CN110680774B - 一种茉莉花双菌发酵化妆品的制备方法及产物的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种茉莉花双菌发酵化妆品的制备方法及产物的应用，要解决的是现有茉莉花发酵产物在化妆品中的应用空白。本发明具体步骤如下：（1）获取初级发酵底物：将茉莉花干粉与去离子水混合后，进行第一次高温灭菌，冷却，获得初级发酵底物；（2）获得二次发酵底物：在初级发酵底物中接入酿酒酵母，进行初次发酵，进行第二次高温灭菌、冷却，获得二次发酵底物；（3）获得茉莉花发酵提取物：在二次发酵底物中接入植物乳杆菌，进行二次发酵，进行第三次高温灭菌、冷却、离心、取上清液。本发明采用两种微生物对茉莉花进行发酵，不添加任何有机试剂，温和发酵，保留茉莉花的全部功效成分及活性，避免活性成分流失，保证植物的天然活性。
Description
技术领域
本发明涉及化妆品领域，具体是一种茉莉花双菌发酵化妆品的制备方法。
背景技术
茉莉花为木樨科茉莉属，原产印度，现广泛种植于我国江苏、广西、福建和广东等地区。茉莉花含有大量营养成分及活性物质。研究表明，目前茉莉花检测出的功效有抗感染、抗肿瘤、抗癌、降血糖等。当今化妆品行业飞速发展，茉莉花作为中国的天然植物资源之一，富含多种活性成分和活性功能，主要包括多糖、黄酮、挥发油等，在化妆品中具有巨大的应用前景。现在茉莉花活性成分的提取技术主要包括：醇回流提取技术、超声波提取技术、水煮醇沉提取技术以及解吸热提两步法提取技术。
尚未出现对茉莉花进行发酵并且将发酵产物应用于化妆品的产品。
发明内容
本发明实施例的目的在于提供一种茉莉花双菌发酵化妆品的制备方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：
一种茉莉花双菌发酵化妆品的制备方法，具体步骤如下：
（1）获取初级发酵底物：将茉莉花干粉与去离子水混合后，进行第一次高温灭菌，冷却，获得初级发酵底物；
（2）获得二次发酵底物：在初级发酵底物中接入酿酒酵母，进行初次发酵，并进行第二次高温灭菌、冷却，获得二次发酵底物；
（3）获得茉莉花发酵提取物：在二次发酵底物中接入植物乳杆菌，进行二次发酵，并进行第三次高温灭菌、冷却、离心、取上清液，获得茉莉花发酵提取物，发酵技术是一项既传统又现代的提取技术，运用微生物发酵技术发酵植物等，将微生物发酵提取物应用于化妆品中，是当前国内外化妆品的研究热点。微生物发酵技术可以用完整的微生物细胞或从微生物细胞中提取的酶作为生物催化剂，其区域和立体选择性强、反应条件温和、操作简便、成本较低、公害少，受到各个领域的极大重视。酿酒酵母在发酵过程中具有优越的安全性，并且酿酒酵母发酵液中具有丰富的多肽、多种维生素、丰富的矿物质和酶类。酿酒酵母能够抑制有害微生物的生长，防止产品的腐败，可以起到重要的生物保存作用，延长保质期。将酿酒酵母与植物乳杆菌混合发酵，酿酒酵母可以为植物乳杆菌提供氨基酸、微生物和丙酮酸等营养物质，为植物乳杆菌提供能量，在一定程度上提高发酵产物质量。
作为本发明实施例进一步的方案：茉莉花干粉和去离子水的配比为（5-30）g：500g，初级发酵底物与酿酒酵母的配比为500g：（10-50）mL，酿酒酵母的菌种数为106-109CFU/mL。
作为本发明实施例进一步的方案：茉莉花干粉和去离子水的配比为10g：500g，初级发酵底物与酿酒酵母的配比为500g：25mL，酿酒酵母的菌种数为107CFU/mL。
作为本发明实施例进一步的方案：初次发酵的温度为25-35℃，具体可为28℃，时间为24-72h，具体可为48h。
作为本发明实施例进一步的方案：二次发酵底物与植物乳杆菌的配比为500g：（5-30）mL，其中植物乳杆菌的菌种数为106-109 CFU/mL。
作为本发明实施例进一步的方案：二次发酵的温度为25-45℃，具体可为42℃，时间为8-48h，具体可为12h。
作为本发明实施例进一步的方案：酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae的ATCC编号为1012，植物乳杆菌Lactobacillus plantarum的ATCC编号为8014。
作为本发明实施例进一步的方案：酿酒酵母和植物乳杆菌为培养液或悬浮液的形式存在，所述酿酒酵母的培养液或悬浮液的pH值为5.0-7.0，植物乳杆菌的培养液或悬浮液的pH值为4.0-7.0。
作为本发明实施例进一步的方案：茉莉花干粉的目数为20-50目，具体可为40目，将干燥的茉莉花经粉碎机粉碎、过筛后得到。
作为本发明实施例进一步的方案：第一次高温灭菌的条件如下：灭菌温度为115-121℃（具体可为121℃），灭菌时间为10-40min（具体可为15min）；所述第二次高温灭菌的条件如下：灭菌温度为80-105℃（具体可为90℃），灭菌时间为30-60min（具体可为40min）；所述第三次高温灭菌的条件如下：灭菌温度为80-115℃（具体可为100℃），灭菌时间为20-40min（具体可为30min）。
作为本发明实施例进一步的方案：离心的转速为4000-10000r/min（具体可为6000r/min），离心时间为10-30min（具体可为20min），离心半径为9cm。
作为本发明实施例进一步的方案：茉莉花发酵提取物还需要进行脱色（具体可采用活性炭）和去味，不同浓度的茉莉花发酵提取物采用去离子水稀释得到。
本发明还包括所制备的茉莉花发酵提取物。
本发明还包括本发明所制备的茉莉花发酵提取物在制备具有抗衰老和/或清除DPPH自由基功能的产品中的应用，产品为面膜、精华液、爽肤水等化妆品中的任意一种。
与现有技术相比，本发明实施例的有益效果是：
（1）本发明采用酿酒酵母和植物乳杆菌对茉莉花干粉进行发酵，保留了植物的全部功效成分及其活性，避免了提取方法造成的活性成分流失；
（2）将酿酒酵母与植物乳杆菌混合发酵，酿酒酵母可以为植物乳杆菌提供氨基酸、微生物和丙酮酸等营养物质，为植物乳杆菌提供能量，在一定程度上提高茉莉花发酵提取物的功效。
（3）本发明提供的茉莉花发酵提取物中不添加香精等对化学成分，确保产品对人体的安全性，可以直接作为面膜或精华液或爽肤水的成品使用，比现有市面上的其他产品更加天然，不会给肌肤造成任何负作用；而且比普通提取方法获得更小的成分，更易让皮肤充分吸收；
（4）本发明提供的茉莉花发酵提取物中富含的蛋白质、多糖、黄酮等物质，与发酵滤液中的益生菌发酵产物成分具有协同作用，从而具有显著地抗氧化及抗衰老作用。
附图说明
图1为茉莉花双菌发酵化妆品的制备方法的实施例2中不同浓度的茉莉花发酵提取物与DPPH自由基清除率的关系曲线。
图2为茉莉花双菌发酵化妆品的制备方法的实施例2中茉莉花发酵提取物对胶原蛋白合成的影响柱状图。
图3为茉莉花双菌发酵化妆品的制备方法的实施例2中不同浓度的茉莉花发酵提取物与对成纤维细胞存活率的影响曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本专利的技术方案作进一步详细地说明。
实施例1
1、菌种的活化：
挑取酿酒酵母菌落一环于液体培养基中，放入摇床中将菌种活化，得到活化后的酿酒酵母。
挑取植物乳杆菌菌落一环于液体培养基中，放入摇床中将菌种活化，得到活化后的植物乳杆菌。
2、菌种的纯化：
将步骤1得到的活化后的酿酒酵母和活化后的植物乳杆菌梯度稀释铺板，以便获取单菌落，得到纯化后的酿酒酵母和植物乳杆菌。
3、菌种的扩大培养：
将步骤2得到的纯化后的酿酒酵母的菌种接种到液体培养基中，于28℃的摇床中培养，当OD值为0.7时，得到酿酒酵母发酵菌菌液（菌种处在对数期，浓度为1×107 CFU/mL）。
将步骤2得到的纯化后的植物乳杆菌的菌种接种到液体培养基中，于40℃的培养箱中培养，当OD值为0.7时，得到植物乳杆菌发酵菌菌液（菌种处在对数期，浓度为1×107 CFU/mL）。
4、茉莉花发酵提取物的获得：
将20mL步骤3得到的酿酒酵母发酵菌菌液接种到由10g的茉莉花干粉和500g的水，经过第一次高温灭菌（121℃，15min）得到的初级发酵底物中，酿酒酵母菌种总量和茉莉花初级发酵底物的配比为2.5×108CFU：500g。将发酵体系于28℃摇床中发酵48h后，进行第二次高温灭菌（90℃，40min），冷却后得到二次发酵底物；将10mL步骤3得到的植物乳杆菌发酵菌菌液接种到500g二次发酵底物中，并在42℃培养箱中发酵12h，随后进行第三次高温灭菌（100℃，30min），使菌失活，得到灭菌后的发酵产物；将灭菌后的发酵产物于6000r/min、离心半径为9cm的条件下离心20min，弃沉淀，收集上清液，即为最终茉莉花发酵提取物。
该实施例制备所得的茉莉花发酵提取物的外观为粘稠液体、颜色为透明无色至棕黄色。pH值4.0-7.0，粘度50-500cP，可溶性固含物含量0.5-5.0%，菌落总数小于50 CFU/mL，无致病菌检出。根据化妆品卫生标准GB7916-87，化妆品细菌总数不高于1000CFU/mL，所以此茉莉花发酵提取物符合化妆品质量要求。
对该茉莉花发酵提取物进行成分分析，蛋白质检测方法参照GB5009.5-2010；粗多糖检测方法参照GB/T 5009.8-2008；氨基酸检测方法参照GB/T 5009.124-2003所得结果如下：
本发明制得的茉莉花发酵提取物含蛋白质127.5μg/mL、粗多糖300.8μg/mL、总黄酮80.9μg/mL（以芦丁计）。
实施例2、茉莉花发酵提取物在作为化妆品（面膜或精华液或爽肤水）中的应用：
一、茉莉花发酵提取物的安全性检测：
人体斑贴试验主要是用于检测化妆品终产品或原料的刺激性。本发明对实施例1中获得的茉莉花发酵提取物进行人体封闭式斑贴试验，旨在对其潜在皮肤刺激性进行评估。
1、试验对象：
选择合适的志愿者30人，年龄范围在18-60岁随机选择。
2、试验方法：
若为固体样品或半固体的样品，则称取0.020g-0.025g置于斑试器中备用；若是液体样品，则量取0.025mL-0.2mL滴加于滤纸片上，再将滤纸片置于斑试器内。本发明采用后者，每个样品均设置空白对照，在对照斑试器孔内加入与样品等量的样品溶剂，如蒸馏水或橄榄油，本发明采用蒸馏水。
试验部位选为人体背部，利用无刺激性的胶带将斑试器固定贴敷于受试者背部。测试周期持续24h。为了试验结果的准确、可信和科学，在测试期间志愿者按照要求，不能摘掉斑试器，亦不可使受试部位接触水。24h后去除斑试器，静置30min后，等待压痕消失，观察皮肤的反应。如果试验结果为阴性，则需要在斑贴试验后24h和48h分别再观察一次。
3、试验结果：
斑贴试验结果如下表1所示：
其中，*"-" = 阴性反应；
一级不良反应："±" = 可疑反应：仅有微弱红斑；
二级不良反应："+" = 弱阳性反应（红斑反应）：红斑、浸润、水肿、可有丘疹；
三级不良反应："++" = 强阳性反应（疱疹反应）：红斑、浸润、水肿、丘疹、疱疹，反应可超出受试区；
四级不良反应："+++" = 极强阳性反应（融合性疱疹反应）：明显红斑、严重浸润、水肿、融合性疱疹，反应超出受试区。
判断标准：30 例中出现二级皮肤不良反应的人数多于2例，或出现任何1例三级或三级以上皮肤不良反应时，则判定受试物对人体有不良反应，反之，则视为对人体无不良反应。
表1、实施例1获得的茉莉花发酵提取物的斑贴试验结果
从表1中可以看出：实施例1得到的茉莉花发酵提取物均未产生可疑反应，说 明本发明提供的茉莉花发酵提取物均具有安全性，不会给人体带来不良反应。
二、茉莉花发酵提取物的抗氧化性能检测：
1、DPPH自由基清除实验
取不同量的实施例1得到的茉莉花发酵提取物溶于去离子水中，制得一系列体积百分含量（2%、4%、6%、8%、10%）的茉莉花发酵提取物待测液。
DPPH自由基清除实验的具体实验步骤为：
（1）取等体积（一般为3mL）的莉花发酵提取物待测液与2×10-4mol/L的DPPH溶液混匀（A1管）；
（2）取等体积的无水乙醇(待测物溶剂)与2×10-4mol/L的DPPH溶液混匀（A2管）；
（3）取等体积的无水乙醇与待测液混匀（A3管）；
（4）反应30min后，在517nm下测A1、 A2、 A3管吸光度值。
清除率计算公式为：清除率（%）=[(A2+A3)-A1]/A2
以茉莉花发酵提取物待测液的体积百分含量为横坐标，清除率为纵坐标，做出茉莉花发酵提取物对DPPH自由基清除作用曲线，见图1。
由图1可知，实施例1所得莉花发酵提取物对DPPH自由基清除率很强，且随浓度增加清除能力不断增强。莉花发酵提取物的质量分数为10%时清除率达100%。
2、对胶原蛋白合成的影响
取适当浓度的茉莉花发酵提取物，作用于成纤维细胞24 h后，使用无菌管收集细胞培养液，2000-3000 rpm离心20 min，保存上清液。采用南京建成生产的人Ⅰ型胶原（COLⅠ）酶联免疫检测试剂盒进行检测，具体根据说明书的步骤进行操作，结果见图2。
从图2中可以看出，茉莉花发酵提取物作用下成纤维细胞中胶原蛋白含量显著增加，远高于空白对照含量。适当浓度的茉莉花发酵提取物有促进胶原蛋白合成的作用。
3、成纤维细胞增殖实验
收集对数期细胞，铺板使待测细胞密度至 5000 个/孔，于 5%CO2，37℃条件下培养，细胞生长至一定密度，换液加入不同浓度梯度的样品，以不含样品的培养液为对照。继续培养24小时，每孔加入 20 μl 0.5% MTT 溶液（即5 mg/ml），培养 4 h后弃去培养液，用PBS 小心冲洗 2-3 遍后，每孔加入 150 μl 二甲基亚砜，于摇床上低速振荡 10 min，使结晶物充分溶解。于490 nm 处测量各孔的吸光值。细胞存活率=(测定孔OD值-空白对照OD值)/(细胞对照组OD值-空白对照OD值)*100%，结果见图3。
从图3中可以看出，0.31%-5%浓度范围的茉莉花发酵提取物对成纤维细胞没有毒性，细胞存活率在100%以上，且在2.5%浓度范围内，成纤维细胞活率高于110%。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
Claims (8)
1.一种茉莉花双菌发酵化妆品的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)获取初级发酵底物：将茉莉花干粉与去离子水混合后，进行第一次高温灭菌，冷却，获得初级发酵底物，茉莉花干粉和去离子水的配比为（5-30）g：500g；
（2）获得二次发酵底物：在初级发酵底物中接入酿酒酵母，进行初次发酵，初级发酵底物与酿酒酵母的配比为500g：（10-50）mL，酿酒酵母的菌种数为10 6 -10 9 CFU/mL，并进行第二次高温灭菌、冷却，获得二次发酵底物；
（3）获得茉莉花发酵提取物：在二次发酵底物中接入植物乳杆菌，进行二次发酵，并进行第三次高温灭菌、冷却、离心、取上清液，获得茉莉花发酵提取物。
2.根据权利要求1所述的茉莉花双菌发酵化妆品的制备方法，其特征在于，所述初次发酵的温度为25-35℃，时间为24-72h。
3.根据权利要求1所述的茉莉花双菌发酵化妆品的制备方法，其特征在于，所述二次发酵底物与植物乳杆菌的配比为500g：（5-30）mL，其中植物乳杆菌的菌种数为10 6 -10 9CFU/mL。
4.根据权利要求1所述的茉莉花双菌发酵化妆品的制备方法，其特征在于，所述二次发酵的温度为25-45℃，时间为8-48h。
5.根据权利要求1所述的茉莉花双菌发酵化妆品的制备方法，其特征在于，所述酿酒酵母和植物乳杆菌为培养液或悬浮液的形式存在，所述酿酒酵母的培养液或悬浮液的pH值为5.0-7.0，植物乳杆菌的培养液或悬浮液的pH值为4.0-7.0。
6.根据权利要求1所述的茉莉花双菌发酵化妆品的制备方法，其特征在于，所述第一次高温灭菌的条件如下：灭菌温度为115-121℃，灭菌时间为10-40min；所述第二次高温灭菌的条件如下：灭菌温度为80-105℃，灭菌时间为30-60min；所述第三次高温灭菌的条件如下：灭菌温度为80-115℃，灭菌时间为20-40min。
7.根据权利要求1或6所述的茉莉花双菌发酵化妆品的制备方法，其特征在于，所述离心的转速为4000-10000r/min，离心时间为10-30min，离心半径为9cm。
8.一种如权利要求1-7任一所述的茉莉花双菌发酵化妆品的制备方法所得到的茉莉花发酵提取物在制备具有抗衰老和/或清除DPPH自由基功能的产品中的应用。
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