中分离得到的烟草土壤戴氏菌L4‑6，可用于对香原料植物进行发酵，所得到的发酵产物具有提高香原料植物提取物品质的作用。

Description

一种烟草土壤戴氏菌及其分离方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种烟草土壤戴氏菌及其分离方法和应用。
背景技术
加香加料是卷烟工艺中的关键环节，是完善产品风格的决定性因素和提高卷烟香气质量的有效手段之一。目前，烟用香料按来源分为三类，即来自非烟草的天然植物香精油、浸膏等；来自非烟草的天然植物香料，如从各种植物的花、果实、根、茎、叶中提取的精油浸膏、酊剂等；人工合成的香料，如醇、醛、酮等单体香料。按香料生产方法的不同主要分为两种，即采用各种分离手段直接从烟草或其它植物中提取的天然香料和采用化学反应合成的香料。目前，这两种方法都有其优点，但均存在一定的局限性。如直接从植物中提取天然香料，虽然生产操作简单，但存在改善卷烟抽吸效果不明显等缺点；采用化学合成的香料，虽然生产过程易于控制，但也存在香气单调、不自然等缺点。
近年来，随着微生物技术日新月异的发展，微生物法生产香料的工作已取得了很多进展。微生物种类丰富，长期以来人们利用纯培养技术对环境中的微生物进行调研和开发利用，微生物资源在科技研究及生物产业中的重要性也日益凸显。世界上许多国家都在搜集、保存各种微生物资源，微生物资源的不断丰富将为我国生物技术的发展奠定坚实的物质基础。
利用微生物对香原料进行发酵，可以增加传统提取香原料中多种香气物质的含量，提升香气丰富性。产香微生物，即能够产生具有芳香气味物质的微生物。目前，已经得到应用的产香微生物主要包括生香活性干酵母(生香ADY)、假丝酵母、乳酸菌、黑曲霉等。但是应用到卷烟中的微生物还很少，而且增香效果也不太理想。
发明内容
*除非另有说明，本发明中所采用的百分数均为质量百分数。
本发明第一方面涉及一种具有产香功能的微生物烟草土壤戴氏菌L4-6，其是从云南昆明烟草种植基地烟草土壤样品中分离得到的，对其进行了形态学、生理生化性质和16SrDNA分析，鉴定结果表明其属于烟草土壤戴氏菌，微生物学分类命名为烟草土壤戴氏菌Dyellatabacisoli L4-6，已于2018年6月19日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称：CGMCC)保藏，保藏编号为CGMCC 1.16273，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中国科学院微生物研究所。
本发明分离得到的烟草土壤戴氏菌L4-6菌株的主要形态特征和生理生化性质特征为：在大多数培养基上生长良好，在R2A琼脂培养基上，菌落边缘整齐，中间凸起，呈黄色。明胶液化，氧化酶、过氧化氢酶、吐温20，40，60和80 水解呈阳性，淀粉水解、纤维素水解，酪蛋白水解呈阴性，不产生硫化氢，不产生黑色素。能利用麦芽糖、海藻糖、纤维二糖、乳糖、甘露糖、甘油、天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸。细胞膜的极性脂成分主要包括磷脂酰甘油、双磷脂酰甘油和磷脂酰乙醇胺，细胞的呼吸醌为泛醌-8(Q-8)。
本发明所分离得到的烟草土壤戴氏菌L4-6的16S rDNA基因核苷酸序列如序列表所示，该序列已递交国际核苷酸序列数据库(GenBank)，序列检索号： MF370623。
本发明第二方面涉及一种分离、培养和鉴别如本发明第一方面所述的烟草土壤戴氏菌L4-6的方法，包括以下步骤：
a、从自然环境中取土壤样品，加无菌水，摇床振荡，加无菌水继续稀释并涂布于LB平板培养基上进行培养，挑选单菌落，纯化，得到分离的微生物菌液，加入甘油、置于冰箱中备用；
b、将步骤a分离的微生物菌液接种到LB液体培养基中，摇床振荡，培养至菌液浓度为光密度OD＝2.0，制得种子液；
c、将步骤b制得的种子液接种在筛选培养基中，摇床振荡，筛选产生香气的微生物，构建系统发育树进行分子鉴别。
上述分离、培养和鉴别如本发明第一方面所述的烟草土壤戴氏菌L4-6的方法，步骤a中的土壤样品取自云南昆明烟草种植基地。
上述分离、培养和鉴别如本发明第一方面所述的烟草土壤戴氏菌L4-6的方法，步骤a中LB平板培养基的组成如下：每950mL双蒸水(ddH2O)中加入胰蛋白胨10g；酵母提取物5g；氯化钠10g；调节PH至7.0，定容至1000mL，再加入琼脂粉15g，121℃，20min高压灭菌，待冷却至50-60℃时，倒制平板。
上述分离、培养和鉴别如本发明第一方面所述的烟草土壤戴氏菌L4-6的方法，步骤a中摇床振荡温度为30℃，振荡速度180rpm，振荡时间30min，用无菌水稀释至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5倍，在LB平板培养基上的培养温度为 30℃，培养时间48h，甘油的加入量为分离的微生物菌液体积的20％，冰箱温度为-80℃。
上述分离、培养和鉴别如本发明第一方面所述的烟草土壤戴氏菌L4-6的方法，步骤b中LB液体培养基的组成如下：每950ml双蒸水(ddH2O)中加入胰蛋白胨10g；酵母提取物5g；氯化钠10g；调节PH至7.0，定容至1000mL，121℃， 20min高压灭菌。
上述分离、培养和鉴别如本发明第一方面所述的烟草土壤戴氏菌L4-6的方法，步骤b中摇床振荡温度为30℃，振荡速度160rpm；步骤c中摇床振荡温度为30℃，振荡速度160rpm，振荡时间3-5天。
上述分离、培养和鉴别如本发明第一方面所述的烟草土壤戴氏菌L4-6的方法，步骤c中筛选培养基为R2A液体培养基，组成如下：葡萄糖0.5g；酵母膏 0.5g；蛋白胨0.5g；酸水解酪蛋白0.5g；可溶性淀粉0.5g；丙酮酸钠0.3g；磷酸氢二钾0.3g；硫酸镁0.05g；蒸馏水1000ml，pH7.2。
本发明第三方面涉及一种利用本发明第一方面所述的烟草土壤戴氏菌L4-6 发酵制备生物香料的方法，其特征在于，包括如下步骤：
将烟草土壤戴氏菌L4-6扩大培养后接种于发酵培养基中，28℃下摇瓶培养 6天，用乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，浓缩后所得澄清红棕色液体，即为生物香料。
本发明第四方面涉及一种利用本发明第一方面所述的烟草土壤戴氏菌L4-6 发酵香原料植物以制备香原料的方法，包括如下步骤：
a、烟草土壤戴氏菌L4-6的活化培养：将烟草土壤戴氏菌L4-6接种到发酵培养基中，烟草土壤戴氏菌L4-6的接种量为发酵培养基的10％，pH7.2，28℃下摇瓶培养6天，得到烟草土壤戴氏菌L4-6活化菌液；
b、将香原料植物干燥粉碎，加入15～22倍蒸馏水，灭菌；
c、将步骤a制得的烟草土壤戴氏菌L4-6活化菌液接种到步骤b的香原料植物中，烟草土壤戴氏菌L4-6活化菌液的接种量为步骤b中所加入的蒸馏水的 1.5％～2.5％，28℃下摇瓶培养6天，得到发酵液；
d、将步骤c制得的发酵液在50～80℃下加热回流1～3h，得到提取液；
e、步骤d制得的提取液抽滤得到滤液，滤液离心，取上清液，减压浓缩成浸膏，即得香原料。
上述利用本发明第一方面所述的烟草土壤戴氏菌L4-6发酵香原料植物以制备香原料的方法，发酵培养基的组成如下：大豆粉10g，葡萄糖10g，蛋白胨3g，氯化钠2.5g，碳酸钙2g，蒸馏水1000mL。
本发明具有以下有益效果：
(1)本发明首次从云南昆明烟草种植基地烟草土壤样品中分离得到新的试验菌种L4-6，经形态学、生理生化性质和16S rDNA分析表明该菌株是一种新的细菌，微生物学分类命名为烟草土壤戴氏菌Dyellatabacisoli L4-6；
(2)本发明从土壤中分离得到的烟草土壤戴氏菌L4-6，其发酵提取物具有特殊香气，加入卷烟产品中，具有增加烟香、柔和烟气，增加细腻性，降低刺激性，明显改善烟气质的作用，适合卷烟加香；
(3)本发明从土壤中分离得到的烟草土壤戴氏菌L4-6，可用于对香原料植物进行发酵，所得到的发酵产物具有提高香原料植物提取物品质的作用。
附图说明
图1为本发明烟草土壤戴氏菌L4-6在R2A培养基上的电镜照片；
图2为本发明烟草土壤戴氏菌L4-6及部分相关菌株依据16S rDNA基因序列构建的系统发育树。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
实施例1
1.烟草土壤戴氏菌L4-6的分离、培养与鉴定
1.1烟草土壤戴氏菌L4-6的分离
从云南昆明烟草种植基地取烟草土壤样品，塑料袋密封带回，4℃保存待用。准确称取10g土样，加入90mL无菌水，30℃、180rpm摇床震荡30min；用无菌水将浓度稀释至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5倍，将5个浓度的菌液分别取0.2mL 涂布于LB平板培养基上，每个浓度的菌液设置3个平行试验，30℃下培养48h，从每份土样的平板上挑取不同单菌落，在LB平板培养基上纯化后按菌液体积 20％加入甘油、置于-80℃冰箱保存备用。
将分离得到的微生物分别接种于LB液体培养基中，30℃、160rpm摇床振荡培养，培养至菌液浓度为OD＝2.0，作为种子液备用。将每一个待测菌株的种子液按1％接种在筛选培养基中，于30℃、160rpm摇床振荡培养3-5天，每天观察发酵液外观和香气变化情况，筛选得到能够产生香气的微生物，编号L4-6。
1.2烟草土壤戴氏菌L4-6的鉴定
对分离纯化的菌株L4-6进行形态学、生理生化性质和16S rDNA分析，鉴定结果表明属于烟草土壤戴氏菌，其微生物学分类命名为烟草土壤戴氏菌(拉丁文学名：Dyellatabacisoli L4-6)。
烟草土壤戴氏菌L4-6在R2A培养基上的电镜照片如附图1所示。
烟草土壤戴氏菌L4-6在大多数培养基上生长良好，在R2A琼脂培养基上，菌落边缘整齐，中间凸起，呈黄色。明胶液化，氧化酶、过氧化氢酶、吐温20， 40，60和80水解呈阳性，淀粉水解、纤维素水解，酪蛋白水解呈阴性，不产生硫化氢，不产生黑色素。能利用麦芽糖、海藻糖、纤维二糖、乳糖、甘露糖、甘油、天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸。细胞膜的极性脂成分主要包括磷脂酰甘油、双磷脂酰甘油和磷脂酰乙醇胺，细胞的呼吸醌为泛醌-8(Q-8)。
烟草土壤戴氏菌L4-6的生理生化特征如表1所示：
表1烟草土壤戴氏菌L4-6的生理生化特征
Figure BDA0001803990310000051
Figure BDA0001803990310000061
注：“+”表示结果为阳性，“-”表示结果为阴性
烟草土壤戴氏菌L4-6的碳氮利用情况如表2所示：
表2烟草土壤戴氏菌L4-6的碳氮源利用情况
碳源利用 结果 碳源或氮源利用 结果
糊精 + N-乙酰-D-葡糖胺 +
麦芽糖 + 甘露醇 +
海藻糖 + 果糖 +
纤维二糖 + 半乳糖 +
蔗糖 - 鼠李糖 -
棉子糖 - 丙氨酸 -
蜜二糖 + 组氨酸 +
注：“+”表示结果为阳性，“-”表示结果为阴性
烟草土壤戴氏菌L4-6的16S rDNA部分序列如附图说明所示，该序列与 GenBank数据库中的已知序列进行BLAST比较分析，并从数据库获得相关种属的16S rDNA基因序列，构建系统发育树，见附图2。经比较分析发现，本发明的烟草土壤戴氏菌L4-6与菌株(Dyellasoli JS12-10T)亲缘关系最近，在系统进化树上形成独立的分枝，综合形态、生理生化、细胞化学和系统进化分析等特征，两者又有明显差距，表明本发明的烟草土壤戴氏菌L4-6是一个新物种，命名为 Dyellatabacisoli。
烟草土壤戴氏菌L4-6在GenBank数据库的16S rDNA基因核苷酸序列登录号为MF370623，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为 CGMCC1.16273。烟草土壤戴氏菌L4-6及相关种属的16S rDNA基因序列构建的系统发育树如附图2所示。
实施例2
烟草土壤戴氏菌L4-6发酵液生物香料的制备
1.烟草土壤戴氏菌L4-6(D.tabacisoli L4-6)的培养
(1)试管斜面培养
采用斜面保藏培养基，培养基为R2A琼脂培养基，培养基的配方为：葡萄糖 0.5g，酵母膏0.5g，蛋白胨0.5g，酸水解酪蛋白0.5g，可溶性淀粉0.5g，丙酮酸钠0.3g，磷酸氢二钾0.3g，硫酸镁0.05g，琼脂15g，蒸馏水定容到1000mL，pH7.2。将培养基在121℃下灭菌25分钟，摆成斜面，接种烟草土壤戴氏菌L4-6菌株， 28℃下培养1周，获得试管菌种；
(2)种子培养
采用种子培养基，种子培养基的配方为：糊精120g，大豆粉40g，酵母膏2g，色氨酸0.5g，β-丙氨酸5g，硫酸镁0.5g，磷酸铵0.2g，蒸馏水定容到1000mL， pH7.2。将培养基在121℃下灭菌25分钟，从步骤(1)的试管斜面上挑取部分菌丝体接入种子液中，28℃摇瓶培养36h，获得液体菌种；
(3)发酵培养
取5L发酵培养基，培养基的配方为：大豆粉10g；葡萄糖10g；蛋白胨3g；氯化钠2.5g；碳酸钙2g；蒸馏水1000mL，pH7.2。将培养基在121℃下灭菌30min，将步骤(2)中的液体菌种按10％的接种量接到发酵培养基中，摇瓶培养6天，培养温度为28℃，得到发酵液。
2.发酵液生物香料的制备和评价
(1)发酵提取液生物香料的制备
将发酵液用3L乙酸乙酯进行萃取，连续萃取3次，合并萃取液，并于50℃、 0.06MPa条件下进行减压浓缩，最后得到一种带香味的澄清红棕色液体，即为所需生物香料，其理化指标如表3所示。
(2)发酵液生物香料的评价
将发酵液生物香料用微量喷雾器按0.2‰的量均匀地喷加在烟丝上。对照组加入等量蒸馏水，将加香烟丝和对照烟丝卷制成烟支，放入恒温恒湿箱内，在湿度60％±2，温度22℃±2条件下平衡24h后，由评吸专家组成的评吸小组进行感官评吸。如表4所示，与对照卷烟相比，加香烟丝具有较为特殊的香气，说明该发酵液生物香料具有增加烟香、柔和烟气，增加细腻性，降低刺激性，明显改善烟气质的作用，效果稳定而持久。
表3烟草土壤戴氏菌L4-6发酵生物香料的理化指标
序号 检测项目 烟草土壤戴氏菌L4-6发酵生物香料
1 相对密度 1.1426±0.008
2 折光指数 1.3642±0.008
3 澄清度 澄清
4 挥发性成分总量(％) 41.5
5 乙醇中的溶混度(25℃) 不溶于水，可溶于60％-95％乙醇溶液
6 Pb <5mg/kg
7 As <1mg/kg
8 香豆素 未检出
9 黄樟素 未检出
表4烟草土壤戴氏菌L4-6发酵生物香料的感官评吸表
Figure BDA0001803990310000081
实施例3
烟草土壤戴氏菌L4-6对香原料植物的发酵实验，包括如下步骤：
(1)烟草土壤戴氏菌L4-6的培养方法同实施例2的步骤1，得到发酵液；
(2)将甘草干燥后粉碎，过40目筛，称取甘草粉末200g，加入4L蒸馏水 (20倍体积)，灭菌，备用；
(3)将步骤(1)中制备的烟草土壤戴氏菌L4-6发酵液80mL接种于步骤 (2)中的甘草物料中(接种量为步骤(2)中所加入的蒸馏水2％)，28℃摇瓶培养6天，得到甘草发酵液；
(4)将甘草发酵液在60℃下进行加热回流提取2h，得到回流提取液；
(5)回流提取液趁热抽滤，滤液再经8000r/min的离心机离心10分钟，取上清液，50℃减压浓缩成浸膏，即所需甘草发酵提取物。
(6)甘草发酵提取物产品特征及理化性质
本产品为不澄清的深褐色膏体，产品理化性质见表5。
(7)甘草发酵提取物的评价
将甘草发酵提取物用微量喷雾器按0.2‰的量均匀地喷加在烟丝上。对照组不添加步骤(1)的发酵液，直接按照步骤2、4、5操作得到甘草提取物，用微量喷雾器按0.2‰的量均匀地喷加在烟丝上，将甘草发酵提取物喷涂的烟丝和对照组烟丝卷制成烟支，放入恒温恒湿箱内，在湿度60％±2，温度22℃±2条件下平衡 24h，由评吸专家组成的评吸小组进行感官评吸。如表6所示，与对照卷烟相比，喷涂甘草发酵提取物卷制成的卷烟样品，抽吸时具有特殊的香气，烟香更加明显、烟气更加柔和丰富，刺激性明显降低。
表5甘草发酵提取物的理化指标
序号 检测项目 甘草发酵提取物
1 相对密度 1.1532±0.008
2 折光指数 1.4152±0.008
3 澄清度 不澄清
4 挥发性成分总量(％) 42.6
5 乙醇中的溶混度(25℃) 可溶于水，不溶于50％-95乙醇溶液
6 Pb <5mg/kg
7 As <1mg/kg
8 香豆素 未检出
9 黄樟素 未检出
表6甘草发酵提取物的感官评吸表
Figure BDA0001803990310000101
实施例4
为考察烟草土壤戴氏菌L4-6用于制备发酵液生物香料的独特性，实施例4 做出如下调整：
实施例4和实施例2的区别在于，以烟草土壤戴氏菌L4-6的亲缘菌种Dyella soliJS12-10(购自韩国农业微生物菌种保藏中心(KACC))代替烟草土壤戴氏菌L4-6制备发酵液生物香料，其余操作步骤同实施例2中步骤1及步骤2(1)，得到一种淡黄色液体，即为所需制备的发酵液。通过嗅香发现，该发酵液并不带香味。将该发酵液用微量喷雾器按0.2‰的量均匀地喷加在烟丝上，卷制成烟支，放入恒温恒湿箱内，在湿度60％±2，温度22℃±2条件下平衡24h后，由评吸专家组成的评吸小组进行感官评吸。与实施例2中由烟草土壤戴氏菌L4-6所制备的发酵液生物香料卷制的卷烟相比，用Dyella soli JS12-10制备得的发酵液，无增加烟香、柔和烟气，改善烟气质的作用，且还会引入杂气。
实施例5
为考察烟草土壤戴氏菌L4-6用于制备发酵液生物香料的独特性，实施例5 做出如下调整：
实施例5和实施例3的区别在于，以烟草土壤戴氏菌L4-6的亲缘菌种Dyella soliJS12-10(购自韩国农业微生物菌种保藏中心(KACC))代替烟草土壤戴氏菌L4-6用于发酵香原料植物——甘草，其余操作步骤同实施例3中步骤(1)～ (5)，得到一种不澄清的深褐色膏体，即为所需经Dyella soli JS12-10发酵的甘草提取物。将经Dyella soli JS12-10发酵的甘草提取物用微量喷雾器按0.2‰的量均匀地喷加在烟丝上，卷制成烟支，放入恒温恒湿箱内，在湿度60％±2，温度 22℃±2条件下平衡24h，由评吸专家组成的评吸小组进行感官评吸。与实施例 3中经烟草土壤戴氏菌L4-6发酵的甘草提取物相比，用Dyella soliJS12-10制备得的甘草提取物，其增加烟香作用较弱，无特殊香气，且杂气增加，喉部刺激性较大。由此可见，虽是亲缘菌种，但菌种Dyella soli JS12-10用于制备发酵液生物香料及用于制备甘草提取物，并不能取得与烟草土壤戴氏菌L4-6类似的效果。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 云南中烟工业有限责任公司
段焰青 刘秀明 党立志 张玲 刘娟 焦俊 张翼鹏
<120> 一种烟草土壤戴氏菌及其分离方法和应用
<130> RIB180319
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1508
<212> DNA
<213> 烟草土壤戴氏菌(Dyellatabacisoli L4-6)
<400> 1
agagtttgat cctggctcag attgaacgct ggcggcatgc ctaacacatg caagtcgaac 60
ggcagcacag cagtagcaat actgtgggtg gcgagtggcg gacgggtgag taatgcatcg 120
ggacctacct agacgtgggg gataacgtag ggaaacttac gctaataccg catacgtcct 180
acgggagaaa gcgggggatc ttcggacctc gcgcggttag acggaccgat gttcgattag 240
ctagttggta gggtaatggc ctaccaaggc gacgatcgat agctggtctg agaggatgat 300
cagccacact ggaactgaga cacggtccag actcctacgg gaggcagcag tggggaatat 360
tggacaatgg gcgcaagcct gatccagcaa tgccgcgtgt gtgaagaagg ccttcgggtt 420
gtaaagcact tttatcagga gcgaaatgcc attggctaat acccggtgga gctgacggta 480
cctgaggaat aagcaccggc taacttcgtg ccagcagccg cggtaatacg aagggtgcaa 540
gcgttaatcg gaattactgg gcgtaaagcg tgcgtaggcg gttcgttagg tccgtcgtga 600
aatccccggg ctcaacctgg gaatggcgat ggatactggc gagctagagt gtgatagagg 660
atggtggaat tcccggtgta gcggtgaaat gcgtagagat cgggaggaac atcagtggcg 720
aaggcggcca tctggatcaa cactgacgct gaggcacgaa agcgtgggga gcaaacagga 780
ttagataccc tggtagtcca cgcccccaaa cgatgcgaac tggatgttgg tctcaactcg 840
gagatcagtg tcgaaagcta acgcgttaag ttcgccgcct ggggagtacg gtcgcaagac 900
tgaaactcaa aggaattgac gggggcccgc acaagcggtg gagtatgtgg tttaattcga 960
tgcaacgcga agaaccttac ctggccttga catgtctgga atcctgcaga gatgcgggag 1020
tgccttcggg aatcagaaca caggtgctgc atggctgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg 1080
ttgggttaag tcccgcaacg agcgcaaccc ttgtccttag ttgccagcac gtaatggtgg 1140
gaactctaag gagactgccg gtgacaaacc ggaggaaggt ggggatgacg tcaagtcatc 1200
atggccctta cggccagggc tacacacgta ctacaatggt cggtacagag ggttgcaata 1260
ccgcgaggtg gagccaatcc cagaaagccg atcccagtcc ggatcgtagt ctgcaactcg 1320
actacgtgaa gtcggaatcg ctagtaatcg cggatcagct atgccgcggt gaatacgttc 1380
ccgggccttg tacacaccgc ccgtcacacc atgggagtga gttgctccag aagccgttag 1440
tctaaccgca agggggacga cgaccacgga gtggttcatg actggggtga agtcgtaaca 1500
aggtaacc 1508

Claims (4)

1.一种烟草土壤戴氏菌，其特征在于，其微生物学分类命名为戴氏菌Dyella sp，已于2018年6月19日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC1.16273。
2.一种利用权利要求1所述的烟草土壤戴氏菌发酵制备生物香料的方法，其特征在于，包括如下步骤：将烟草土壤戴氏菌扩大培养后接种于发酵培养基中，28℃下摇瓶培养6天，用乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，浓缩后所得澄清红棕色液体，即为生物香料。
3.一种利用权利要求1所述的烟草土壤戴氏菌发酵香原料植物以制备香原料的方法，其特征在于，包括如下步骤：
a、烟草土壤戴氏菌的活化培养：将烟草土壤戴氏菌接种到发酵培养基中，烟草土壤戴氏菌的接种量为发酵培养基的10％，pH7.2，28℃下摇瓶培养6天，得到烟草土壤戴氏菌活化菌液；
b、将香原料植物干燥粉碎，加入15～22倍蒸馏水，灭菌；
c、将步骤a制得的烟草土壤戴氏菌活化菌液接种到步骤b的香原料植物中，烟草土壤戴氏菌活化菌液的接种量为步骤b中所加入的蒸馏水的1.5％～2.5％，28℃下摇瓶培养6天，得到发酵液；
d、将步骤c制得的发酵液在50～80℃下加热回流1～3h，得到提取液；
e、步骤d制得的提取液进行抽滤，得到滤液，滤液离心，取上清液，减压浓缩成浸膏，即得香原料。
4.根据权利要求3所述的烟草土壤戴氏菌发酵制备香原料的方法，其特征在于，发酵培养基的组成如下：大豆粉10g，葡萄糖10g，蛋白胨3g，氯化钠2.5g，碳酸钙2g，蒸馏水1000mL。
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CN115537267B (zh) * 2022-09-21 2024-03-29 云南中烟工业有限责任公司 一种植物香料、其制备方法及用途

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102482658A (zh) * 2009-08-21 2012-05-30 诺维信公司 具有异淀粉酶活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸
CN107686823A (zh) * 2017-09-30 2018-02-13 南京农业大学 一种降低叶菜中重金属含量的植物促生细菌及其应用

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Qing-Qing Li等.Dyella tabacisoli sp. nov., a bacterium isolated from an arable soil sample of Nicotiana tabacum L..《TAXONOMIC DESCRIPTION》.2019, *

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