CN115252525B - 一种水仙多糖发酵液的制备方法及其在化妆品中的应用 - Google Patents
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Abstract
一种水仙多糖发酵液的制备方法，以水仙鳞茎和水的混合物为发酵底物，以乳酸乳球菌为发酵菌种，于恒温条件下进行发酵，获取发酵产物，取发酵产物，离心收集上清液得到水仙多糖发酵液，其pH＝4.0‑4.5，发酵用乳酸乳球菌可产生多种氨基酸、维生素等生物活性物，也可以凝集淀粉；水仙多糖粗提液经乳酸乳球菌发酵，得到的发酵液不仅去除了可溶性淀粉，而且富含水仙多糖和细胞分泌物，皮肤易吸收，具有抗衰老、抗氧化等功效。
Description
技术领域
本发明属于生物发酵技术领域，具体涉及一种水仙多糖发酵液的制备方法及其在化妆品中的应用。
背景技术
多花水仙(Narcissus tazetta L.)为石蒜科水仙，属多年生宿根草本植物，花清香文雅，具有较高的观赏价值，是中国十大传统名花之一。水仙花在我国具有悠久的栽培历史，其中以漳州的多花水仙最为出名。漳州是我国水仙花的主产区，水仙花种植面积高峰期达到2万亩。但是水仙球茎难以长期保存，易出现花球大面积空心或腐烂，造成较大的经济损失，降低花农种植的积极性。此外，传统的水仙观赏价值需严格挑选优质球茎才能作为花用球茎，那些球茎偏小或外观不良的水仙球茎只能作为农业废弃物丢弃。因此，增加水仙花的经济附加值，提高水仙球茎的利用价值是十分值得研究的。
研究发现，多花水仙中粘质(生物多糖)的含量较高，可达到4.5％。水仙鳞茎粘质液具有保湿、拉丝、增稠等物理特性，涂在皮肤上肤感优异,可开发为化妆品保湿剂或增稠剂，有望代替透明质酸或β-葡聚糖。近年来，发酵技术在化妆品植物活性原料开发上有着很好的应用前景，微生物不仅能够有效富集植物活性成分、提高功效，还可以降低来自植物中其他物质的毒副作用。同时，微生物发酵还能降低传统提取方式中有机试剂的使用，减少污染及能耗，已然成为化妆品工业上的研究热点之一。
乳酸乳球菌(Lactococcus lactis，L.lactis)是一种原核微生物，归属于硬壁菌门，杆菌纲，乳杆菌目，链球菌科，乳球菌属，同时是乳酸菌属中的一种重要模式菌。L.lactis细胞呈球形或卵圆形，革兰氏阳性，兼性厌氧，不产荚膜和芽孢，对人和动物无致病性，是被公认安全的食品级微生物，在食品、化妆品中广泛应用。乳酸乳球菌不仅可以凝集淀粉，也可以代谢产生多种抗氧化、美白等功效的活性因子。
传统的水仙鳞茎多糖的分离纯化工艺不仅步骤繁琐，能源及材料消耗极大，而且水仙多糖产率及纯度不高，含有大量可溶性淀粉，提取过程中使用有机试剂的同时也容易带入金属离子，影响其在化妆品的复配应用。
在现有技术中，还未发现有以水仙鳞茎和水的混合物为发酵底物，以乳酸乳球菌为发酵菌种得到水仙多糖发酵液的制备方法。
发明内容
针对以上问题，本发明提供了一种水仙多糖发酵液的制备方法及其在化妆品中的应用，其以水仙鳞茎和水的混合物为发酵底物，以乳酸乳球菌为发酵菌种得到水仙多糖发酵液，填补了现有技术的空白。
为实现上发明目的，本发明采用如下技术方案：
一种水仙多糖发酵液的制备方法，以水仙鳞茎和水的混合物为发酵底物，以乳酸乳球菌为发酵菌种，于恒温条件下进行发酵，获取发酵产物，取发酵产物，离心收集上清液得到水仙多糖发酵液，其pH＝4.0-4.5。
进一步，乳酸乳球菌种子液菌浓度106-109cfu/ml；乳酸乳球菌种子液和水仙鳞茎配比为106-109cfu：50-500g水仙鳞茎；
进一步，发酵体系为：5-500g乳酸乳球菌种子液、50-500g水仙鳞茎、500-5000mL无菌水；乳酸乳球菌发酵条件为：T＝30-40℃，48-96小时；离心参数为：4000-8000rpm，10-30min。
进一步，乳酸乳球菌包括乳酸乳球菌霍氏亚种、乳酸乳球菌乳脂亚种、乳酸乳球菌乳酸亚种等的一种或几种。
进一步，其特征在于该水仙多糖发酵液具有保湿和抗氧化功效，应用在保湿和抗衰老化妆品中。
进一步，具体方法如下：
⑴取200g新鲜的水仙鳞茎，剥去外皮，切除根须，用清水冲洗干净；
⑵将清洗干净的水仙鳞茎倒入破碎机打浆；
⑶往匀浆液中加入1L的灭菌纯水，再转移至发酵釜中，115℃灭菌15min，然后通冷却水降温至37℃，得到水仙鳞茎浸提液，待接种；
⑷发酵釜接种20mL即2％乳酸乳球菌霍氏亚种种子液，启动搅拌机使之混匀，37℃搅拌通气发酵72h，然后收集整个发酵体系，即为发酵产物；
⑸发酵产物，6000rpm离心15min，收集上清液，即为水仙多糖发酵液；水仙多糖发酵液为无色至淡黄色液体，pH至为4.0-4.5。
进一步，具体方法如下：
⑴取400g新鲜的水仙鳞茎，剥去外皮，切除根须，用清水冲洗干净；
⑵将清洗干净的水仙鳞茎倒入破碎机打浆；
⑶往匀浆液中加入2L的灭菌纯水，再转移至发酵釜中，115℃灭菌15min，然后通冷却水降温至30℃，得到水仙鳞茎浸提液，待接种；
⑷发酵釜接种80mL即4％乳酸乳球菌乳脂亚种种子液，启动搅拌机使之混匀，30℃搅拌通气发酵96h，然后收集整个发酵体系，即为发酵产物；
⑸发酵产物，6000rpm离心20min，收集上清液，即为水仙多糖发酵液；水仙多糖发酵液为无色至淡黄色液体，pH至为4.0-4.5。
进一步，具体方法如下：
⑴取200g新鲜的水仙鳞茎，剥去外皮，切除根须，用清水冲洗干净；
⑵将清洗干净的水仙鳞茎倒入破碎机打浆；
⑶往匀浆液中加入1L的灭菌纯水，再转移至发酵釜中，115℃灭菌15min，然后通冷却水降温至37℃，得到水仙鳞茎浸提液，待接种；
⑷发酵釜接种50mL即5％乳酸乳球菌乳脂亚种种子液，启动搅拌机使之混匀，37℃搅拌通气发酵48h，然后收集整个发酵体系，即为发酵产物；
⑸发酵产物，6000rpm离心30min，收集上清液，即为水仙多糖发酵液；水仙多糖发酵液为无色至淡黄色液体，pH至为4.0-4.5。
采用上述技术方案，本发明和已有技术相比，其技术进步是显著的。发酵用乳酸乳球菌可产生多种氨基酸、维生素等生物活性物，也可以凝集淀粉；水仙多糖粗提液经乳酸乳球菌发酵，得到的发酵液不仅去除了可溶性淀粉，而且富含水仙多糖和细胞分泌物，皮肤易吸收，具有抗衰老、抗氧化等功效。
本发明利用微生物发酵技术，通过选择合适的微生物及发酵条件，充分利用微生物的降解及转化作用。发酵过程中不添加其他有机试剂，提高了安全性和环保性，得到的发酵液具有保湿和抗氧化能力，可作为原料添加至化妆品中。
附图说明：
图1为本发明的工艺流程图。
具体实施方式
以下通过1及具体实施方式对本发明做进一步解释说明，所描述的仅是本发明的部分实施实例，不对本发明的内容有所限制。本领域相关研究人员在没有做出任何创新性贡献的前提下所进行的其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂商店购买得到的。
水仙鳞茎产自福建漳州，菌种购自BNCC(北纳生物)，其他试剂均为普通市售品。
下述实施例所用的乳酸乳球菌种子液均按照如下步骤进行预处理：
乳酸乳球菌种子液制备
⑴菌种复苏：取乳酸乳球菌冻干管，打管接种至斜面将菌种复苏。
⑵菌种活化：从复苏好的斜面中挑取菌落放入液体培养基中，放入摇床中将菌种活化，将活化的菌种梯度稀释铺板，以便获取单菌落。
⑶菌种扩培：将待用菌种接种到相应液体培养基中，在30～37℃的摇床中培养，至其600nm处的吸光度OD600值在0.5-1.0时，菌种处在对数期，即为合适的接种浓度106-109cfu/ml。所用培养基组成为：MRS琼脂6.6％，MRS肉汤5％。
实施例一
⑴取200g新鲜的水仙鳞茎，剥去外皮，切除根须，用清水冲洗干净；
⑵将清洗干净的水仙鳞茎倒入破碎机打浆；
⑶往匀浆液中加入1L的灭菌纯水，再转移至发酵釜中，115℃灭菌15min，然后通冷却水降温至37℃，得到水仙鳞茎浸提液，待接种；
⑷发酵釜接种20mL即2％乳酸乳球菌霍氏亚种种子液，启动搅拌机使之混匀，37℃搅拌通气发酵72h，然后收集整个发酵体系，即为发酵产物。
⑸发酵产物，6000rpm离心15min，收集上清液，即为水仙多糖发酵液。水仙多糖发酵液为无色至淡黄色液体，pH至为4.0-4.5。
实施例二
⑴取400g新鲜的水仙鳞茎，剥去外皮，切除根须，用清水冲洗干净；
⑵将清洗干净的水仙鳞茎倒入破碎机打浆；
⑶往匀浆液中加入2L的灭菌纯水，再转移至发酵釜中，115℃灭菌15min，然后通冷却水降温至30℃，得到水仙鳞茎浸提液，待接种；
⑷发酵釜接种80mL即4％乳酸乳球菌乳脂亚种种子液，启动搅拌机使之混匀，30℃搅拌通气发酵96h，然后收集整个发酵体系，即为发酵产物。
⑸发酵产物，6000rpm离心20min，收集上清液，即为水仙多糖发酵液。水仙多糖发酵液为无色至淡黄色液体，pH至为4.0-4.5。
实施例三
⑴取200g新鲜的水仙鳞茎，剥去外皮，切除根须，用清水冲洗干净；
⑵将清洗干净的水仙鳞茎倒入破碎机打浆；
⑶往匀浆液中加入1L的灭菌纯水，再转移至发酵釜中，115℃灭菌15min，然后通冷却水降温至37℃，得到水仙鳞茎浸提液，待接种；
⑷发酵釜接种50mL即5％乳酸乳球菌乳脂亚种种子液，启动搅拌机使之混匀，37℃搅拌通气发酵48h，然后收集整个发酵体系，即为发酵产物。
⑸发酵产物，6000rpm离心30min，收集上清液，即为水仙多糖发酵液。水仙多糖发酵液为无色至淡黄色液体，pH至为4.0-4.5。
为了证明本发明的有效性，进行了以下实验：
水仙多糖发酵液具体检测指标：淀粉检测、多糖含量检测、保湿功效和抗氧化功效检测。以下呈现实施例的具体检测实验数据。
1、水仙多糖发酵液淀粉检测，根据淀粉遇碘显色原理，即直链淀粉遇碘呈蓝色，支链淀粉遇碘呈紫红色，糊精遇碘呈蓝紫色。主要试剂：2.5％I2/KI溶液(2.5g I2+5.0g KI，加水至100mL)；0.005％淀粉(取50mg可溶性淀粉，加水至1000mL，加热至沸腾，自然冷却至室温)、灭菌纯水、水仙多糖发酵液。
鉴定方法：分别取待测试样5mL于25mL比色管内，加入0.1mL I2/KI溶液，摇匀，观察颜色变化。
测试结果如表1所示，采用本发明方法制得的水仙多糖发酵液样品经I2/KI测试显示阴性，即发酵液中无淀粉；
表1淀粉测试结果
2、水仙多糖发酵液多糖含量检测，采用苯酚硫酸法进行检测。具体步骤如下：准确吸取1.0mL样品溶液/纯水到10mL比色管中。加入1mL的5％苯酚溶液，然后快速加入5.0mL浓硫酸，静置10min。样品溶液振荡混匀后，将比色管放置于30℃水浴锅中水浴20min。以加纯水的试剂为空白，测定样品在490nm处的吸光值，代入标准曲线计算得到多糖含量。
经测定，水仙多糖发酵液多糖含量如表2所示
表2多糖含量检测结果
| 待测样品 | 多糖含量(g/L) |
| 实施例1水仙多糖发酵液 | 8.28 |
| 实施例2水仙多糖发酵液 | 8.05 |
| 实施例3水仙多糖发酵液 | 8.52 |
3、水仙多糖发酵液保湿功效检测，采用经皮失水率进行检测。
实验样品：5％甘油、0.1％透明质酸、1％水仙多糖发酵液
测试方法：试验设计30名志愿者在40％湿度和25℃环境中完成4小时保湿测试。将每位受试者手臂内侧皮肤划分一块区域，并平均划分为块(3cm×3cm)，分别涂抹18mg样品，设计0h、1h和4h，分别用多功能皮肤测试仪(CK-MPA10)的Corneometer CM825探头测定水分变化，每次检测同一区域读取数据三次，全部志愿者计算平均值。
测试结果如表3所示。
表3经皮失水率检测结果
测试结果表明，水仙多糖发酵液可有效保护皮肤水分含量，缓解皮肤水分散失，具有较强的保湿功效。
4、水仙多糖发酵液抗氧化功效检测。
DPPH是一种早期合成的有机自由基，常用来评估抗氧化物的供氢能力，它在有机溶剂中非常稳定，呈紫色，而且有一个特征吸收峰，当遇到自由基清除剂时，DPPH的孤对电子被配对而使其退色，也就是在最大吸收波长处的吸光值变小。因此，可通过测定吸光值的变化来评价样品对DPPH自由基的清除效果。DPPH自由基清除实验的具体实验步骤为：DPPH溶液为溶解于无水乙醇、浓度为6×10-5mol/L的DPPH溶液，水仙多糖发酵液的稀释溶剂为无水乙醇。1.0mL的5％水仙多糖发酵液与5.0mL的DPPH溶液混合(实验组)；1.0mL无水乙醇与5.0mL的DPPH溶液混合(空白组)；室温避光静置30min后，在518nm下测吸光度值。DPPH自由基清除率计算公式：清除率％＝(实验组-空白组)/空白组。清除率越大表明抗氧化能力越强。经测定，自由基清除率如表4所示：
表4自由基清除率检测结果
| 待测样品 | 清除率 |
| 实施例1水仙多糖发酵液 | 56.9 |
| 实施例2水仙多糖发酵液 | 57.5 |
| 实施例3水仙多糖发酵液 | 58.1 |
测试结果表明，水仙多糖发酵液可有效清除自由基，具有一定的抗氧化功效。
上述说明示出并描述了本发明的优选实施例，如前所述，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。
Claims (6)
1.一种水仙多糖发酵液的制备方法，其特征在于：以水仙鳞茎和水的混合物为发酵底物，以乳酸乳球菌为发酵菌种，于恒温条件下进行发酵，获取发酵产物，取发酵产物，离心收集上清液得到水仙多糖发酵液，其pH＝4.0-4.5；
乳酸乳球菌种子液菌浓度106-109cfu/ml；乳酸乳球菌种子液和水仙鳞茎配比为106-109cfu：50-500g水仙鳞茎；发酵体系为：5-500g乳酸乳球菌种子液、50-500g水仙鳞茎、500-5000mL无菌水；乳酸乳球菌发酵条件为：T＝30-40℃，48-96小时；离心参数为：
4000-8000rpm，10-30min。
2.根据权利要求1所述的一种水仙多糖发酵液的制备方法，其特征在于：乳酸乳球菌包括乳酸乳球菌霍氏亚种、乳酸乳球菌乳脂亚种、乳酸乳球菌乳酸亚种的一种或几种。
3.根据权利要求1或2所述的一种水仙多糖发酵液的制备方法，其特征在于：具体方法如下：
⑴取200g新鲜的水仙鳞茎，剥去外皮，切除根须，用清水冲洗干净；
⑵将清洗干净的水仙鳞茎倒入破碎机打浆；
⑶往匀浆液中加入1L的灭菌纯水，再转移至发酵釜中，115℃灭菌15min，然后通冷却水降温至37℃，得到水仙鳞茎浸提液，待接种；
⑷发酵釜接种20mL即2％乳酸乳球菌霍氏亚种种子液，启动搅拌机使之混匀，37℃搅拌通气发酵72h，然后收集整个发酵体系，即为发酵产物；
⑸发酵产物，6000rpm离心15min，收集上清液，即为水仙多糖发酵液；水
仙多糖发酵液为无色至淡黄色液体，pH至为4.0-4.5。
4.根据权利要求1或2所述的一种水仙多糖发酵液的制备方法，其特征在于：具体方法如下：
⑴取400g新鲜的水仙鳞茎，剥去外皮，切除根须，用清水冲洗干净；
⑵将清洗干净的水仙鳞茎倒入破碎机打浆；
⑶往匀浆液中加入2L的灭菌纯水，再转移至发酵釜中，115℃灭菌15min，然后通冷却水降温至30℃，得到水仙鳞茎浸提液，待接种；
⑷发酵釜接种80mL即4％乳酸乳球菌乳脂亚种种子液，启动搅拌机使之混匀，30℃搅拌通气发酵96h，然后收集整个发酵体系，即为发酵产物；
⑸发酵产物，6000rpm离心20min，收集上清液，即为水仙多糖发酵液；水
仙多糖发酵液为无色至淡黄色液体，pH至为4.0-4.5。
5.根据权利要求1或2所述的一种水仙多糖发酵液的制备方法，其特征在于：具体方法如下：
⑴取200g新鲜的水仙鳞茎，剥去外皮，切除根须，用清水冲洗干净；
⑵将清洗干净的水仙鳞茎倒入破碎机打浆；
⑶往匀浆液中加入1L的灭菌纯水，再转移至发酵釜中，115℃灭菌15min，然后通冷却水降温至37℃，得到水仙鳞茎浸提液，待接种；
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⑸发酵产物，6000rpm离心30min，收集上清液，即为水仙多糖发酵液；水仙多糖发酵液为无色至淡黄色液体，pH至为4.0-4.5。
6.根据权利要求1或2所述的一种水仙多糖发酵液的制备方法，其特征在于：所得发酵液应用在保湿和抗衰老化妆品中。
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