CN109749963A - 建立在菌种互作基础上的优良土著复合乳酸菌直投式发酵剂及其强化山西老陈醋生产的方法 - Google Patents

建立在菌种互作基础上的优良土著复合乳酸菌直投式发酵剂及其强化山西老陈醋生产的方法 Download PDF

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本发明属微生物技术领域，提供建立在菌种互作基础上的优良土著复合乳酸菌直投式发酵剂及其强化山西老陈醋生产的方法。宏基因组高通量测序表明植物乳杆菌、戊糖片球菌是山西老陈醋优势乳酸菌，从山西老陈醋发酵过程中筛出高产酸、高产乙偶姻植物乳杆菌和发酵风味佳、挥发性香气含量丰富的戊糖片球菌。在优良土著植物乳杆菌、戊糖片球菌与山西老陈醋发酵过程中的优势酿酒酵母、巴氏醋杆菌进行菌种互作基础上，将植物乳杆菌和戊糖片球菌复配制备成直投式发酵剂强化用于山西老陈醋生产中，得新淋醋中总酸5.32g/100mL，不挥发性酸2.56g/100mL，总酯4.34g/100mL，分别比对照组提高了41.49%、169.47%、46.62%。

Description

建立在菌种互作基础上的优良土著复合乳酸菌直投式发酵剂 及其强化山西老陈醋生产的方法
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及建立在菌种互作基础上的优良土著复合乳酸菌直投式发酵剂及其强化山西老陈醋生产的方法。
背景技术
乳酸菌不仅是国际公认的益生菌，并且是食醋固态酿造中一类重要的功能性微生物，能代谢产生乳酸、乙酸、苹果酸、柠檬酸、琥珀酸等有机酸。乳酸菌产生的有机酸（以乳酸为主）酸性柔和，具有特定的芳香气味，不仅能够缓和食醋中乙酸的刺激性气味，使其口感更加圆润，并且可以提高食醋的品质。
不挥发性酸含量高的食醋口感柔和，刺激性小，而食醋中的不挥发性酸以乳酸为主，主要由乳酸菌产生。因此，近年来，一些学者筛选优良的乳酸菌发酵菌株，将其强化应用在食醋的生产中，以改善食醋的风味和口感。如，天津科技大学夏婷等从山西老陈醋发酵旺盛阶段的醋醅中筛选出具有耐高温、耐酸、高产胞外多糖能力的乳酸菌应用在保健食醋生产中，提高了产品中乳酸含量，改善产品风味和口感，提高了食醋产品中重要生理活性成分的含量，同时也提高了食醋产品抗氧化功能等特点；江南大学余永建从镇江香醋醋酸发酵过程的醋醅中分离筛选出具有高产乳酸、代谢生成甘氨酸、谷氨酸、脯氨酸的特点的L.helveticus M3-1，同时，该菌具有较好的代谢合成3-羟基丁酸乙酯、2-甲基丁酸等食醋风味化合物的能力，在镇江香醋醋酸发酵初始时进行乳酸菌强化接种，结果表明，L.helveticus M3-1菌种的强化可以有效提高醋醅微生物菌群中乳酸菌的相对丰度，并且强化后的食醋产品中乳酸相对含量提高了3.4%，在保持镇江香醋氨基酸等典型风味物质含量的前提下，有效缩短醋酸发酵周期，提升了食醋滋味评分。
食醋发酵的整个过程中，乳酸菌一直是其重要菌群，并且菌种多样性丰富，包含乳杆菌属、乳球菌属、片球菌属等，多种乳酸菌相互适应、互作、共生、接力、协同、优化发酵。而以往关于乳酸菌强化食醋生产研究中，大都采用的是单一菌株，或者并非土著菌，强化菌株与发酵固有的土著优势菌之间的适应、互作、协调关系不清楚，因此强化作用不显著。本发明建立在采用宏基因高通量测序明确山西老陈醋发酵过程中优势乳酸菌种类基础研究数据上，分离筛选出耐受性强、产酸高，发酵风味佳的优良土著乳酸菌，并将其制备成复配直投式发酵剂，应用传统固态食醋生产中。
发明内容
本发明提供了建立在菌种互作基础上的优良土著复合乳酸菌直投式发酵剂及其强化山西老陈醋生产的方法。
本发明由如下技术方案实现的：建立在菌种互作基础上的优良土著复合乳酸菌直投式发酵剂，所述的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）、戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus），保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心( CGMCC )，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号分别为：CGMCC 15731、CGMCC 16912，保藏日期分别为：2018年5月7日，2018年12月10日；所述酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）CGMCC 15729、巴氏醋杆菌（Acetobacter pasteurianus）CGMCC 15730，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心( CGMCC )，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号分别为：CGMCC 15729、CGMCC 15730，保藏日期为：2018年5月7日。
所述复配直投式发酵剂的具体制备方法为：将植物乳杆菌CGMCC 15731、戊糖片球菌CGMCC 16912按照3%的接种量分别接入到MRS液体培养基，37℃静置培养24h，待培养液的菌体浓度均达到108cfu/mL后，采用中空纤维膜浓缩，发酵液分别浓缩至原体积的1/5后添加无菌的保护剂混合，浓缩发酵液与保护剂的体积比为1:3 v:v，以进风温度为120℃，出风温度为55℃低温喷雾干燥，至水分含量为≤5%时，将植物乳杆菌CGMCC 15731、戊糖片球菌CGMCC 16912干粉按质量比1:1混合即为复配直投式发酵剂，其活菌数为1011cfu/g，阴凉干燥条件下贮存期为一年。
所述优良土著植物乳杆菌CGMCC 15731、戊糖片球菌CGMCC 16912的筛选方法具体步骤如下：
（1）采用宏基因组高通量测序技术明确乳酸菌在山西老陈醋发酵过程中的动态变化：采集山西老陈醋酒精发酵(AF)第0、1、2、3、5、7、 9、11、13、15天的酒醪样品和醋酸发酵(AAF)第0、1、3、5、7、9、11天的醋醅样品，进行宏基因组提取，细菌16S rDNA V4区DNA片段扩增，采用MiSeq 2000测序平台进行测序分析；并采用传统稀释平板菌落计数法，采用MRS培养基对山西老陈醋发酵过程中乳酸菌的数量变化进行了测定。结果显示植物乳杆菌和戊糖片球菌为山西老陈醋发酵过程中的优势乳酸菌。
（2）耐受性强、产酸高、产乙偶姻能力强的优良土著风味乳酸菌的筛选：对山西老陈醋发酵过程中分离出的100株乳酸菌进行产酸性能、产乙偶姻能力的测定；并采用HPLC和GC-MS法对优良菌株的有机酸和挥发性香气成分的种类的含量进行了系统测定，以及进行酒精度、酸、初始糖度、温度的耐受性的测定。最终筛选出的乳酸菌7产酸（24.78g/L）和乙偶姻（20.84g/L）含量高，乳酸菌2422的发酵风味佳、挥发性香气成分和含量丰富；这2株菌均耐受10%的酒精度、250g/L的初始糖度、pH=4的酸度、50℃的温度。
（3）优良乳酸菌7和乳酸菌2422的鉴定：对乳酸菌7和乳酸菌2422进行形态学和16SrDNA测序鉴定，采用的引物为：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’和下游：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’，经鉴定为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）、戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）。将其保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心( CGMCC )，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期分别：2018年5月7日，2018年12月10日，保藏编号分别为：CGMCC 15731、CGMCC 16912。
山西老陈醋优良土著植物乳杆菌CGMCC 15731、戊糖片球菌CGMCC 16912与山西老陈醋发酵过程中的优势酿酒酵母CGMCC 15729、巴氏醋杆菌CGMCC 15730之间的互作方法为：将培养好的植物乳杆菌CGMCC 15731、戊糖片球菌CGMCC 16912、酿酒酵母CGMCC 15729和巴氏醋杆菌CGMCC 15730，分别以1:1的比例接入高粱汁或醋醅模拟培养基，培养6d后测其菌株生物量，考察之间有无抑制作用。实验结果表明植物乳杆菌CGMCC 15731、戊糖片球菌CGMCC 16912、酿酒酵母CGMCC 15729和巴氏醋杆菌CGMCC 15730之间在生物量上无明显抑制作用。
利用所述的建立在菌种互作基础上的优良土著复合乳酸菌直投式发酵剂及其强化山西老陈醋生产的方法，具体步骤为：
高粱粉碎至四至六瓣100公斤高粱加入60‒70公斤50‒55℃水润料12h，将润好的高粱蒸2h，无夹心不粘手时停火；再加入300公斤80℃的水，搅拌均匀浸料，温度降至25‒33℃时拌入60公斤大曲，再加入高粱重量0.8%的复配直投式发酵剂（1g直投式发酵剂溶解到10mL无菌水中，37℃活化30min后备用），搅拌均匀后输送到酒精发酵罐中，控制发酵罐中温度为25‒33℃，酒精发酵8‒10天，前2天为敞口发酵，之后为封口发酵，酒精度为6%时，加入150公斤麸皮和100公斤的谷糠，搅拌均匀，加入10公斤火醅（前一批发酵第2天的醋醅），再加入高粱重量0.8%的复配直投式发酵剂，控制发酵罐中温度为24‒47℃进行醋酸发酵10‒12天，酸度为4.66g/100g时，加入10公斤食盐，停止发酵，经熏醅、淋醋环节得新淋醋，测定新淋醋的理化指标，有机酸及挥发性香气成分。
所述无菌保护剂配方为：A：脱脂奶粉10 g，蒸馏水100 mL，115 ℃灭菌15 min；B：海藻糖1.5 g、甘油0.5 g、山梨醇2 g、麦芽糊精1 g、蒸馏水100 mL，121 ℃灭菌15 min；A和B分别灭菌后，冷却至室温混合即为保护剂。
采用复配直投式发酵剂强化应用在山西老陈醋生产中，得到的新淋醋中总酸含量为5.32g/100mL，不挥发性酸含量达2.56g/100mL，总酯含量为4.34g/100mL，分别比对照组提高了41.49%、169.47%、46.62%，并且还丰富了有机酸和挥发性香气的谱图及含量。
本发明建立在采用宏基因组高通量测序技术研究山西老陈醋发酵过程乳酸菌群落变化的数据基础上，采用传统菌种分离手段，对发酵过程中的优势乳酸菌进行分离和筛选，最终优选出1株植物乳杆菌和1株戊糖片球菌，对这2株优良土著乳酸菌和巴氏醋杆菌、酿酒酵母进行了充分的种间互作研究后，将其进行高密度培养，喷雾干燥制成复配直投式发酵剂，强化应用在传统固态食醋的生产中，对山西老陈醋的提质增效具有重要意义。
附图说明
图1为采用宏基因组高通量测序技术测定山西老陈醋发酵过程中乳酸菌属水平上的动态变化；
图2为采用宏基因组高通量测序技术测定山西老陈醋发酵过程中乳酸菌种水平上的动态变化；
图3为山西老陈醋发酵过程中乳酸菌数量的变化；
图4为植物乳杆菌CGMCC 15731、戊糖片球菌CGMCC 16912的菌落形态和细胞形态图；图中：A为植物乳杆菌CGMCC 15731的菌落形态图；a为植物乳杆菌CGMCC 15731在1000×下的细胞形态图；B为戊糖片球菌CGMCC 16912的菌落形态图；b为戊糖片球菌CGMCC 16912在1000×下的细胞形态图；
图5为植物乳杆菌CGMCC 15731、戊糖片球菌CGMCC 16912的16S rDNA系统发育树图；
图6为植物乳杆菌CGMCC 15731、戊糖片球菌CGMCC 16912、酿酒酵母CGMCC 15729和巴氏醋杆菌CGMCC 15730在高粱或醋醅培养基上互作之间的生物量；图中：A为植物乳杆菌CGMCC 15731的生物量；B为戊糖片球菌CGMCC 16912的生物量；C为酿酒酵母CGMCC 15729的生物量；D为巴氏醋杆菌CGMCC 15730的生物量。
具体实施方式
下面通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步说明。
实施例1：采用宏基因组高通量测序技术测定乳酸菌在山西老陈醋发酵过程中的动态变化：
分别采集某山西老陈醋生产车间老陈醋酒精发酵(AF)第0、1、2、3、5、7、 9、11、13、15天的酒醪样品和醋酸发酵(AAF)第0、1、3、5、7、9、11天的醋醅样品，进行宏基因组提取，细菌16S rDNA V4区DNA片段扩增，采用MiSeq 2000测序平台进行测序分析；并采用传统稀释平板菌落计数法，采用MRS培养基对山西老陈醋发酵过程中乳酸菌的数量变化进行了测定。
上述的宏基因组提取方法为：取3g样品置-20℃预冷研钵中，加入液氮快速研磨至细粉状后移至2 mL离心管；加入2mL抽提缓冲液 (1g/100mL的CTAB、2g/100mL的PVPP、8.78g/100mL的NaCl、3.73g/100mL的EDTA-Na、1.21g/100mL的Tris、0.1mol/L的磷酸缓冲液)，37℃，200r/min条件下充分混匀30min；加入200µL 10g/100mL的SDS，65℃水浴2h，12000r/min，低温离心15min，取上清，冷却至4℃；加入等体积的酚-氯仿-异戊醇(V/V/V=25:24:1)，12000r/min，低温离心20min，取上清，重复3-4次，直至中间蛋白层消失；加入等体积的氯仿-异戊醇混合液(V/V=24:1)，12000r/min，低温离心15min，取上清；加入0.7倍体积的异丙醇，-20℃沉淀4h，12000r/min，低温离心15min，取沉淀；用预冷的70%乙醇充分漂洗沉淀，置于室温待乙醇挥发完全后，溶于80µLddH2O中；加入5µL 1mg/mL RNase A，37°C水浴20min。提取的DNA用微量紫外可见光分光光度计NanoDrop 2000进行检测，OD 260/280nm 值维持在1.8‒2.0范围内，表明DNA质量合格，送至深圳华大基因进行测序。
上述的细菌16S rDNA 片段扩增所用的引物为：515F：5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTA
A-3’和806R：5’-GGACTACHVGGG TWTCTAA-3’，扩增片段长度为200bp。
高通量测序结果见图1、图2，结果显示山西老陈醋整个发酵过程中，乳杆菌属、片球菌属为主要的乳酸菌属，在酒精发酵中分别占总乳酸菌的19.13%和15.57%，在醋酸发酵中分别占总乳酸菌的25.57%和5.12%，并且乳杆菌属中最主要的是植物乳杆菌（58%），片球菌属中最主要的是戊糖片球菌（41%）。另外，采用MRS培养基对山西老陈醋整个发酵过程中的乳酸菌进行计数，结果显示，乳酸菌总数在整个陈醋发酵过程中都保持在107 cfu/g以上，证明其是陈醋发酵过程中的主要细菌（见图3）。
上述采用的MRS固体培养基的制备方法为：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，K2HPO4 2g，乙酸钠2g，柠檬酸三铵2g，葡萄糖20g，吐温80 1mL，MgSO4 0.2g，MnSO4 0.05g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，调pH6.2‒6.6，121℃灭菌20min备用。
实施例2：优良乳酸菌的筛选、鉴定与保藏
（1）高产酸乳酸菌的筛选：对山西老陈醋发酵过程中分离得到的100株乳酸菌，采用氢氧化钠滴定法进行产酸性能的测定。最终筛选出产酸性能最高的乳酸菌7，为24.78g/L。
菌株产酸性能的具体测定方法为：将活化菌株按照2%的接种量接种于MRS液体培养基，37℃静置培养24h后，取发酵液3mL，加入27mL蒸馏水稀释10倍，用0.05 %的NaOH溶液滴定至pH为8.2，记录下消耗的NaOH溶液体积。
（2）高产乙偶姻乳酸菌的筛选：将活化后的乳酸菌按2%的接种量接种于Voges-Proskauer(V-P)培养基，37℃静置培养24h后，将发酵液8000 r/min离心10 min，取菌株发酵上清液3.0mL，加入3.0 mL改良O’Meara试剂，充分震荡均匀，于37℃条件下反应60 min后，充分震荡均匀，以比色法测定出各反应液在516 nm处吸光值，从而通过乙偶姻标准曲线计算出乙偶姻含量。最终筛选出乳酸菌7的乙偶姻产量较高，为20.84g/L。
上述的Voges-Proskauer(V-P)培养基配方为：葡萄糖10 g，蛋白胨5 g，KH2PO4 5g，加水至1000 mL，pH调至7.0，于121℃灭菌20 min。
上述的改良O’Meara试剂为含3%肌酸、0.5%蛋白胨的40%NaOH水溶液。
上述测定乙偶姻的Voges-Proskauer(V-P)反应原理为：乙偶姻在碱性条件下可被氧化为2,3-丁二酮，2,3-丁二酮与带有胍基的肌酸反应，可产生粉红色复合物，该粉红色复合物在波长516nm处有最大吸收峰。
上述乙偶姻标准曲线的制作为：称取乙偶姻1g，溶于100 mL蒸馏水中，即得1.0mg/mL乙偶姻溶液，吸取0.0，0.6，1.2，1.8，2.4mL于10 mL试管中，编号，补加蒸馏水至3.0mL，加入3.0 mL改良O’Meara试剂，充分震荡均匀，37℃条件下反应60 min后，充分震荡均匀后以比色法测定516 nm处的吸光值，并绘制标准曲线。
（3）乳酸菌产有机酸和产挥发性香气能力的测定：将活化后的乳酸菌按3%的接种量分别接入高粱汁培养基和醋醅模拟培养基中，于37℃静置培养6天后取样，采用HPLC法和GC-MS法测定有机酸和挥发性香气的种类和含量。最终筛选出乳酸菌2422不挥发性酸产量高，发酵风味佳，挥发性香气成分种类和含量丰富。
上述高粱汁培养基的制备方法为：将高粱200g粉碎至四至六瓣，加4倍的水润料4h后在温度为85‒90℃下糊化1h，期间不断搅拌，加入0.5g高温淀粉酶（70000U）于100℃蒸煮60min至不粘手无生心停火，冷却至室温过滤得滤液于121℃灭菌20min备用。上述醋醅模拟固体培养基的制备方法为：取自山西老陈醋醋酸发酵第0天的醋醅。
上述HPLC法测定有机酸含量的具体方法如下：取上述培养6天的样品5g，用超纯水定容至50mL，12000r/min离心5min取上清液，用0.22μm微孔滤膜过滤，上样。色谱测定条件为：液相系统UItimate 3000；色谱柱C18 4.6×150mm，5μm；流动相20mmol/L NaH2PO4，pH=2.7；进样量20μL；流动速度0.8mL/min；检测器UV210nm；柱温：室温。
上述GC-MS法测定挥发性香气成分的具体方法如下：采用顶空固相微萃取对上述培养6天的样品进行萃取，并采用直接内标法测定其挥发性香气的种类和含量。色谱条件：色谱柱为VF-5MS（30×0.25mm×0.25mm），载气：氦气，纯度99.999%，流量1mL/min，不分流。程序升温：起始温度40℃，保持3min，以4℃的速度升至160℃，保持1min。再以10℃/min的速度升至270℃保持5min。质谱条件：接口温度280℃，离子源温度280℃，电子能量70eV，扫描质量范围41‒500amu。
（4）优良乳酸菌7和乳酸菌2422耐受性的测定：对产酸和乙偶姻性能高的乳酸菌7和发酵风味佳、挥发性香气含量丰富的乳酸菌2422进行酒精度、初始糖度、温度的耐受性测定，结果表明2株菌均耐受8%的酒精度、200g/L的初始糖度、pH=4的酸度、50℃的温度。
菌株耐受性能的具体测定方法为：将活化的优良乳酸菌按2%接种量分别接种到不同酒精浓度（2%，4%，6%，8%，10%，12%，14%，16%）、不同pH梯度（2、3、4、5、6、7）的醋酸菌液体培养基中，分别于（30℃、35℃、40℃、45℃、50℃）静置培养24h后，测OD 600nm 菌体浓度，比较菌株的耐受性。
（5）优良乳酸菌7和乳酸菌2422的菌株鉴定
形态学鉴定：用接种环挑取乳酸菌7、乳酸菌2422少许在MRS平板培养基上进行划线，分离出单菌落，将培养基上生长的菌落拍照，进行记录，然后通过革兰氏染色镜检，观察其细胞形态特征。乳酸菌7、乳酸菌2422在MRS培养基上的菌落以及细胞形态见图4，乳酸菌7在MRS培养基上的菌落均呈白色，不透明，菌落凸起，湿润，边缘平整，有光泽，菌落直径分别为0.6‒0.8mm，光学显微镜下观察其细胞形态，革兰氏染色均呈G+，菌体呈小短杆状。乳酸菌2422在MRS培养基上的菌落呈乳白色，光滑，直径0.8‒1.0mm，菌落凸起，湿润，边缘平整，光学显微镜下观察其细胞形态，革兰氏染色呈G+，菌体呈球状。
16Sr DNA测序：用试剂盒提取乳酸菌7、乳酸菌2422的基因组，进行16Sr DNA测序及菌种鉴定，引物为：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’和下游：5’-TCCTCCGCTTATTGATA
TGC-3’，采用BLAST软件经同源性比较，结果表明乳酸菌7为植物乳杆菌，乳酸菌2422为戊糖片球菌，并构建系统进化树，见图5。并将其保藏在普通工业微生物菌种保藏中心，保藏编号为植物乳杆菌CGMCC 15731、戊糖片球菌CGMCC 16912。
实施例3：优良土著植物乳杆菌CGMCC 15731、戊糖片球菌CGMCC 16912与山西老陈醋发酵过程中的优势酿酒酵母CGMCC 15729、巴氏醋杆菌CGMCC 15730之间的互作
将培养好的植物乳杆菌CGMCC 15731、戊糖片球菌CGMCC 16912、酿酒酵母CGMCC 15729（本实验室已筛选出的优良菌株，产醇7.0%，产酯6.33g/100mL）和巴氏醋杆菌CGMCC 15730（本实验室已筛选出的优良菌株，产酸75.2g/L，产乙偶姻18.3g/L），分别以1:1的比例接入高粱汁或醋醅模拟培养基，30℃静置培养6d后测其菌株生物量，考察之间有无抑制作用。实验结果表明植物乳杆菌CGMCC 15731、戊糖片球菌CGMCC 16912、酿酒酵母CGMCC 15729和巴氏醋杆菌CGMCC 15730之间在生物量上无明显抑制作用（图6）。
上述的互作实验具体实验方法为：将植物乳杆菌CGMCC 15731、戊糖片球菌CGMCC16912分别按3%的接菌量接入MRS培养基，并用空培养基调其浓度均为1×108cfu/mL备用；将酿酒酵母CGMCC 15729、巴氏醋杆菌CGMCC 15730分别按3%的接菌量接入PDA培养基、醋酸菌基础培养基，并用相应空培养基调其浓度均为1×106cfu/mL备用；将调整好浓度的菌液按照两者为1:1的比例接入高粱汁或醋醅模拟培养基，于30℃静置培养6d。每48h取样并进行梯度稀释涂布，植物乳杆菌CGMCC 15731、戊糖片球菌CGMCC 16912采用MRS平板对其进行生物量测定；酿酒酵母CGMCC 15729采用PDA平板对其进行生物量测定；巴氏醋杆菌CGMCC15730采用醋酸菌基础培养基平板对其进行生物量测定。
上述所述的马铃薯培养基（PDA）培养基制备方法：马铃薯200 g，去皮切块，加蒸馏水1000 mL，煮沸20 min后纱布过滤，滤液中加葡萄糖20.0 g，蛋白胨2.0 g，磷酸二氢钾2.0g ，硫酸镁1.0g，琼脂20.0g，补足蒸馏水至1000 mL，高压121℃灭菌20min。
上述所述的醋酸菌基础培养基制备方法：10.0 g酵母浸膏，10.0 g葡萄糖，20.0 g琼脂，加至水1000mL，高压121℃灭菌20 min后加入10.0g无菌碳酸钙和40.0mL无水乙醇。
实施例4：复配直投式发酵剂的制备
将植物乳杆菌CGMCC 15731、戊糖片球菌CGMCC 16912按照3%的接种量分别接入到MRS液体培养基，37℃静置培养24h，待培养液的菌体浓度均达到108cfu/mL后，采用中空纤维膜浓缩，发酵液分别浓缩至原体积的1/5后添加无菌的保护剂混合，浓缩发酵液与保护剂的体积比为1:3 （v:v），通过低温喷雾干燥对发酵液进行处理后，将植物乳杆菌CGMCC 15731、戊糖片球菌CGMCC 16912干粉按质量比1:1混合即为复配直投式发酵剂。
上述的保护剂制备方法为：A：脱脂奶粉10 g，蒸馏水100 mL，115 ℃灭菌15 min；B：海藻糖1.5 g、甘油0.5 g、山梨醇2 g、麦芽糊精1 g、蒸馏水100 mL，121 ℃灭菌15 min；A，B分别灭菌后，冷却至室温混合，即为保护剂。
上述的低温喷雾干燥工艺参数为：出风温度为55℃，进风温度为120℃，干燥时间6min，水分含量为≤5%。制备的乳酸菌复配直投式发酵剂，活菌数为1011cfu/g，阴凉干燥条件下贮存期为一年。
实施例5：复配直投式发酵剂强化应用在山西老陈醋酿造过程
高粱粉碎至四至六瓣，100公斤高粱加入60‒70公斤50‒55℃水润料12h，将润好的高粱蒸2h，无夹心不粘手时停火；再加入300公斤80℃的水，搅拌均匀浸料，温度降至25‒33℃时拌入60公斤大曲，搅拌均匀后输送到酒精发酵罐中，控制发酵罐中温度为25‒33℃，酒精发酵8‒10天，前2天为敞口发酵，之后为封口发酵，酒精度为6%时，加入150公斤麸皮和100公斤的谷糠，搅拌均匀，加入10公斤火醅，控制发酵罐中温度为24‒47℃进行醋酸发酵10‒12天，酸度为4.66g/100g时，加入10公斤食盐，停止发酵，经熏醅、淋醋环节得新淋醋，测定新淋醋的理化指标（pH、总酸、还原糖、总酯、不挥发酸、氨基氮、波美度、川芎嗪）（结果见表1），有机酸（结果见表2）及挥发性香气成分（结果见表3）。
实施例6：以实施例5为对照例，按照上述方法在酒精发酵阶段加入60公斤大曲的同时，再加入高粱重量0.8%的复配直投式发酵剂（1g复配直投式发酵剂溶解到10mL无菌水中，37℃活化30min后备用），搅拌均匀后输送到酒精发酵罐进行酒精发酵8‒10天。
实施例7：以实施例5为对照例，按照上述方法在醋酸发酵阶段加入10公斤火醅的同时，再加入高粱重量0.8%的复配直投式发酵剂（1g复配直投式发酵剂溶解到10mL无菌水中，37℃活化30min后备用），进行醋酸发酵10‒12天。
实施例8：以实施例5为对照例，按照上述方法在酒精发酵阶段加入60公斤大曲的同时，再加入高粱重量0.8%的复配直投式发酵剂，搅拌均匀后输送到酒精发酵罐进行酒精发酵8‒10天；在醋酸发酵阶段加入10公斤火醅的同时，再加入高粱重量0.8%的复配直投式发酵剂，进行醋酸发酵10‒12天。
采用复配直投式发酵剂强化应用在山西老陈醋生产中，提高了新淋醋的总酸、不挥发酸等理化含量以及有机酸和挥发性香气含量，而实施例8显著优于实施例5（对照例）。实施例8得到的新淋醋中总酸含量为5.32g/100mL，不挥发性酸含量达2.56g/100mL，总酯含量为4.34g/100mL，分别比对照组提高了41.49%、169.47%、46.62%（表1）；有机酸总含量由29.8663g/L提高为39.8628 g/L，其中乳酸含量为16.4562g/L，比对照组提高了94.68%（表2）；挥发性香气成分共检测出40种（酯类17种、醇类4种、酸类3种、酮类5种、醛类7种、酚类1种、其他2种），酯类总含量为4.63g/100mL、醇类总含量为1.11g/100mL、酸类总含量为3.35g/100mL、醛类总含量为20.71g/100mL；其中具有水果香味的乙酸乙酯（1.19g/100mL）、具有白兰地香气的辛酸乙酯（0.45g/100mL）、呈蜂蜜香的苯乙酸乙酯（0.23g/100mL）、具有柔和甜润玫瑰香的苯乙醇（0.53g/100mL），他们构成了山西老陈醋的独特风味，使得陈醋酸不涩口，酸绵幽香；杂环类物质的四甲基吡嗪是山西老陈醋的重要风味物质，四甲基吡嗪含量为0.03 g/100mL（表3）。
表1：采用复配直投式发酵剂生产山西老陈醋所得新淋醋中理化指标的测定结果
表2：采用复配直投式发酵剂生产山西老陈醋所得新淋醋中有机酸的测定结果
表3：采用复配直投式发酵剂生产山西老陈醋所得新淋醋中挥发性香气成分的测定结果
上述山西老陈醋的pH测定用pH计直接测定；山西老陈醋的总酸参照GBT 5009.39.2003《食醋卫生标准分析法》中规定的方法进行测定；山西老陈醋的还原糖、总酯、川芎嗪参照GBT 19777-2013《地理标志产品山西老陈醋》中规定的方法进行测定；山西老陈醋的不挥发酸参照GB 18187-2000《酿造食醋》中单沸式蒸馏法进行测定；山西老陈醋的氨基氮参照GBT5009.39.2003《食醋卫生标准分析法》中规定的方法进行测定；山西老陈醋的波美度测定用波美比重计直接测定。

Claims (9)

1.建立在菌种互作基础上的优良土著复合乳酸菌直投式发酵剂，其特征在于：所述优良土著菌种为：植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）、戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus），保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心( CGMCC )，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号分别为：CGMCC 15731、CGMCC 16912，保藏日期分别为：2018年5月7日，2018年12月10日。
2.根据权利要求1所述的建立在菌种互作基础上的优良土著复合乳酸菌直投式发酵剂，其特征在于：所述植物乳杆菌、戊糖片球菌采用宏基因组高通量测序技术筛选得出：乳杆菌、片球菌为山西老陈醋发酵过程中的优势乳酸菌，再采用传统菌种分离方法，从山西老陈醋发酵过程中分离筛选出产酸24.78g/L和乙偶姻20.84g/L含量高的植物乳杆菌CGMCC15731，发酵风味佳、挥发性香气成分和含量丰富的戊糖片球菌CGMCC 16912，2株菌均耐受pH=4的酸度、50℃的高温、8%的酒精度和200g/L的初始糖度。
3.根据权利要求1所述的建立在菌种互作基础上的优良土著复合乳酸菌直投式发酵剂，其特征在于：所述植物乳杆菌、戊糖片球菌的筛选方法具体步骤如下：
（1）采用宏基因组高通量测序技术明确乳酸菌在山西老陈醋发酵过程中的动态变化：采集山西老陈醋酒精发酵AF第0、1、2、3、5、7、 9、11、13、15天的酒醪样品和醋酸发酵AAF第0、1、3、5、7、9、11天的醋醅样品，进行宏基因组提取，细菌16S rDNA V4区DNA片段扩增，采用MiSeq 2000测序平台进行测序分析；并采用传统稀释平板菌落计数法，采用MRS培养基对山西老陈醋发酵过程中乳酸菌的数量变化进行测定；
（2）耐受性强、产酸高、产乙偶姻能力强的优良土著风味乳酸菌的筛选：对山西老陈醋发酵过程中分离出的100株乳酸菌进行产酸性能、产乙偶姻能力的测定；并采用HPLC和GC-MS法对优良菌株的有机酸和挥发性香气成分的种类和含量进行了系统测定，以及进行酒精度、酸、初始糖度、温度耐受性的测定；
（3）优良菌株的鉴定：对优良目标菌株进行形态学和16 S rDNA测序鉴定，采用的引物为：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’和下游：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’，经鉴定为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）、戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）。
4.根据权利要求1所述的建立在菌种互作基础上的优良土著复合乳酸菌直投式发酵剂，其特征在于：在山西老陈醋优良土著植物乳杆菌CGMCC 15731、戊糖片球菌CGMCC 16912与山西老陈醋发酵过程中的优势酿酒酵母CGMCC 15729、巴氏醋杆菌CGMCC 15730进行菌种互作实验的基础上，将植物乳杆菌和戊糖片球菌以1:1的比例制备成复配直投式发酵剂。
5.根据权利要求1所述的建立在菌种互作基础上的优良土著复合乳酸菌直投式发酵剂，其特征在于：所述复配直投式发酵剂的具体制备方法为：
将植物乳杆菌CGMCC 15731、戊糖片球菌CGMCC 16912按照3%的接种量分别接入到MRS液体培养基，37℃静置培养24h，待培养液的菌体浓度均达到108cfu/mL后，采用中空纤维膜浓缩，发酵液分别浓缩至原体积的1/5后添加无菌的保护剂混合，浓缩发酵液与保护剂的体积比为1:3 v:v，以进风温度为120℃，出风温度为55℃低温喷雾干燥，至水分含量为≤5%时，将植物乳杆菌CGMCC 15731、戊糖片球菌CGMCC 16912干粉按质量比1:1混合即为复配直投式发酵剂，其活菌数为1011cfu/g，阴凉干燥条件下贮存期为一年。
6.利用权利要求5所制备的建立在菌种互作基础上的优良土著复合乳酸菌直投式发酵剂强化山西老陈醋生产的方法，其特征在于：具体步骤为：
高粱粉碎至四至六瓣，100公斤高粱加入60‒70公斤50‒55℃水润料12h，将润好的高粱蒸2h，无夹心不粘手时停火；再加入300公斤80℃的水，搅拌均匀浸料，温度降至25‒33℃时拌入60公斤大曲，再加入高粱重量0.8%的复配直投式发酵剂，搅拌均匀后输送到酒精发酵罐中，控制发酵罐中温度为25‒33℃，酒精发酵8‒10天，前2天为敞口发酵，之后为封口发酵，酒精度为6%时，加入150公斤麸皮和100公斤的谷糠，搅拌均匀，加入10公斤火醅，再加入高粱重量0.8%的复配直投式发酵剂，控制发酵罐中温度为24‒47℃进行醋酸发酵10‒12天，酸度为4.66g/100g时，加入10公斤食盐，停止发酵，经熏醅、淋醋环节得新淋醋。
7.根据权利要求6所述的建立在菌种互作基础上的优良土著复合乳酸菌直投式发酵剂及其强化山西老陈醋生产的方法，其特征在于：所制备的新淋醋中总酸含量为5.32g/100mL，不挥发性酸含量达2.56g/100mL，总酯含量为4.34g/100mL。
8.根据权利要求6所述的利用建立在菌种互作基础上的优良土著复合乳酸菌直投式发酵剂及其强化山西老陈醋生产的方法，其特征在于：所述火醅为前一批发酵第2天的醋醅。
9.根据权利要求6所述的建立在菌种互作基础上的优良土著复合乳酸菌直投式发酵剂及其强化山西老陈醋生产的方法，其特征在于：所述无菌保护剂配方为：A：脱脂奶粉10 g，蒸馏水100 mL，115 ℃灭菌15 min；B：海藻糖1.5 g、甘油0.5 g、山梨醇2 g、麦芽糊精1 g、蒸馏水100 mL，121 ℃灭菌15 min；A和B分别灭菌后，冷却至室温混合即为保护剂。
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