CN102505002B - 一种用于烤烟快速增香的微生物菌株及烟叶发酵的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种新的烟叶快速增香菌株，该烟叶快速增香菌株命名为芽孢杆菌LBT1.0003（Bacillus sp. LBT1.0003），在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC No.5331。该菌株由醇化烟叶表面分离筛选获得，具有易培养、增香效果好、发酵速度快，该菌株用于烤烟烟叶发酵后，烤烟理化指标（如总糖、还原糖、钾等）明显改善。评吸结果表明，经该微生物处理后，烟叶的吸食品质改善明显，烟气浓度增加，香气量增加，香气柔和细腻，有陈烟气息，刺激、辣感少。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，涉及一种菌株，具体涉及一种用于烤烟快速增香的芽孢杆菌（Bacillus sp.）及其分离、培养及用于烤烟烟叶发酵的应用。
背景技术
卷烟工业中，烟叶的自然醇化（或称陈化）过程是改善烟叶品质的重要环节。烟叶醇化包括人工发酵和自然醇化，但目前人工发酵改善烟叶香气与吸食品质的效果远不及自然醇化。在这个过程中，微生物起到至关重要的作用。在烟叶自然醇化或人工发酵过程中，某些微生物菌株主要作用于烟叶内的特定化学物质(糖和蛋白质)，微生物对糖的作用主要是将糖降解为醇类、酯类、醛类、酮类及各种有机酸等多种低分子香味物质，从而使烟叶香气得到改善。对蛋白质的作用主要是将蛋白质降解为氨基酸，协调烟叶因蛋白质过多而产生刺激性气味。总之，微生物发酵烟叶的过程比较复杂，而且酶促作用、微生物作用和化学作用密切相关协同进行，其中微生物作用既有酶的催化作用又有化学作用，使底物发生分解、降解、氧化、还原、聚合、偶联、转化等复杂的生化反应，最后形成低分子香气物质。根据对烤烟叶面微生物种类的研究分析，许多烟叶叶面微生物可能是加速烟叶自然发酵过程中物质转化和品质改良的生物催化剂。
在自然发酵过程中，烟叶中大分子化合物的降解和呈香物质的生成等均优于人工发酵过程，而且对提高烟叶香气与吸味品质的效果明显好于人工发酵。然而，自然发酵的烟叶贮存周期较长、场地占用大、资金占压多并导致生产成本增高，且在长期贮存过程中容易发生虫害和霉变。与自然发酵相比，人工发酵能够在可控条件下提高烟叶品质，并可大大缩短发酵时间，但发酵后烟叶品质改善效果不如自然发酵，因而，改善人工发酵过程，使其接近自然发酵过程成为烟草行业的一个热点研究领域。
原烟和低等级烟叶在品质上存在着较大的缺陷，如在吃味方面表现为粗糙、苦、辣、涩及滞吞等；在气味方面表现为香气量少、香气质差、杂气和青杂气较多、刺激性较大，烟叶色泽及燃烧性也不符合要求等。因此，改善原烟和低等级烟叶的可用性，是提高烟叶使用品质、降低生产成本的关键。
然而，目前能够用于烤烟快速增香和醇化的微生物菌株报道较少，还存在增香效果不明显，发酵时间长，技术应用复杂，难以培养等问题，远不能满足卷烟工业发展的实际需求，寻求一种可显著改善烟叶品质，并能实现快速醇化的微生物菌株是本领域技术人员所期望的。
目前，从烟叶表面分离筛选增香微生物是获得烟叶人工发酵菌株的有效途径。近年来，从烟叶表面筛选微生物并用于烟叶的人工发酵过程的报道日渐增多。Dawson认为嗜热性放线菌在非常低的湿度下的醇化烟叶中生长缓慢，但可使醇化烟叶产生一种令人愉悦的香气，尤其是水果香味。English等从发酵烟叶上分离出嗜热细菌，包括Bacillussubtilis, B. coagulans，B. megaterium, B. cirulans，这些菌株单独或混合用于烟叶，都可产生宜人的香气。Jusikui 报道烟叶储藏期接种一种细菌悬浮液可提高烟叶香气。Inglixy报道用枯草芽孢杆菌（B. subtills）接种于贮藏期烟叶，烟叶香气明显提高。陈福星等用从烤烟烟叶上分离的4个细菌菌株（均为芽孢杆菌）处理烟叶，结果发现，发酵处理过的烟叶均比自然醇化的香气浓，大大缩短了发酵时间，并且使烟叶品质及色香味均有一定程度的改善和提高。罗家基等的研究也证实，微生物发酵烟叶能提高烟叶等级质量。谢和等研究表明，将烟叶表面的优势菌（芽孢杆菌）接种到烤烟烟叶上，可明显提高烟叶香气和改善烟叶品质。赵铭钦等利用4种优势增香菌和淀粉酶、蛋白酶等配制成的烟草发酵增质剂对人工发酵和自然醇化的烤烟烟叶进行增质、增香效果研究，结果发现烟草发酵增质剂具有促进烟叶内部固有有机物质的分解和转化、加速烟叶发酵进程、缩短发酵周期等优点，与对照相比，经发酵增质剂处理的烟叶香气品质大大改善，香气量明显增加，烟叶固有的杂气和刺激性减轻，烟叶内部的糖、氮、碱等主要化学成分趋于平衡。
发明内容
针对目前报道的烤烟烟叶人工发酵菌株增香效果不显著、发酵周期长等缺陷，本发明目的在于，通过对增香微生物菌株的分离培养获得了一种可实现烟叶快速增香的新的芽孢杆菌，经实验证明，该芽孢杆菌能够用于烤烟烟叶的发酵。
为了实现上述任务，本发明是通过以下技术方案得以实现：
一种烤烟烟叶快速增香菌株，其特征在于，该烤烟烟叶快速增香菌株命名为芽孢杆菌（Bacillus sp.）LBT1.0003，保藏号为CGMCC No.5331。
上述烤烟烟叶快速增香菌株的分离筛选方法，其特征在于，该方法先用无菌生理盐水与1g醇化烟叶混合后，用无菌取样的方法取1mL混合液加入到9mL灭菌生理盐水中制成10－1菌悬液，然后逐级稀释，取10－2、10－3、10－4、10－5、10－6、10－7六个稀释度的菌悬液0.2mL涂布到LB培养基上，37℃恒温培养24h，挑取长势良好，菌落饱满均匀，且稀释度适宜的平板的单菌落，镜检；
LB培养基主要成分为：胰化蛋白胨：1%，酵母提取物：0.5%，NaCl：1%。
镜检若为纯培养单一菌株，则接种于LB斜面固体培养基，37℃恒温培养24h后保藏于4℃冰箱；
LB斜面固体培养基主要成分为：胰化蛋白胨：1%，酵母提取物：0.5%，NaCl：1%；琼脂：2%。
镜检若为混合菌株，则再次在LB培养基平板上进行划线分离，直至镜检为菌株纯培养物后，接种斜面试管，37℃恒温培养24h后保藏于4℃冰箱。
对筛选所得的所有纯培养菌株用于烟叶发酵，并根据烟叶理化性质和评吸结果，最终筛选和确定烤烟快速增香芽孢杆菌。
上述卷烤烟快速增香芽孢杆菌的培养方法，其特征在于，将保藏的烤烟快速增香芽孢杆菌菌株（Bacillus sp.）LBT1.0003从斜面接种2环至100mL的LB液体培养基中，于27℃～37℃，100rpm～180rpm恒温摇床振荡培养12h~36h，得到芽孢杆菌菌株（Bacillus sp.）LBT1.0003发酵液；其中，LB培养基主要成分为：胰化蛋白胨：1%，酵母提取物：0.5%，NaCl：1%；琼脂：2%；
所得到的芽孢杆菌菌株（Bacillus sp.）LBT1.0003发酵液在4℃条件下，以8500r/min～11000r/min离心5min～15min，弃上清液得到湿菌体，进一步得到粉剂或冻干粉，保藏于4℃冰箱备用。
上述烤烟快速增香芽孢杆菌用于烟叶发酵工艺的应用。其应用工艺步骤是：用5mL无菌去离子水将湿菌体、粉剂或冻干粉重悬后，均匀喷洒到55g烟叶上，以等量无菌去离子水为对照，将喷好的烟叶置于27℃～45℃，相对湿度30%～90%条件下发酵36h～60h，烟叶发酵温度范围为：27℃～45℃，相对湿度范围为30%~90%，发酵时间为24-60h；
烟叶发酵后在25℃～180℃条件下烘干2s~48h后，制成1mm烟丝，卷接，进行理化指标测定及感官评定。
本发明得到的烤烟烟叶快速增香菌，具有易培养、增香效果好、发酵速度快，是一株新的烤烟烟叶快速增香菌株。该菌株用于烤烟烟叶发酵后，烤烟理化指标（如总糖、还原糖、钾等）明显改善。评吸结果表明，经该微生物处理后，烟叶的吸食品质改善明显，烟气浓度增加，香气量增加，香气柔和细腻，有陈烟气息，刺激、辣感少。
具体实施方式
为了获得烤烟快速增香的菌株，申请人从烟叶表面分离、筛选，得到了烤烟烟叶快速增香的细菌菌株，该菌株为芽孢杆菌（Bacillus sp.）LBT1.0003，于2011年10月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC No.5331。
以下给出具体的分离筛选和培养过程：
烤烟烟叶快速增香菌株的制备：
本实施例涉及筛选的烤烟烟叶快速增香菌株，是从烟叶表面分离筛选获得，具体包括下列步骤：
（1）烤烟烟叶快速增香菌株的分离与筛选：
从自然醇化3年以上的烟叶表面分离烟叶快速增香菌LBT1.0003，其分离方法是：先用无菌生理盐水与1g醇化烟叶混合后，用无菌取样的方法取1mL混合液加入到9mL灭菌生理盐水中制成10－1菌悬液，然后逐级稀释，取10－2、10－3、10－4、10－5、10－6、10－7六个稀释度的菌悬液0.2mL涂布到LB培养基上，LB培养基主要成分为：胰化蛋白胨：1%，酵母提取物：0.5%，NaCl：1%；37℃恒温培养24h，挑取长势良好，菌落饱满均匀，且稀释度适宜的平板的单菌落，镜检。
若为纯培养单一菌株，则接种于LB斜面固体培养基，37℃恒温培养24h，LB斜面固体培养基主要成分为：胰化蛋白胨：1%，酵母提取物：0.5%，NaCl：1%；琼脂：2%；后保藏于4℃冰箱。
若为混合菌株，则再次在LB培养基平板上进行划线分离，直至镜检为菌株纯培养物后，接种斜面试管，37℃恒温培养24h后保藏于4℃冰箱。
对筛选所得的所有纯培养菌株用于烟叶发酵，并根据烟叶理化性质和评吸结果，最终筛选和确定烤烟快速增香芽孢杆菌。
酵母提取物（yeast extract），也称酵母膏，市售。
（2）烟叶快速增香菌的培养：
将保藏的烤烟快速增香芽孢杆菌（Bacillus sp.）LBT1.0003从斜面接种2环至100mL LB液体培养基中，于37℃，120rpm恒温摇床振荡培养12h~36h，得到芽孢杆菌（Bacillus sp.）LBT1.0003发酵液；其中，LB液体培养基主要成分为：胰化蛋白胨：1%，酵母提取物：0.5%，NaCl：1%；琼脂：2%；所得到的芽孢杆菌菌株（Bacillus sp.）LBT1.0003发酵液在4℃条件下，以8500r/min～11000r/min离心5min～15min，弃上清液得到湿菌体，进一步得到粉剂或冻干粉，保藏于4℃冰箱备用。
（3）烟叶快速增香菌用于烤烟烟叶的发酵：
用5mL无菌去离子水将湿菌体、粉剂或冻干粉重悬后，分别均匀喷洒到55g烟叶上，以等量无菌去离子水为对照，将喷好的烟叶置于37℃，相对湿度80%条件下发酵48h。
（4）烟叶烘干、制丝、卷接和评吸：
烟叶发酵后在25℃～180℃条件下烘干2s~48h后，制成1mm烟丝，卷接，进行理化指标测定及感官评定。经评吸结果表明，经该芽孢杆菌（Bacillus sp.）LBT1.0003发酵处理后，烟叶的吸食品质改善明显，烟气浓度增加，香气量增加，香气柔和细腻，有陈烟气息，刺激、辣感少。
Claims (4)
1.一种烤烟快速增香芽孢杆菌，其特征在于，该烤烟快速增香芽孢杆菌为芽孢杆菌（Bacillus sp.）LBT1.0003，保藏号为CGMCC No.5331。
2.权利要求1所述的烤烟快速增香芽孢杆菌的培养方法，其特征在于，将保藏的烤烟快速增香芽孢杆菌（Bacillus sp.）LBT1.0003从斜面接种2环至100mL的LB液体培养基中，于27℃～37℃，100rpm～180rpm恒温摇床振荡培养12h~36h，得到芽孢杆菌（Bacillus sp.）LBT1.0003发酵液；其中，LB液体培养基主要成分为：胰化蛋白胨：1%，酵母提取物：0.5%，NaCl：1%；琼脂：2%；
所得到的芽孢杆菌（Bacillus sp.）LBT1.0003发酵液在4℃条件下，以8500r/min～11000r/min离心5min～15min，弃上清液得到湿菌体，进一步得到粉剂，保藏于4℃冰箱备用。
3.权利要求1所述的烤烟快速增香芽孢杆菌用于烟叶发酵工艺的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，用5mL无菌去离子水将烤烟快速增香芽孢杆菌的湿菌体重悬后，均匀喷洒到55g烟叶上，以等量无菌去离子水为对照，将喷好的烟叶置于37℃，相对湿度80%条件下发酵48h。
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