CN113398045A - 一种抗衰老、舒缓的芦荟发酵物及其制备方法与应用 - Google Patents

一种抗衰老、舒缓的芦荟发酵物及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于日化领域，公开了一种抗衰老、舒缓的芦荟发酵物及其制备方法与应用。所述芦荟发酵物的制备方法，包括以下步骤：(1)将芦荟叶进行高压均质，制得芦荟叶浆液；(2)采用乳酸菌对所述芦荟叶浆液进行一次发酵，制得中间发酵产物；所述乳酸菌为乳酸乳球菌、植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌的组合；(3)采用酵母菌对所述中间发酵产物进行二次发酵，分离取上清液，制得芦荟发酵物。所述芦荟发酵物具有优异的抗衰老和舒缓功效，且对皮肤的刺激性小，适用于作为如沐浴露、化妆品等日化产品的组分使用。

Description

一种抗衰老、舒缓的芦荟发酵物及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于日化领域，尤其涉及一种抗衰老、舒缓的芦荟发酵物及其制备方法与应用。
背景技术
芦荟为百合目、百合科的多年生常绿草本植物，其肉质叶含有蒽醌类化合物、多糖、有机酸、蛋白质、氨基酸、多肽以及多种微量元素，其制品被广泛应用于食品、美容、保健、医药等领域。芦荟鲜叶在美容及化妆品方面起主要作用是其中的多糖、氨基酸和微量元素，可以补充皮肤中的水分，恢复胶原蛋白的功能，防止面部皱纹，保持皮肤光滑，富有弹性。另外其中的次生代谢产物能预防皮肤老化、治疗皮肤炎症。芦荟日化产品得到消费者的认可，深受消费者的喜爱。
现代生物发酵技术是在继承中药炮制学发酵法的基础上，吸取微生物学研究成果，结合现代微生物工程而形成的高科技新技术。微生物在生长过程中可以产生很多生物活性物质包括多种酶、小分子化合物等。研究表明，生物发酵过程可以提升终产物的整体护肤功效。相比于传统的化学添加体系的护肤原料而言，其成分来源更加天然。近年来，利用微生物发酵技术获取植物中的活性成分，开发出特色微生物源原料成为了新趋势。
虽然关于芦荟的发酵产品及其发酵方法已有一定的报道，但目前看此类发酵方法并未充分发挥芦荟在作为化妆品原料中潜力和应用。因此，希望研究和开发新的芦荟发酵方法，以制得抗衰老和舒缓效果更好的芦荟发酵产物。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种抗衰老、舒缓的芦荟发酵物及其制备方法与应用。所述芦荟发酵物具有优异的抗衰老和舒缓功效，且对皮肤的刺激性小，适用于作为如沐浴露、化妆品等日化产品的组分使用。
本发明提供了一种芦荟发酵物的制备方法，包括以下步骤：
(1)将芦荟叶进行高压均质，制得芦荟叶浆液；
(2)采用乳酸菌对所述芦荟叶浆液进行一次发酵，制得中间发酵产物；所述乳酸菌为乳酸乳球菌、植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌的组合；
(3)采用酵母菌对所述中间发酵产物进行二次发酵，分离取上清液，制得芦荟发酵物。
本发明首先采用高压均质技术将芦荟细胞破碎，使细胞内的内容物快速、充分释放，以便于后续的发酵操作。同时，本发明指出，采用乳酸菌(以乳酸乳球菌、植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌组合而成)和酵母菌对芦荟依次进行分步发酵，可起到协同增效作用，充分发挥不同微生物的生物转化能力，能够有效增加发酵产物中活性物质的种类和含量，以及降低原料的刺激性，从而提高其抗衰老和舒缓功效。
在本发明所述芦荟发酵物的制备方法中，还可在高压均质步骤和发酵步骤中加入或补加适当量的水。
优选的，步骤(1)所述芦荟叶选自库拉索芦荟叶或好望角芦荟叶中的至少一种。试验表明，以库拉索芦荟叶或好望角芦荟叶为原料，所制得的芦荟发酵物均能具有很好的功效。
优选的，步骤(1)所述高压均质的操作为：将芦荟叶与水混合，加入到高压均质机进行均质。
更优选的，所述均质的温度为20-40℃。最优选的，所述均质的温度为25-35℃。
更优选的，所述均质的压力为5-100MPa。最优选的，所述均质的压力为40-100MPa。
更优选的，所述均质的时间为3-30min。最优选的，所述均质的时间为3-15min。
优选的，步骤(2)所述乳酸菌的菌株浓度为105-108CFU/mL。更优选的，步骤(2)所述乳酸菌的菌株浓度为106-108CFU/mL。
优选的，步骤(2)进行所述一次发酵时，还添加有MRS肉汤培养基。通过在发酵体系中加入MRS肉汤培养基，不仅更有利于乳酸菌的生长繁殖，而且还有助于提高对芦荟叶浆液的发酵效果。
更优选的，步骤(2)进行所述一次发酵时，芦荟叶浆液、乳酸菌与MRS肉汤培养基的用量比为(0.1-100g)：(0.1-5mL)：(0.1-5g)。
优选的，步骤(2)进行所述一次发酵的时间为12-96h。更优选的，步骤(2)进行所述一次发酵的时间为12-48h。
优选的，步骤(2)进行所述一次发酵的温度为25-40℃。更优选的，步骤(2)进行所述一次发酵的温度为20-30℃。
优选的，步骤(2)所述一次发酵完成后，进行灭菌处理。为了避免一次发酵中的乳杆菌对二次发酵产生不良影响，因此可在一次发酵完成后对乳杆菌进行灭菌处理。
更优选的，所述灭菌处理的温度为90-121℃，所述灭菌处理的时间为20-40min。最优选的，所述灭菌处理的温度为100-121℃，所述灭菌处理的时间为20-30min。
优选的，步骤(3)所述酵母菌的菌株浓度为105-108CFU/mL。更优选的，步骤(2)所述酵母菌的菌株浓度为106-108CFU/mL。
优选的，步骤(3)进行二次发酵时还添加有YPD培养基。通过在发酵体系中加入YPD培养基，不仅更有利于酵母菌的生长繁殖，而且还有助于提高对中间发酵产物的发酵效果。
更优选的，步骤(3)进行所述二次发酵时，中间发酵产物、酵母菌与MRS肉汤培养基的用量比为(0.1-100g)：(0.1-5mL)：(0.1-5g)。
优选的，步骤(3)所述酵母菌为酿酒酵母。
优选的，步骤(3)进行所述二次发酵的时间为24-120h。更优选的，步骤(3)进行所述二次发酵的时间为24-84h。
优选的，步骤(3)进行所述二次发酵的温度为25-40℃。更优选的，步骤(3)进行所述二次发酵的温度为28-35℃。
优选的，步骤(3)所述二次发酵完成后，进行灭菌处理。为了杀灭芦荟发酵物中的所含的菌种，可进行灭菌处理。
更优选的，所述灭菌处理的温度为100-121℃，所述灭菌处理的时间为20-30min。
本发明还提供了一种芦荟发酵物，由上述制备方法所制得。
本发明还提供了上述芦荟发酵物在制备日化产品中的应用。本发明所制得的芦荟发酵物具有低刺激性和强抗衰老、舒缓功效，可作为日化产品中的成分使用。
优选的，所述日化产品为化妆品。
更优选的，所述化妆品的种类包括精油类、水剂、乳液类、膏霜类、喷雾类、精华类、皂类或洗护类。
相对于现有技术，本发明的有益效果如下：
(1)本发明采用通过高压均质技术使芦荟细胞破碎，使细胞内的内容物快速、充分释放，以便于后续的发酵操作；
(2)本发明指出，采用乳酸菌(以乳酸乳球菌、植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌组合而成)和酵母菌对芦荟叶依次进行分步发酵，可起到协同增效作用，充分发挥不同微生物的生物转化能力，有效增加发酵产物中活性物质的种类和含量，以及降低原料的刺激性，从而提高其抗衰老和舒缓功效。
具体实施方式
为了让本领域技术人员更加清楚明白本发明所述技术方案，现列举以下实施例进行说明。需要指出的是，以下实施例仅为本发明的优选实施例，对本发明要求的保护范围不构成限制作用，任何未违背本发明的精神实质和原理下所做出的修改、替代、组合，均包含在本发明的保护范围内。
以下实施例中所用的原料、试剂或装置如无特殊说明，均可从常规商业途径得到，或者可以通过现有已知方法得到。
实施例1
本实施例提供一种芦荟发酵物，其制备方法包括以下步骤：
(1)将500g库拉索芦荟叶与2500mL去离子水混合后，加入到高压均质机中进行均质，制得芦荟叶浆液；其中均质温度为30℃，均质压力为80MPa，均质时间为6min；
(2)将乳酸菌菌液(乳酸乳球菌、植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌的组合)、MRS肉汤培养基、去离子水以及步骤(1)制得的芦荟叶浆液以1mL：1g：50mL：50g的比例混合，在32℃下，进行一次发酵，发酵培养24h后，在100℃下进行灭菌30min，制得中间发酵产物；
其中乳酸菌菌液的组成为：0.33mL植物乳杆菌菌液(107CFU/mL)、0.33mL乳酸乳球菌菌液(107CFU/mL)和0.33mL鼠李糖乳杆菌菌液(107CFU/mL)；
(3)将酿酒酵母菌液(107CFU/mL)、YPD培养基、去离子水以及步骤(2)制得的中间发酵产物以1mL：1g：80mL：20g的比例混合，在30℃下，进行二次发酵，发酵培养48h后，在110℃下进行灭菌20min，最后在离心半径为11cm，转速为5000r/min条件下，离心25min；取离心后的上清液，即制得芦荟发酵物。
实施例2
本实施例提供一种芦荟发酵物，其制备方法包括以下步骤：
(1)将500g好望角芦荟叶与2500mL去离子水混合后，加入到高压均质机中进行均质，制得芦荟叶浆液；其中均质温度为35℃，均质压力为90MPa，均质时间为8min；
(2)将乳酸菌菌液(乳酸乳球菌、植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌的组合)、MRS肉汤培养基、去离子水以及步骤(1)制得的芦荟叶浆液以1mL：1g：50mL：50g的比例混合，在35℃下，进行一次发酵，发酵培养32h后，在100℃下进行灭菌30min，制得中间发酵产物；
其中乳酸菌菌液的组成为：0.2mL植物乳杆菌菌液(107CFU/mL)、0.4mL乳酸乳球菌菌液(107CFU/mL)和0.2mL鼠李糖乳杆菌菌液(107CFU/mL)；
(3)将酿酒酵母菌液(107CFU/mL)、YPD培养基、去离子水以及步骤(2)制得的中间发酵产物以1mL：1g：80mL：20g的比例混合，在32℃下，进行二次发酵，发酵培养48h后，在110℃下进行灭菌20min，最后在离心半径为11cm，转速为5000r/min条件下，离心25min；取离心后的上清液，即制得芦荟发酵物。
对比例1
本对比例提供一种芦荟发酵物，其制备方法包括以下步骤：
(1)将500g库拉索芦荟叶与2500mL去离子水混合后，加入到高压均质机中进行均质，制得芦荟叶浆液；其中均质温度为30℃，均质压力为80MPa，均质时间为6min；
(2)将乳酸菌菌液(植物乳杆菌，107CFU/mL)、MRS肉汤培养基、去离子水以及步骤(1)制得的芦荟叶浆液以1mL：1g：50mL：50g的比例混合，在32℃下，进行一次发酵，发酵培养24h后，在100℃下进行灭菌30min，制得中间发酵产物；
(3)将酿酒酵母菌液(107CFU/mL)、YPD培养基、去离子水以及步骤(2)制得的中间发酵产物以1mL：1g：80mL：20g的比例混合，在30℃下，进行二次发酵，发酵培养48h后，在110℃下进行灭菌20min，最后在离心半径为11cm，转速为5000r/min条件下，离心25min；取离心后的上清液，即制得芦荟发酵物。
对比例2
本对比例提供一种芦荟发酵物，其制备方法包括以下步骤：
(1)将500g库拉索芦荟叶与2500mL去离子水混合后，加入到高压均质机中进行均质，制得芦荟叶浆液；其中均质温度为30℃，均质压力为60MPa，均质时间为10min；
(2)将乳酸菌菌液(植物乳杆菌，107CFU/mL)、MRS肉汤培养基、去离子水以及步骤(1)制得的芦荟叶浆液以1mL：1g：50mL：50g的比例混合，在32℃下，进行一次发酵，发酵培养24h后，在100℃下进行灭菌30min，制得中间发酵产物；
(3)将酿酒酵母菌液(107CFU/mL)、YPD培养基、去离子水以及步骤(2)制得的中间发酵产物以1mL：1g：80mL：20g的比例混合，在30℃下，进行二次发酵，发酵培养48h后，在110℃下进行灭菌20min，最后在离心半径为11cm，转速为5000r/min条件下，离心25min；取离心后的上清液，即制得芦荟发酵物。
对比例3
本对比例提供一种芦荟发酵物，其制备方法包括以下步骤：
(1)将500g库拉索芦荟叶与2500mL去离子水混合后，加入到高压均质机中进行均质，制得芦荟叶浆液；其中均质温度为30℃，均质压力为80MPa，均质时间为6min；
(2)将乳酸菌菌液(乳酸乳球菌，107CFU/mL)、MRS肉汤培养基、去离子水以及步骤(1)制得的芦荟叶浆液以1mL：1g：50mL：50g的比例混合，在32℃下，进行一次发酵，发酵培养24h后，在100℃下进行灭菌30min，制得中间发酵产物；
(3)将酿酒酵母菌液(107CFU/mL)、YPD培养基、去离子水以及步骤(2)制得的中间发酵产物以1mL：1g：80mL：20g的比例混合，在30℃下，进行二次发酵，发酵培养48h后，在110℃下进行灭菌20min，最后在离心半径为11cm，转速为5000r/min条件下，离心25min；取离心后的上清液，即制得芦荟发酵物。
对比例4
本对比例提供一种芦荟发酵物，其制备方法包括以下步骤：
(1)将500g库拉索芦荟叶与2500mL去离子水混合后，加入到高压均质机中进行均质，制得芦荟叶浆液；其中均质温度为30℃，均质压力为80MPa，均质时间为6min；
(2)将乳酸菌菌液(鼠李糖乳杆菌，107CFU/mL)、MRS肉汤培养基、去离子水以及步骤(1)制得的芦荟叶浆液以1mL：1g：50mL：50g的比例混合，在32℃下，进行一次发酵，发酵培养24h后，在100℃下进行灭菌30min，制得中间发酵产物；
(3)将酿酒酵母菌液(107CFU/mL)、YPD培养基、去离子水以及步骤(2)制得的中间发酵产物以1mL：1g：80mL：20g的比例混合，在30℃下，进行二次发酵，发酵培养48h后，在110℃下进行灭菌20min，最后在离心半径为11cm，转速为5000r/min条件下，离心25min；取离心后的上清液，即制得芦荟发酵物。
对比例5
本对比例提供一种芦荟发酵物，其制备方法包括以下步骤：
(1)将500g库拉索芦荟叶与2500mL去离子水混合后，加入到高压均质机中进行均质，制得芦荟叶浆液；其中均质温度为30℃，均质压力为80MPa，均质时间为6min；
(2)将乳酸菌菌液(乳酸乳球菌和植物乳杆菌的组合)、MRS肉汤培养基、去离子水以及步骤(1)制得的芦荟叶浆液以1mL：1g：50mL：50g的比例混合，在32℃下，进行一次发酵，发酵培养24h后，在100℃下进行灭菌30min，制得中间发酵产物；
其中乳酸菌菌液的组成为：0.8mL植物乳杆菌菌液(107CFU/mL)和0.2mL乳酸乳球菌菌液(107CFU/mL)；
(3)将酿酒酵母菌液(107CFU/mL)、YPD培养基、去离子水以及步骤(2)制得的中间发酵产物以1mL：1g：80mL：20g的比例混合，在30℃下，进行二次发酵，发酵培养48h后，在110℃下进行灭菌20min，最后在离心半径为11cm，转速为5000r/min条件下，离心25min；取离心后的上清液，即制得芦荟发酵物。
对比例6
本对比例提供一种芦荟发酵物，其制备方法包括以下步骤：
(1)将500g库拉索芦荟叶与2500mL去离子水混合后，加入到高压均质机中进行均质，制得芦荟叶浆液；其中均质温度为30℃，均质压力为80MPa，均质时间为6min；
(2)将乳酸菌菌液(乳酸乳球菌和植物乳杆菌的组合)、MRS肉汤培养基、去离子水以及步骤(1)制得的芦荟叶浆液以1mL：1g：50mL：50g的比例混合，在32℃下，进行一次发酵，发酵培养24h后，在100℃下进行灭菌30min，制得中间发酵产物；
其中乳酸菌菌液的组成为：0.5mL植物乳杆菌菌液(107CFU/mL)和0.5mL乳酸乳球菌菌液(107CFU/mL)；
(3)将酿酒酵母菌液(107CFU/mL)、YPD培养基、去离子水以及步骤(2)制得的中间发酵产物以1mL：1g：80mL：20g的比例混合，在30℃下，进行二次发酵，发酵培养48h后，在110℃下进行灭菌20min，最后在离心半径为11cm，转速为5000r/min条件下，离心25min；取离心后的上清液，即制得芦荟发酵物。
对比例7
本对比例提供一种芦荟发酵物，其制备方法包括以下步骤：
(1)将500g库拉索芦荟叶与2500mL去离子水混合后，加入到高压均质机中进行均质，制得芦荟叶浆液；其中均质温度为30℃，均质压力为80MPa，均质时间为6min；
(2)将乳酸菌菌液(鼠李糖乳杆菌和植物乳杆菌的组合)、MRS肉汤培养基、去离子水以及步骤(1)制得的芦荟叶浆液以1mL：1g：50mL：50g的比例混合，在32℃下，进行一次发酵，发酵培养24h后，在100℃下进行灭菌30min，制得中间发酵产物；
其中乳酸菌菌液的组成为：0.8mL植物乳杆菌菌液(107CFU/mL)和0.2mL鼠李糖乳杆菌菌液(107CFU/mL)；
(3)将酿酒酵母菌液(107CFU/mL)、YPD培养基、去离子水以及步骤(2)制得的中间发酵产物以1mL：1g：80mL：20g的比例混合，在30℃下，进行二次发酵，发酵培养48h后，在110℃下进行灭菌20min，最后在离心半径为11cm，转速为5000r/min条件下，离心25min；取离心后的上清液，即制得芦荟发酵物。
对比例8
本对比例提供一种芦荟发酵物，其制备方法包括以下步骤：
(1)将500g库拉索芦荟叶与2500mL去离子水混合后，加入到高压均质机中进行均质，制得芦荟叶浆液；其中均质温度为30℃，均质压力为80MPa，均质时间为6min；
(2)将乳酸菌菌液(鼠李糖乳杆菌和植物乳杆菌的组合)、MRS肉汤培养基、去离子水以及步骤(1)制得的芦荟叶浆液以1mL：1g：50mL：50g的比例混合，在32℃下，进行一次发酵，发酵培养24h后，在100℃下进行灭菌30min，制得中间发酵产物；
其中乳酸菌菌液的组成为：0.5mL植物乳杆菌菌液(107CFU/mL)和0.5mL鼠李糖乳杆菌菌液(107CFU/mL)；
(3)将酿酒酵母菌液(107CFU/mL)、YPD培养基、去离子水以及步骤(2)制得的中间发酵产物以1mL：1g：80mL：20g的比例混合，在30℃下，进行二次发酵，发酵培养48h后，在110℃下进行灭菌20min，最后在离心半径为11cm，转速为5000r/min条件下，离心25min；取离心后的上清液，即制得芦荟发酵物。
对比例9
本对比例提供一种芦荟发酵物，其制备方法包括以下步骤：
(1)将500g库拉索芦荟叶与2500mL去离子水混合后，加入到高压均质机中进行均质，制得芦荟叶浆液；其中均质温度为30℃，均质压力为80MPa，均质时间为6min；
(2)将乳酸菌菌液(乳酸乳球菌和鼠李糖乳杆菌的组合)、MRS肉汤培养基、去离子水以及步骤(1)制得的芦荟叶浆液以1mL：1g：50mL：50g的比例混合，在32℃下，进行一次发酵，发酵培养24h后，在100℃下进行灭菌30min，制得中间发酵产物；
其中乳酸菌菌液的组成为：0.2mL鼠李糖乳杆菌菌液(107CFU/mL)和0.8mL乳酸乳球菌菌液(107CFU/mL)；
(3)将酿酒酵母菌液(107CFU/mL)、YPD培养基、去离子水以及步骤(2)制得的中间发酵产物以1mL：1g：80mL：20g的比例混合，在30℃下，进行二次发酵，发酵培养48h后，在110℃下进行灭菌20min，最后在离心半径为11cm，转速为5000r/min条件下，离心25min；取离心后的上清液，即制得芦荟发酵物。
对比例10
本对比例提供一种芦荟发酵物，其制备方法包括以下步骤：
(1)将500g库拉索芦荟叶与2500mL去离子水混合后，加入到高压均质机中进行均质，制得芦荟叶浆液；其中均质温度为30℃，均质压力为80MPa，均质时间为6min；
(2)将乳酸菌菌液(乳酸乳球菌和鼠李糖乳杆菌的组合)、MRS肉汤培养基、去离子水以及步骤(1)制得的芦荟叶浆液以1mL：1g：50mL：50g的比例混合，在32℃下，进行一次发酵，发酵培养24h后，在100℃下进行灭菌30min，制得中间发酵产物；
其中乳酸菌菌液的组成为：0.5mL鼠李糖乳杆菌菌液(107CFU/mL)和0.5mL乳酸乳球菌菌液(107CFU/mL)；
(3)将酿酒酵母菌液(107CFU/mL)、YPD培养基、去离子水以及步骤(2)制得的中间发酵产物以1mL：1g：80mL：20g的比例混合，在30℃下，进行二次发酵，发酵培养48h后，在110℃下进行灭菌20min，最后在离心半径为11cm，转速为5000r/min条件下，离心25min；取离心后的上清液，即制得芦荟发酵物。
对比例11
本对比例提供一种库拉索芦荟加工产品，其加工方法为：
将50g切块的库拉索芦荟叶与2500mL去离子水混合，在沸水中加热2h，过滤并收集滤液，即得。
对比例12
本对比例提供一种芦荟发酵物，其制备方法包括以下步骤：
(1)将500g库拉索芦荟叶与2500mL去离子水混合后，在沸水中加热2h，制得芦荟叶浆液；
(2)将乳酸菌菌液(植物乳杆菌，107CFU/mL)、MRS肉汤培养基、去离子水以及步骤(1)制得的芦荟叶浆液以1mL：1g：50mL：50g的比例混合，在32℃下，进行一次发酵，发酵培养24h后，在100℃下进行灭菌30min，制得中间发酵产物；
(3)将酿酒酵母菌液(107CFU/mL)、YPD培养基、去离子水以及步骤(2)制得的中间发酵产物以1mL：1g：80mL：20g的比例混合，在30℃下，进行二次发酵，发酵培养48h后，在110℃下进行灭菌20min，最后在离心半径为11cm，转速为5000r/min条件下，离心25min；取离心后的上清液，即制得芦荟发酵物。
对比例13
本对比例提供一种库拉索芦荟加工产品，其加工方法为：
将50g切块的库拉索芦荟叶放置于压榨机中进行压榨，压榨后的汁液与2500mL去离子水混合，过滤并收集滤液，即得。
对比例14
本对比例提供一种芦荟发酵物，其制备方法包括以下步骤：
(1)将50g切块的库拉索芦荟叶放置于压榨机中进行压榨，压榨后的汁液与2500mL去离子水混合，制得芦荟叶浆液；
(2)将乳酸菌菌液(植物乳杆菌，107CFU/mL)、MRS肉汤培养基、去离子水以及步骤(1)制得的芦荟叶浆液以1mL：1g：50mL：50g的比例混合，在32℃下，进行一次发酵，发酵培养24h后，在100℃下进行灭菌30min，制得中间发酵产物；
(3)将酿酒酵母菌液(107CFU/mL)、YPD培养基、去离子水以及步骤(2)制得的中间发酵产物以1mL：1g：80mL：20g的比例混合，在30℃下，进行二次发酵，发酵培养48h后，在110℃下进行灭菌20min，最后在离心半径为11cm，转速为5000r/min条件下，离心25min；取离心后的上清液，即制得芦荟发酵物。
对比例15
本对比例提供一种芦荟发酵物，其制备方法包括以下步骤：
(1)将500g库拉索芦荟叶与2500mL去离子水混合后，加入到高压均质机中进行均质，制得芦荟叶浆液；其中均质温度为30℃，均质压力为80MPa，均质时间为6min；
(2)将乳酸菌菌液(植物乳杆菌，107CFU/mL)、MRS肉汤培养基、去离子水以及步骤(1)制得的芦荟叶浆液以1mL：1g：50mL：50g的比例混合，在32℃下，进行发酵，发酵培养24h后，在100℃下进行灭菌30min，最后在离心半径为11cm，转速为5000r/min条件下，离心25min；取离心后的上清液，即制得芦荟发酵物。
对比例16
本对比例提供一种芦荟发酵物，其制备方法包括以下步骤：
(1)将500g库拉索芦荟叶与2500mL去离子水混合后，加入到高压均质机中进行均质，制得芦荟叶浆液；其中均质温度为30℃，均质压力为80MPa，均质时间为6min；
(2)将酿酒酵母菌液(107CFU/mL)、YPD培养基、去离子水以及步骤(1)制得的芦荟叶浆液以1mL：1g：80mL：20g的比例混合，在30℃下，进行发酵，发酵培养48h后，在110℃下进行灭菌20min，最后在离心半径为11cm，转速为5000r/min条件下，离心25min；取离心后的上清液，即制得芦荟发酵物。
产品效果测试
1.红细胞溶血性评价
红细胞溶血实验是兔眼刺激性实验(Draizetest)替代方法之一，基本原理是通过测定血红蛋白溶出量及变性程度来评价化学品对眼组织细胞的损伤。国际上主要将RBC实验用于评价化妆品及原料等化学品的眼刺激性研究。
以实施例1-2和对比例1-16制备的样品进行红细胞溶血实验，本实验依照欧洲替代方法验证中心(ECVAM)的RBC实验测试方法及分级标准。其中HD50为50％红细胞发生溶血时的样品浓度，DI为蛋白质变性指数，L/D为HD50与DI的比值，具体测试标准和测试结果如表1-2所示。
表1红细胞溶血实验测试标准
Figure BDA0003132853590000111
Figure BDA0003132853590000121
表2红细胞溶血实验测试结果
样品 分级 样品 分级
实施例1 无刺激性 对比例8 无刺激性
实施例2 无刺激性 对比例9 无刺激性
对比例1 无刺激性 对比例10 无刺激性
对比例2 无刺激性 对比例11 微刺激性
对比例3 无刺激性 对比例12 无刺激性
对比例4 无刺激性 对比例13 轻度激性
对比例5 无刺激性 对比例14 无刺激性
对比例6 无刺激性 对比例15 无刺激性
对比例7 无刺激性 对比例16 无刺激性
表1-2的结果表明，采用单菌株发酵、混合菌株对芦荟叶进行发酵得到的发酵液是安全无刺激的。
2.羟自由基的清除能力评价
以实施例1-2和对比例1-16制备的样品进行如下试验。
反应体系中先加入1.0mL FeSO4溶液(9.0mmol/L)、1mL水杨酸-乙醇溶液(9.0mmol/mL)、1.0mL样品试液，再加入1.0mL H2O2(8.8mmol/mL)，于37℃水浴反应30min，以无水乙醇为空白对照，于510nm处测定其吸光度，按以下公式(1)计算各提取液对·OH的清除率：
Y(％)＝[1-(A1-A2)/A3]×100％ (1)
式中A1为提取液反应体系的吸光度；A2为不加H2O2的样品的吸光度(以无水乙醇代替H2O2)；A3为空白对照无水乙醇的吸光度。
3.DPPH自由基清除能力评价
清除DPPH自由基能力在一定程度上反应物质的抗氧化能力。自由基清除率越大，表明抗氧化能力越强，抗衰老能力越强。因此，可以通过样品对清除DPPH自由基能力的研究来判断其抗衰老效果。以实施例1-2和对比例1-16制备的样品进行下面试验。
向试管中加入质量浓度为45.8mg/L的DPPH测试液2.0mL和一定量(如0.5mL)的待测样品，总体积用50％乙醇(v/v)补充至总体积为3mL，摇匀，避光反应30min后，用1cm比色皿在517nm波长处测定吸光度，记为A1；向试管中加入无水乙醇2mL和相应体积的待测样品，总体积用50％乙醇(v/v)补充至3mL，测得的吸光度记为A2；向试管中加入DPPH测试液2mL和50％乙醇(v/v)1mL，测得的吸光度记为A3。按以下公式(2)计算待测液对DPPH自由基清除率(Y)；
DPPH自由基清除率的计算公式为：Y(％)＝[1-(A1-A2)/A3]×100％ (2)
式中A1为空白对照清除DPPH后体系的吸光度值，A2为样品清除DPPH后体系的吸光度值，A3为未加药品前反应体系的吸光度值。
具体测试结果如表3所示：
表3各样品的羟自由基清除率和DPPH自由基清除率
Figure BDA0003132853590000131
表3结果表明，采用高压均质技术对芦荟叶进行处理，并采用不同菌株进行分步发酵之后，得到的芦荟发酵物对羟基自由基和DPPH自由基的清除能力有明显提升。
4.对UV照射后HaCaT细胞存活率的影响
将HaCaT细胞接种至6孔板中，在37℃，5％CO2的培养箱孵育过夜。待6孔板中细胞铺板率达到50％-60％时，往空白对照组、阴性对照组中加入细胞培养基，往受试样品组加入含有对应浓度受试样品(5％)的细胞培养基，预处理1h，然后进行UVB辐照(30mJ/cm2)40min。于37℃，5％CO2的培养箱中继续培养24h后吸除培养基，用PBS清洗2-3次，采用MTT法测试细胞存活率，测试结果如表4所示
表4细胞相对存活率
样品 细胞相对存活率(％) 样品 细胞相对存活率(％)
实施例1 122.4 对比例8 116.3
实施例2 120.8 对比例9 115.2
对比例1 118.6 对比例10 119.3
对比例2 115.5 对比例11 63.2
对比例3 117 对比例12 87.3
对比例4 119.3 对比例13 55.6
对比例5 116.8 对比例14 79.3
对比例6 117.2 对比例15 104.6
对比例7 116.8 对比例16 104.4
表4结果表明，相比于对比例1-16，实施例1-2制得的芦荟发酵物对UV照射后的HaCat细胞具有更好的保护作用，并且能够促进细胞的生长。
5.对UV照射后HaCaT细胞内SOD、GSH-Px、MDA、IL-1β和TNF-α含量的影响
将HaCaT细胞接种至6孔板中，在37℃，5％CO2的培养箱孵育过夜。待6孔板中细胞铺板率达到50％-60％时，往空白对照组、阴性对照组中加入细胞培养基，往受试样品组加入含有对应浓度受试物样品(5％)的细胞培养基，预处理1h，然后进行UVB辐照(30mJ/cm2)40min。于37℃，5％CO2的培养箱中继续培养24h。培养结束后，根据试剂盒操作方法，测定SOD、GSH-Px、和MDA含量。根据ELISA试剂盒操作方法，测定IL-1β和TNF-α的含量，测试结果如表5所示。
表5 HaCaT细胞内SOD、GSH-Px、MDA、IL-1β和TNF-α含量
Figure BDA0003132853590000141
Figure BDA0003132853590000151
表5结果表明，相比于对比例1-16，实施例1-2制得的芦荟发酵物可以更大程度提高紫外线照射后HaCat细胞内SOD和GSH-Px的活性，降低MDA的含量，表现出良好的抗氧化活性。另外，芦荟发酵物还能降低UV照射后HaCat细胞产生的炎症因子IL-1β和TNF-α的含量。
以实施例1制得的芦荟发酵物和对比例11制得的库拉索芦荟加工产品作为样品，分别制得对应的护肤精华液，其具体配方如表6所示。
表6护肤精华液配方
Figure BDA0003132853590000152
Figure BDA0003132853590000161
效果评价对象：选取志愿者30名，年龄在20-45岁，男女各15名。每位志愿者的左侧使用以实施例1中芦荟发酵物为原料制得的护肤精华液，右侧使用对比例1中库拉索芦荟加工产品为原料制得的护肤精华液；每天早、午、晚各使用一次护肤精华液，每次涂抹1g产品于脸部，并按摩2分钟。根据感官评价填写试用评价表。使用7天、14天、28天后各统计一次。志愿者在使用过程中对样品进行白度(0-5分)、紧致度(0-5分)、舒缓(0-5分)等效果评价，其中最高分为5，表示效果显著；最低分为0，表示没有效果。
表7护肤精华液功效测试
Figure BDA0003132853590000162
结果表明，大部分志愿者认为使用以实施例1中芦荟发酵物为原料制得的护肤精华液后，皮肤白度、紧致度、舒缓方面得到显著改善，优于使用以对比例11中库拉索芦荟加工产品为原料制得的护肤精华液，说明本发明的芦荟发酵物应用到化妆品中具有显著的抗衰老舒缓的功效。
上面对本申请实施例作了详细说明，但是本申请不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本申请宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

Claims (10)

1.一种芦荟发酵物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将芦荟叶进行高压均质，制得芦荟叶浆液；
(2)采用乳酸菌对所述芦荟叶浆液进行一次发酵，制得中间发酵产物；所述乳酸菌为乳酸乳球菌、植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌的组合；
(3)采用酵母菌对所述中间发酵产物进行二次发酵，分离取上清液，制得芦荟发酵物。
2.根据权利要求1的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述芦荟叶选自库拉索芦荟叶或好望角芦荟叶中的至少一种。
3.根据权利要求1的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述高压均质的操作为：将芦荟叶与水混合，加入到高压均质机进行均质。
4.根据权利要求1的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述乳酸菌的菌株浓度为105-108CFU/mL。
5.根据权利要求1的制备方法，其特征在于，步骤(2)进行所述一次发酵时，还添加有MRS肉汤培养基。
6.根据权利要求1的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述一次发酵完成后，进行灭菌处理。
7.根据权利要求1的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述酵母菌的菌株浓度为105-108CFU/mL。
8.根据权利要求1的制备方法，其特征在于，步骤(3)进行二次发酵时还添加有YPD培养基。
9.一种芦荟发酵物，其特征在于，由权利要求1-8中任一项所述的制备方法制得。
10.权利要求9所述的芦荟发酵物在制备日化产品中的应用。
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