CN113855603B - 一种组合发酵物、含其皮肤外用剂及其制备方法和应用 - Google Patents

一种组合发酵物、含其皮肤外用剂及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种组合发酵物、含其皮肤外用剂及其制备方法和应用。组合发酵物的制备方法包括如下步骤：德氏乳杆菌保加利亚亚种接种到发酵底物中，经发酵培养，灭菌，即可；其中，发酵底物包括仙人掌和芦荟液；德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)为购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.1.1480。本发明组合发酵物的原料来源广，制备工艺简单，制备成本低，应用广泛；工艺中无需添加外来化学试剂，减少对环境的污染；提取过程中减少活性成分的流失，发酵产物具有理想的抗氧化功效、保湿功效和抗敏功效，使用安全性高。

Description

一种组合发酵物、含其皮肤外用剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于发酵技术领域，尤其涉及一种组合发酵物、含其皮肤外用剂及其制备方法和应用。
背景技术
随着年龄、环境、季节的变化，皮肤角质层的含水量以及皮肤状态都会有所变化，当皮肤角质层含水量低于10％以下就会出现皮肤干燥的情况，皮肤处于干燥的状态会加速皮肤的衰老。当人体受到外源性因素(紫外线、环境毒素等)的影响时，会导致机体内产生过量的活性氧，进而导致氧化应激的发生，加速皮肤的衰老。随着人们对自然和健康的追求，天然植物原料备受人们青睐，天然植物原料在增强人体外观美观的同时，更具有生物相容性，对人体不产生危害。
近年来，随着人们对仙人掌的深入研究，仙人掌中的活性成分、特殊功效引起人们的广泛关注，仙人掌中主要含有黄酮、多糖、生物碱、超氧化物歧化酶(SOD)、甾醇、维生素等多种活性成分，还含有多种微量元素以及人体所必需的全部氨基酸；但目前仙人掌在化妆品领域的研究应用处于初级阶段。芦荟中含有多糖类、芦荟苷、氨基酸和维生素等多种活性成分，可以加速皮肤新陈代谢，很好的滋润人体皮肤。
现有技术中对仙人掌以及芦荟中活性成分的提取工艺主要有超声波辅助提取、微波辅助提取、乙醇浸提、索氏提取等，采用这些提取工艺所用成本较高；对活性成分的提取效率低，导致资源的浪费；所用化学试剂会对环境产生污染。目前市场上含有仙人掌活性成分的化妆品都是在化妆品基础配方内添加很少比例的仙人掌提取物，致使仙人掌提取物不能充分发挥其功效；含有芦荟活性成分的化妆品为降低成本大部分直接将芦荟液或者芦荟粉添加到化妆品基础配方内，该方法不能充分发挥芦荟的生物活性。上述缺陷严重限制了仙人掌提取物和芦荟提取物在化妆品领域的应用。
因此，本领域亟需研发一种工艺简单，成本低，对仙人掌和芦荟中有效活性成分损害小的提取方法；且保证制得的提取物具有理想的美容护肤功效，对肌肤无刺激作用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中仙人掌提取物和芦荟提取物的制备工艺复杂，制备成本高；活性成分的提取率低，导致资源浪费；提取过程中外加化学试剂，污染环境；严重限制二者在化妆品领域的应用等缺陷，而提供一种组合发酵物、含其皮肤外用剂及其制备方法和应用。本发明中利用德氏乳杆菌保加利亚亚种对仙人掌和芦荟液的组合物进行发酵得到一种组合发酵物，原料来源广泛，制备工艺简单，制备成本低，既可以做化妆品直接使用，也可以作为添加剂或是基底用于制备化妆品，应用广泛。采用发酵提取工艺无需添加外来化学试剂，减少对环境的污染；提取过程中减少活性成分的流失，发酵产物具有理想的抗氧化功效、保湿功效和抗敏功效，使用安全性高。
本发明采用以下技术方案解决上述技术问题：
本发明提供一种组合发酵物的制备方法，具体包括如下步骤：德氏乳杆菌保加利亚亚种接种到发酵底物中，经发酵培养，灭菌，即可；其中，所述发酵底物包括仙人掌和芦荟液；所述德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)为购自中国普通微生物菌种保藏管理中心的保藏编号为CGMCC No.1.1480的德氏乳杆菌保加利亚亚种。
一些实施例中，所述德氏乳杆菌保加利亚亚种可按照本领域常规以德氏乳杆菌保加利亚亚种菌液的形式添加，所述德氏乳杆菌保加利亚亚种菌液中所述德氏乳杆菌保加利亚亚种的浓度可为104～109CFU/g，较佳地为107～108CFU/g。
一些实施例中，单位质量的所述发酵底物中接种的所述德氏乳杆菌保加利亚亚种的数量可为本领域常规，较佳地为7.5×102～3×108CFU/g，更佳地为7.5×105～3×107CFU/g。
一些实施例中，所述芦荟液的制备方法可为本领域常规，一般包括如下步骤：去皮的成熟芦荟鲜叶经榨汁，提取，脱色，过滤，即可。
其中，所述成熟芦荟鲜叶可为本领域常规使用的成熟库拉索芦荟鲜叶。
其中，所述过滤的操作后还可进一步包括浓缩的操作。所述浓缩的方法可为膜过滤法。所述浓缩的操作前和操作后的物料体积比可为本领域常规，一般可为(8～15)：1，较佳地为10：1。
一些实施例中，所述芦荟液可为云南万绿生物股份有限公司生产的库拉索芦荟凝胶汁。
一些实施例中，所述仙人掌与所述芦荟液的重量份数比可为1：(0.25～50)，较佳地为1：(1～40)，更佳地为1：(10～40)，例如1：6.7。
一些实施例中，所述发酵底物中还可进一步包括水。所述水可为本领域常规使用的去离子水。
其中，所述仙人掌与所述水的重量份数比可为1：(50～200)，较佳地为1：(100～200)，例如1：67。
一较佳实施方案中，所述发酵底物由1份所述仙人掌、0.25～50份所述芦荟液和50～200份所述水组成。
一些实施例中，所述发酵底物在使用前还可进一步包括匀浆和/或灭菌的操作。
其中，所述灭菌的条件和方法可为本领域该类操作常规的条件和方法，一般可为高压蒸汽灭菌法。
当采用所述高压蒸汽灭菌法进行所述灭菌时，所述灭菌的温度可为本领域该类操作常规的温度，较佳地为105～125℃，更佳地为118～121℃。
当采用所述高压蒸汽灭菌法进行所述灭菌时，所述灭菌的时间可为本领域该类操作常规的时间，较佳地为25～35min，更佳地为30～35min。
当采用所述高压蒸汽灭菌法进行所述灭菌时，所述灭菌的压力可为本领域该类操作常规的压力，较佳地为0.1～0.15Mpa，更佳地为0.1～0.12MPa。
其中，按照本领域常规，所述灭菌后还可进一步包括冷却的操作，一般为冷却至室温。
一些实施例中，所述发酵培养的条件和方法可为本领域常规，一般可在摇床上进行，所述摇床的转速可为100～300rpm，较佳地为180～300rpm。
一些实施例中，所述发酵培养的时间可为12～30h，较佳地为12～20h，更佳地为14～16h，例如15h。研发过程中发现，当所述发酵培养的时间短于本申请限定范围时，不能对所述仙人掌和所述芦荟液中的活性成分进行充分的提取和修饰，达不到理想的护肤效果；当所述发酵培养的时间长于本申请限定范围时，所述德氏乳杆菌保加利亚亚种则会消耗其中的活性物质，减弱终产品的护肤效果。
一些实施例中，所述发酵培养的温度可为本领域该类操作常规的温度，较佳地为30～50℃，更佳地为40～50℃。
一些实施例中，所述灭菌的条件和方法可为本领域常规，一般可为高压蒸汽灭菌法。
当采用所述高压蒸汽灭菌法进行所述灭菌时，所述灭菌的温度可为本领域该类操作常规的温度，较佳地为105～125℃，更佳地为121～125℃。
当采用所述高压蒸汽灭菌法进行所述灭菌时，所述灭菌的时间可为本领域该类操作常规的时间，较佳地为20～30min。
当采用所述高压蒸汽灭菌法进行所述灭菌时，所述灭菌的压力可为本领域该类操作常规的压力，较佳地为0.1～0.15MPa，更佳地为0.1～0.12MPa。
一些实施例中，所述灭菌的操作后，还可进一步包括离心和/或与防腐剂混合的操作。
其中，所述离心的转速可为本领域该类操作常规的转速，较佳地为3000～8000rpm，更佳地为4800～8000r/min。
其中，所述离心的半径可为本领域该类操作常规的半径，较佳地为5～15cm，更佳地为8～15cm。
其中，所述离心的时间可为本领域该类操作常规的时间，较佳地为10～40min，更佳地为30～40min。
其中，所述离心的操作后还可进一步包括二次灭菌的操作。所述二次灭菌的条件和方法可为本领域常规，一般可为高压蒸汽灭菌法。所述二次灭菌的温度可为本领域该类操作常规的温度，较佳地为105～125℃，更佳地为121～125℃。所述二次灭菌的时间可为本领域该类操作常规的时间，较佳地为20～30min。所述二次灭菌的压力可为本领域该类操作常规的压力，较佳地为0.1～0.15MPa，更佳地为0.1～0.12MPa。
其中，与所述防腐剂混合的过程中，所述混合的温度可为本领域该类操作常规的温度，较佳地为50～70℃，更佳地为55～65℃。
其中，所述防腐剂可按照本领域常规包括对对羟基苯乙酮和/或1,2-己二醇。当所述防腐剂包括所述对羟基苯乙酮和所述1,2-己二醇时，所述对对羟基苯乙酮占所述灭菌后制得物料的质量百分数可为0.1％～0.5％，所述1,2-己二醇占所述灭菌后制得物料的质量百分数可为0.5％～2％；较佳地，所述对羟基苯乙酮占所述灭菌后制得物料的质量百分数为0.2％，所述1,2-己二醇占所述灭菌后制得物料的质量百分数为1％。
本发明还提供一种组合发酵物，其由如上所述的组合发酵物的制备方法制得。
本发明还提供一种如上所述的组合发酵物直接作为产品、作为添加剂或作为基底在制备皮肤外用剂中的应用。
一些实施例中，所述组合发酵物可作为所述皮肤外用剂中的抗氧化活性成分、保湿活性成分和抗敏活性成分中任意一种或多种。
其中，所述抗氧化活性成分可为具有DPPH自由基清除作用的抗氧化活性成分。
其中，所述抗敏活性成分可为具有抑制透明质酸酶活性作用的抗敏活性成分。
本发明还提供一种皮肤外用剂，其包括如上所述的组合发酵物。
一些实施例中，所述皮肤外用剂中还可进一步包括本领域常规使用的活性成分，一般可包括保湿活性成分、美白活性成分、抗炎活性成分、抗敏活性成分和抗氧化活性成分中的任意一种或多种。
一些实施例中，所述皮肤外用剂可按照本领域常规包括但不限于面膜、精华或爽肤水。
一些实施例中，所述组合发酵物占所述皮肤外用剂的质量百分比可为5％～100％，较佳地为55％～65％。
一些实施例中，所述室温一般指15～40℃。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：本发明利用德氏乳杆菌保加利亚亚种对仙人掌和芦荟液的组合物进行发酵，一方面，可以减少植物中活性成分的流失，植物中各活性成分能够被更加充分的利用；另一方面，发酵提取技术相比于其他提取工艺，能耗低，效率高，无需有机试剂，减少对环境的污染；发酵工艺稳定，易操作，能够实现工业大规模生产。制得的组合发酵物可以直接用作化妆品也可作为化妆品添加剂或基底，不给皮肤造成任何副作用，具备更高的安全性，还具有理想的抗氧化功效、抗敏功效和保湿功效。
附图说明
本公开可以通过参考下文中结合附图所给出的描述而得到更好的理解。所述附图连同下面的详细说明一起包含在本说明书中并且形成本说明书的一部分，而且用来进一步举例说明本公开的优选实施例和解释本公开的原理和优点。其中：
图1为不同浓度的本发明实施例1～4和对比例1制得的组合发酵物处理人体皮肤成纤维细胞后，细胞存活率结果对比图；
图2为采用本发明实施例1～4和对比例1制得的组合发酵物处理肌肤后，与本底值相比，肌肤所含水分增加量随时间变化的对比图；
图3为不同浓度本发明实施例1～4和对比例1制得的组合发酵物对DPPH自由基清除率的对比图。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
在下文中将结合附图对本公开的示范性实施例进行描述。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中的德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus)购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCCNo.1.1480。
下述实施例中，仙人掌购于江苏米邦塔仙人掌商贸有限公司。
下述实施例中，芦荟液为购于云南万绿生物股份有限公司的库拉索芦荟凝胶汁。
实施例1
1、称取去皮仙人掌1g和10g芦荟液以及100g去离子水于匀浆机中匀浆，将匀浆液置于500mL的三角瓶中，于匀浆机中加入100g去离子水，润洗残余匀浆液，均转移到500mL的三角瓶中，用封口膜封口后，在121℃、0.12Mpa条件下高温高压灭菌，灭菌时间为30min；灭菌完成后，静置至常温，即得发酵底物；
2、将德氏乳杆菌保加利亚亚种溶解于无菌去离子水中，制得浓度为107-108CFU/g的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌液，取15g溶解好的菌液接种于上述步骤1制得的发酵底物中，用封口膜封口；在温度为40℃，转速为180r/min的恒温震荡培养箱中培养15h得到组合发酵物粗品；
3、将步骤2中得到的组合发酵物粗品在121℃、0.12Mpa条件下高温高压灭菌，灭菌时间为30min；灭菌完成后进行离心，离心转速为4800r/min，离心半径为8cm，离心时间为30min；离心完弃沉淀取上清液，上清液再于121℃、0.12Mpa条件下高温高压灭菌，灭菌时间为30min，灭菌完成后静置至室温即为组合发酵物。
实施例2
1、称取去皮仙人掌1g和1g芦荟液以及100g去离子水于匀浆机中匀浆，将匀浆液置于500mL的三角瓶中，于匀浆机中加入100g去离子水，润洗残余匀浆液，均转移到500mL的三角瓶中，用封口膜封口后，在121℃、0.12Mpa条件下高温高压灭菌，灭菌时间为30min；灭菌完成后，静置至常温，即得发酵底物；
2、将德氏乳杆菌保加利亚亚种溶解于无菌去离子水中，制得浓度为107-108CFU/g的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌液，取15g溶解好的菌液接种于上述步骤1制得的发酵底物中，用封口膜封口；在温度为40℃，转速为180r/min的恒温震荡培养箱中培养15h得到组合发酵物粗品；
3、将步骤2中得到的组合发酵物粗品在121℃、0.12Mpa条件下高温高压灭菌，灭菌时间为30min；灭菌完成后进行离心，离心转速为4800r/min，离心半径为8cm，离心时间为30min；离心完弃沉淀取上清液，上清液再于121℃、0.12Mpa条件下高温高压灭菌，灭菌时间为30min，灭菌完成后静置至室温即为组合发酵物。
实施例3
1、称取去皮仙人掌1g和40g芦荟液以及100g去离子水于匀浆机中匀浆，将匀浆液置于500mL的三角瓶中，于匀浆机中加入100g去离子水，润洗残余匀浆液，均转移到500mL的三角瓶中，用封口膜封口后，在121℃、0.12Mpa条件下高温高压灭菌，灭菌时间为30min；灭菌完成后，静置至常温，即得发酵底物；
2、将德氏乳杆菌保加利亚亚种溶解于无菌去离子水中，制得浓度为107-108CFU/g的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌液，取15g溶解好的菌液接种于上述步骤1制得的发酵底物中，用封口膜封口；在温度为40℃，转速为180r/min的恒温震荡培养箱中培养15h得到组合发酵物粗品；
3、将步骤2中得到的组合发酵物粗品在121℃、0.12Mpa条件下高温高压灭菌，灭菌时间为30min；灭菌完成后进行离心，离心转速为4800r/min，离心半径为8cm，离心时间为30min；离心完弃沉淀取上清液，上清液再于121℃、0.12Mpa条件下高温高压灭菌，灭菌时间为30min，灭菌完成后静置至室温即为组合发酵物。
实施例4
1、称取去皮仙人掌3g和20g芦荟液以及100g去离子水于匀浆机中匀浆，将匀浆液置于500mL的三角瓶中，于匀浆机中加入100g去离子水，润洗残余匀浆液，均转移到500mL的三角瓶中，用封口膜封口后，在121℃、0.12Mpa条件下高温高压灭菌，灭菌时间为30min；灭菌完成后，静置至常温，即得发酵底物；
2、将德氏乳杆菌保加利亚亚种溶解于无菌去离子水中，制得浓度为107-108CFU/g的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌液，取溶解好的菌液15g接种于上述步骤1制得的发酵底物中，用封口膜封口；在温度为40℃，转速为180r/min的恒温震荡培养箱中培养30h得到组合发酵物粗品；
3、将步骤2中得到的组合发酵物粗品在115℃、0.3Mpa条件下高温高压灭菌，灭菌时间为30min；灭菌完成后进行离心，离心转速为4800r/min，离心半径为8cm，离心时间为30min；离心完弃沉淀取上清液，上清液再于121℃、0.12Mpa条件下高温高压灭菌，灭菌时间为30min，灭菌完成后静置至室温即为组合发酵物。
实施例5
与实施例1相比，区别仅在于步骤(3)结束后还进一步与防腐剂混合，防腐剂为对对羟基苯乙酮和1,2-己二醇，对羟基苯乙酮占灭菌后制得物料的质量百分数为0.2％，1,2-己二醇占灭菌后制得物料的质量百分数为1％，混合的温度为55℃，其他条件参数同实施例1，制得组合发酵物。
对比例1
与实施例1相比，区别仅在于菌种为德氏乳杆菌保加利亚亚种，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.1.2717，其他条件参数同实施例1。
采用该菌种进行发酵得到的组合发酵物会有不愉悦的味道，不宜用作化妆品使用。
对比例2
称取去皮仙人掌1g和10g芦荟液以及100g去离子水于匀浆机中匀浆，将匀浆液置于500mL的三角瓶中，于匀浆机中加入100g去离子水，润洗残余匀浆液，均转移到500mL的三角瓶中，用封口膜封口后，在121℃、0.12Mpa条件下高温高压灭菌，灭菌时间为30min；灭菌完成后进行离心，离心转速为4800r/min，离心半径为8cm，离心时间为30min；离心完弃沉淀取上清液，上清液再于121℃、0.12Mpa条件下高温高压灭菌，灭菌时间为30min，灭菌完成后静置至室温，即可。
效果实施例1理化性质的分析
理化性质的测试方法参考《化妆品安全技术规范》(2015年版)。结果符合化妆品质量要求，具体为：
实施例1制得组合发酵物的外观透明至半透明液体，颜色为无色至浅黄色，气味为特征性气味；
采用上海仪电科学仪器股份有限公司生产的pH计测试实施例1制得组合发酵物的pH值为4.5-6.0；
菌落总数小于100CFU/g，无致病菌检出，符合化妆品卫生标准GB7916-87，即符合化妆品细菌总数不能高于1000CFU/g的规定。
效果实施例2细胞毒性实验
本实验采用人体皮肤成纤维细胞，来自中国科学细胞库，验证上述实施例1～4和对比例1制得产品的细胞毒性。
试剂：0.25％(含EDTA)胰蛋白酶的生产厂家为美国GIBCO公司；DMEM培养基的生产厂家为美国GIBCO公司；双抗的生产厂家为美国Corning公司；CCK-8的生产厂家为北京拜尔迪生物技术有限公司；胎牛血清的生产厂家为美国GIBCO公司；磷酸盐缓冲液的生产厂家为北京百瑞极生物科技有限公司。
设备：WJ-80A-Ⅱ型CO2恒温培养箱的厂家为上海圣科仪器设备有限公司；Sunrise酶标仪的厂家为帝肯贸易有限公司；TL80-2型医用离心机的厂家为江苏天力医疗器械有限公司；NUNC 96孔细胞培养板的厂家为赛默飞世尔科技公司。
1、实验步骤：
分别将上述实施例1～4和对比例1制得的组合发酵物用无血清的DMEM培养基配置成体积百分数为20％、10％、5％、2.5％、1.25％、0.63％、0.31％的实验组待测液。
人体皮肤成纤维细胞养于含10％胎牛血清以及1％双抗(1×105U/L青霉素、100mg/L链霉素)的DMEM培养基中。细胞生长于37℃、5％CO2饱和湿度的培养箱中，当细胞融合达到85％以上时，以0.05％胰酶消化对数生长期细胞，用含血清的DMEM终止消化反应。细胞计数板计数，将细胞悬液浓度调整到7×104个/mL，将细胞悬液按照每孔100μL的比例接种到96孔板上，37℃、5％CO2条件下孵育12h。
去除旧培养液，用磷酸盐缓冲液清洗细胞两遍。实验组中每孔加入100μL上述配置的已过滤除菌的不同浓度的实验组待测液，每个待测液做6个复孔；对照组含有细胞，加入无血清的DMEM培养基；空白对照组无细胞，加入100μL的PBS。再于37℃、5％CO2条件下孵育24h。然后每孔加入10μL的CCK-8溶液，再孵育3h，在450nm波长下测定吸光度值。
细胞存活率的计算公式如下：
细胞存活率(％)＝(A实验组-A空白对照组)/(A对照组-A空白对照组)×100％
实验结果见表1和图1，结果表明，采用不同浓度的本发明实施例1～4制得的组合发酵物处理人体皮肤成纤维细胞后，细胞存活率均在80％左右，大部分高于80％。可见，本发明制得的组合发酵物对细胞有无明显毒性，且细胞存活率均大于对比例1制得的组合发酵物处理后的细胞存活率。
表1
Figure BDA0003227050290000101
Figure BDA0003227050290000111
效果实施例3保湿性评价
根据《化妆品保湿功效评价指南》，用角质层含水量测试皮肤的水分含量，筛选出60位志愿者，男女各半，在温度为22±2℃，湿度为40％～60％的环境中，测试实施例1～4和对比例1制得组合发酵物对志愿者的保湿效果。
其中，测试方法如下：
清洁皮肤20min后，测定脸颊本底值(未涂抹产品的皮肤)，脸颊分别喷实施例1-4和对比例1制得的产品，轻轻按摩至吸收，采用皮肤水分测试探头Corneometer CM825测试5min后、20min后、1小时后受试部位的皮肤含水量，并计算与本底值相比含水量的提升值，结果见表2和图2。
表2
Figure BDA0003227050290000112
结果表明，采用实施例1～4制得的组合发酵物处理后，受试部位皮肤含水量明显上升，且以涂抹后5min皮肤含水量上升速度最快，效果最为明显，20min至60min增长趋势放缓，但仍然体现出理想的补水保湿功效，且补水保湿效果均优于对比例1制得的产品。
效果实施例4安全性检测
人体斑贴试验主要是用于检测化妆品终产品或原料的刺激性。根据《化妆品卫生规范》(2015)对实施例1～4和对比例1制得的产品进行人体封闭式斑贴试验，旨在对其皮肤刺激性进行评估。
1、试验对象：
严格按照《化妆品接触性皮炎诊断标准及处理原则》要求，选择受试对象，皮肤的待测部位出现瘢痕、鲜红斑痣等影响结果判定的受试者、体质高度敏感者均不能参与试验。本试验选择选择合适的志愿者30人，年龄范围在18-60岁随机选择。
2、实验方法
分别将0.2mL上述实施例1～4和对比例1制得的产品滴加在滤纸片上，再将滤纸片置于斑试器内。设置空白对照，即在对照斑试器孔内加入与样品等量的样品溶剂蒸馏水。测试周期持续24h。为了试验结果的准确、可信和科学，在测试期间志愿者按照要求，不能摘掉斑试器，亦不可使受试部位接触水。24h后去除斑试器，静置30min后，等待压痕消失，观察皮肤的反应，接着于24h和48h后观察皮肤的反应。体斑贴试验皮肤不良反应分级标准参见表3。
表3皮肤不良反应分级标准
Figure BDA0003227050290000121
3、试验结果
结果参见表4，从表中可以看出；本发明实施例1～4制得的组合发酵物试敏结果都是阴性反应，说明本发明制得的组合发酵物具有良好的安全性和耐受性，不会给人体带来不良反应。而对比例1制得的组合发酵物的使用安全性相对较差，部分受试者出现不良反应。
表4
Figure BDA0003227050290000122
Figure BDA0003227050290000131
效果实施例5 DPPH自由基清除率的测试
DPPH是一种早期合成的有机自由基，常用来评估抗氧化物的供氢能力，它在有机溶剂中非常稳定，呈紫色，而且在517nm处有一个特征吸收峰，当遇到自由基清除剂时，DPPH的孤对电子被配对而使其退色，也就是在最大吸收波长处的吸光值变小。因此，可通过测定吸光值的变化来评价样品对DPPH自由基的清除效果。
取去离子水分别稀释实施例1～4和对比例1制得的组合发酵物，分别制得体积百分浓度为6.25％、12.5％、25％、50％、100％的一系列待测液。
DPPH自由基清除实验的具体实验步骤为：
(1)取等体积(1mL)的待测液与2×10-4mol/L的DPPH溶液混匀(A1管)；
(2)取等体积(1mL)的无水乙醇(待测物溶剂)与2×10-4mol/L的DPPH溶液混匀(A2管)；
(3)取等体积(1mL)的无水乙醇与待测液混匀(A3管)；
(4)避光反应30min后，在517nm下测A1管、A2管、A3管吸光度值；
清除率计算公式为：清除率＝[(A2+A3)-A1]/A2×100％。
以待测液的体积百分浓度为横坐标，清除率为纵坐标，制作DPPH自由基清除作用曲线，结果见表5和图3，结果表明实施例1～4制得的组合发酵物可以清除DPPH自由基，具有较强的抗氧化能力，且抗氧化能力明显优于对比例1制得的组合发酵物。
表5
Figure BDA0003227050290000141
效果实施例6透明质酸酶抑制率
测试实施例1和对比例2制得产品对透明质酸酶的抑制率，具体方法如下：
试剂：透明质酸酶、透明质酸钠、无水乙醇、氢氧化钠、无水碳酸钠、浓盐酸、对-二甲氨基苯甲醛、乙酰丙酮、冰醋酸、无水氯化钙。
设备：Sunrise酶标仪的厂家为帝肯贸易有限公司；上海博讯实业有限公司医疗设备厂的数显恒温水浴锅；
取0.1mL CaCl2溶液(0.25mmol/L)和0.5mL透明质酸酶液(100U/mL)于37℃下水浴恒温培养20min；加入受试样品液0.5mL(实施例1或对比例2制得的产品)，继续在保温20min；再加入0.5mL透明质酸钠液(0.5mg/mL)，37℃水浴恒温培养30min后取出，在常温下放置5min；加入0.1mL NaOH溶液(0.4mol/L)和0.5mL乙酰丙酮溶液(3.5mL乙酰丙酮溶于50mL的1.0mol/L碳酸钠溶液中)，于沸水浴中加热15min后立即转移至冰水水浴冷却5min；滴加1.0mL埃尔利希试剂(0.8g对-二甲基氨基苯甲醛溶于15mL浓盐酸和15mL无水乙醇中)，并用3.0mL无水乙醇稀释，室温放置20min显色，用分光光度计测定波长为540nm处吸光度值。样品对透明质酸酶抑制率的测定计算公式如下：
透明质酸酶抑制率＝[(A-B)-(C-D)]/(A-B)×100％；
式中：A—对照溶液吸光度值(用醋酸缓冲溶液代替样品溶液)；B—对照空白溶液吸光度值(用醋酸缓冲溶液代替样品溶液及酶液)；C—试样溶液吸光度值；D—试样空白溶液吸光度值(用醋酸缓冲溶液代替酶液)；
实施例1和对比例2制得产品对透明质酸酶抑制率的结果见表6。结果表明，本发明实施例1制得的组合发酵物与未发酵的原料(对比例2)相比，对透明质酸酶的抑制率明显提高，说明本发明制得的组合发酵物具有更理想的抗敏效果。
表6
对比例2 实施例1
透明质酸酶抑制率 56.08％ 71.35％
效果实施例7
采用北京索莱宝科技有限公司生产的货号为BC2715的总糖含量检测试剂盒测试实施例1和对比例2制得产品中总糖含量，结果见表7。结合效果实施例6的结果可知，不同制备工艺制得的提取物中有效活性成分的种类、含量和功效均有较大差异。
表7
对比例2 实施例1
总糖含量 1.32mg/mL 1.88mg/mL
最后，还需要说明的是，在本发明中术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管上面已经通过本公开的具体实施例的描述对本公开进行了披露，但是，应该理解，本领域技术人员可在所附方案的精神和范围内设计对本公开的各种修改、改进或者等同物。这些修改、改进或者等同物也应当被认为包括在本公开所要求保护的范围内。

Claims (28)

1.一种组合发酵物的制备方法，其特征在于，具体包括如下步骤：德氏乳杆菌保加利亚亚种接种到发酵底物中，经发酵培养，灭菌，离心，所述离心后取上清液，即可；其中，所述发酵底物包括去皮仙人掌、芦荟液和水；所述德氏乳杆菌保加利亚亚种（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）为购自中国普通微生物菌种保藏管理中心的保藏编号为CGMCC No. 1.1480的德氏乳杆菌保加利亚亚种；
单位质量的所述发酵底物中接种的所述德氏乳杆菌保加利亚亚种的数量为7.5×102~3×108CFU/g；
所述去皮仙人掌与所述芦荟液的重量份数比为1：（0.25~50）；
所述发酵培养的时间为12~30h；
所述发酵培养的温度为30~50℃。
2.如权利要求1所述的组合发酵物的制备方法，其特征在于，所述组合发酵物的制备方法满足下述条件：
单位质量的所述发酵底物中接种的所述德氏乳杆菌保加利亚亚种的数量为7.5×105~3×107 CFU/g；
所述去皮仙人掌与所述芦荟液的重量份数比为1：（1~40）；
所述水为去离子水；
所述去皮仙人掌与所述水的重量份数比为1：（50~200）；
所述发酵培养的时间为12~20h；
所述发酵培养的温度为40~50℃。
3.如权利要求2所述的组合发酵物的制备方法，其特征在于，所述组合发酵物的制备方法满足下述条件：
所述去皮仙人掌与所述芦荟液的重量份数比为1：（10~40）；
所述去皮仙人掌与所述水的重量份数比为1：（100~200）；
所述发酵培养的时间为14~16h。
4.如权利要求2所述的组合发酵物的制备方法，其特征在于，所述去皮仙人掌与所述芦荟液的重量份数比为1：6.7。
5.如权利要求1所述的组合发酵物的制备方法，其特征在于，所述组合发酵物的制备方法满足下述条件：
所述德氏乳杆菌保加利亚亚种以德氏乳杆菌保加利亚亚种菌液的形式添加，所述德氏乳杆菌保加利亚亚种菌液中所述德氏乳杆菌保加利亚亚种的浓度为104~109CFU/g；
所述芦荟液的制备方法包括如下步骤：去皮的成熟芦荟鲜叶经榨汁，提取，脱色，过滤，即可；
所述发酵培养在摇床上进行，所述摇床的转速为100~300rpm；
所述灭菌的方法为高压蒸汽灭菌法。
6.如权利要求5所述的组合发酵物的制备方法，其特征在于，所述组合发酵物的制备方法满足下述条件：
所述德氏乳杆菌保加利亚亚种以德氏乳杆菌保加利亚亚种菌液的形式添加，所述德氏乳杆菌保加利亚亚种菌液中所述德氏乳杆菌保加利亚亚种的浓度为107~108CFU/g；
所述芦荟液的制备方法中，所述成熟芦荟鲜叶为成熟库拉索芦荟鲜叶；
所述芦荟液的制备方法中，所述过滤的操作后还进一步包括浓缩的操作；
所述发酵培养在摇床上进行，所述摇床的转速为180~300rpm；
所述灭菌的温度为105~125℃；
所述灭菌的时间为20~30min；
所述灭菌的压力为0.1~0.15MPa。
7.如权利要求6所述的组合发酵物的制备方法，其特征在于，所述组合发酵物的制备方法满足下述条件：
所述浓缩的方法为膜过滤法；
所述灭菌的温度为121~125℃；
所述灭菌的压力为0.1~0.12MPa。
8.如权利要求7所述的组合发酵物的制备方法，其特征在于，所述浓缩的操作前和操作后的物料体积比为（8~15）：1。
9.如权利要求8所述的组合发酵物的制备方法，其特征在于，所述浓缩的操作前和操作后的物料体积比为10：1。
10.如权利要求1所述的组合发酵物的制备方法，其特征在于，所述发酵底物由1份所述去皮仙人掌、0.25~50份所述芦荟液和50~200份所述水组成。
11.如权利要求1所述的组合发酵物的制备方法，其特征在于，所述灭菌后的所述离心的转速为3000~8000rpm；
所述灭菌后的所述离心的半径为8~15cm；
所述灭菌后的所述离心的时间为10~40min；
所述灭菌后的所述离心结束后，还进一步包括二次灭菌的操作。
12.如权利要求11所述的组合发酵物的制备方法，其特征在于，所述灭菌后的所述离心的转速为4800~8000r/min；
所述灭菌后的所述离心的时间为30~40min；
所述二次灭菌方法为高压蒸汽灭菌法；
所述二次灭菌的温度为105~125℃；
所述二次灭菌的时间为20~30min；
所述二次灭菌的压力为0.1~0.15Mpa。
13.如权利要求12所述的组合发酵物的制备方法，其特征在于，所述二次灭菌的温度为121~125℃；
所述二次灭菌的压力为0.1~0.12Mpa。
14.如权利要求1~13中任意一项所述的组合发酵物的制备方法，其特征在于，所述离心的操作后，还进一步包括与防腐剂混合的操作。
15.如权利要求14所述的组合发酵物的制备方法，其特征在于，所述组合发酵物的制备方法满足下述条件：
与所述防腐剂混合的过程中，所述混合的温度为50~70℃；
所述防腐剂包括对羟基苯乙酮和1,2-己二醇。
16.如权利要求15所述的组合发酵物的制备方法，其特征在于，所述组合发酵物的制备方法满足下述条件：
与所述防腐剂混合的过程中，所述混合的温度为55~65℃；
所述对羟基苯乙酮占所述灭菌后制得物料的质量百分数为0.1%~0.5%，所述1,2-己二醇占所述灭菌后制得物料的质量百分数为0.5%~2%。
17.如权利要求16所述的组合发酵物的制备方法，其特征在于，所述对羟基苯乙酮占所述灭菌后制得物料的质量百分数为0.2%，所述1,2-己二醇占所述灭菌后制得物料的质量百分数为1%。
18.如权利要求1~13中任意一项所述的组合发酵物的制备方法，其特征在于，所述发酵底物在使用前还进一步包括匀浆和/或灭菌的操作。
19.如权利要求18所述的组合发酵物的制备方法，其特征在于，所述发酵底物在使用前的所述灭菌的方法为高压蒸汽灭菌法。
20.如权利要求19所述的组合发酵物的制备方法，其特征在于，所述发酵底物在使用前的所述灭菌的方法满足下述条件：
所述灭菌的温度为105~125℃；
所述灭菌的时间为25~35min；
所述灭菌的压力为0.1~0.15Mpa；
所述灭菌后包括冷却的操作，冷却至室温。
21.如权利要求20所述的组合发酵物的制备方法，其特征在于，所述发酵底物在使用前的所述灭菌的方法满足下述条件：
所述灭菌的温度为118~121℃；
所述灭菌的时间为30~35min；
所述灭菌的压力为0.1~0.12Mpa。
22.一种组合发酵物，其特征在于，其由如权利要求1~21中任意一项所述的组合发酵物的制备方法制得。
23.一种如权利要求22所述的组合发酵物直接作为产品、作为添加剂或作为基底在制备皮肤外用剂中的应用。
24.如权利要求23所述的应用，其特征在于，所述组合发酵物作为所述皮肤外用剂中的抗氧化活性成分、保湿活性成分和抗敏活性成分中任意一种或多种。
25.如权利要求24所述的应用，其特征在于，所述抗氧化活性成分为具有DPPH自由基清除作用的抗氧化活性成分；
所述抗敏活性成分为具有抑制透明质酸酶活性作用的抗敏活性成分。
26.一种皮肤外用剂，其特征在于，其包括如权利要求22所述的组合发酵物。
27.如权利要求26所述的皮肤外用剂，其特征在于，所述的皮肤外用剂满足下述条件：
所述皮肤外用剂中还进一步包括保湿活性成分、美白活性成分、抗炎活性成分、抗敏活性成分和抗氧化活性成分中的任意一种或多种；
所述皮肤外用剂包括面膜、精华或爽肤水；
所述组合发酵物占所述皮肤外用剂的质量百分比为5%~100%。
28.如权利要求27所述的皮肤外用剂，其特征在于，所述组合发酵物占所述皮肤外用剂的质量百分比为55%~65%。
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