CN114009765B - 一种具有抑菌功能的红豆杉发酵液制品及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种具有抑菌功能的红豆杉发酵液制品的制备方法，该方法包括以下步骤：将红豆杉叶片经打浆制成红豆杉浆体，加入复合酶进行酶解，再加入碳源、有机酸、无机盐和凝结芽孢杆菌，进行第一次发酵，制得第一次发酵红豆杉浆体，再加入有机酸、氮源、碳源和复合菌种，进行第二次发酵，制得第二次发酵红豆杉浆体；在果汁中加入碳源和复合菌种进行发酵，制得发酵果汁；将第二次发酵红豆杉浆体过滤，过滤后的液体与发酵果汁混合得混合液体，经螯合、杀菌，取上清液，制得。该方法制备的具有抑菌功能的红豆杉发酵液制品口感微苦，且有效成分含量高，制备方法简单、易操作，发酵时间短。

Description

一种具有抑菌功能的红豆杉发酵液制品及其制备方法
技术领域
本发明涉及发酵制品技术领域，具体涉及一种具有抑菌功能的红豆杉发酵液制品及其制备方法。
背景技术
红豆杉为常绿乔木或灌木，民间一般称其为“紫杉”，含有多种药用成分，红豆杉中含有紫杉醇等化合物，作为抗肿瘤注射剂开发利用，同时也含有黄酮类等多种化合物，具有免疫及抗肿瘤、抗病毒以及抗氧化活性，《本草纲目》中记载了红豆杉的药用功能，可用于治疗霍乱、伤寒等症，《本草推陈》中对其药用功能也有过相关记载：“紫杉可入药，利尿、通经、治肾病，用皮易呕吐，木部及叶不吐”，民间和传统中医药对红豆杉属植物的利用也有着悠久历史和记载，用以消积、润燥、利尿、通经、消炎并可治疗多种肠道寄生虫病。然后而目前红豆杉发酵存在发酵不稳定、风味不好、有效成分含量低和发酵时间长等缺陷。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种具有抑菌功能的豆杉发酵液制品及其制备方法，以解决现有红豆杉发酵有效成分含量低及发酵时间长的问题。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：提供一种具有抑菌功能的红豆杉发酵液制品的制备方法，包括以下步骤：
(1)将红豆杉叶片经打浆制成红豆杉浆体，加入复合酶进行酶解，制得酶解红豆杉浆体；
(2)在酶解红豆杉浆体中加入碳源、有机酸、无机盐和凝结芽孢杆菌，于45-55℃条件下，进行第一次发酵，当pH为4-5时，停止发酵，制得第一次发酵红豆杉浆体；
(3)在第一次发酵红豆杉浆体中加入有机酸、氮源、碳源和复合菌种，于室温条件下，进行第二次发酵，当pH为2-3时，停止发酵，制得第二次发酵红豆杉浆体；
(4)在果汁中加入碳源和复合菌种，于30-37℃条件下发酵，当pH为2.5-3.5时，停止发酵，制得发酵果汁；
(5)将第二次发酵红豆杉浆体过滤，过滤后的液体与发酵果汁混合得混合液体，于常温条件下，螯合70-76h，当pH值为2-3时，经杀菌取上清液，制得具有抑菌功能的红豆杉发酵液制品。
本发明的有益效果为：本发明将红豆杉叶片经制浆、酶解后，通过两次发酵过程发酵，再与发酵果汁螯合，制得具有抑菌功能的红豆杉发酵液制品。改良了红豆杉发酵液制品的口感，降低了红豆杉发酵产生的苦味，口感仅微苦，且有效成分含量高，制备方法简单、易操作，发酵时间短。
红豆杉叶片中能够分离出黄酮类、二萜类(如紫杉宁、红豆杉素、紫杉碱、紫杉醇等)、红豆杉多糖(如鼠李糖、鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖等)化合物，并富含纤维素，含少量淀粉，红豆杉树皮及木部与叶片成分不同，发酵工艺不同，为保证此工艺的稳定性，仅使用叶片部分。
在红豆杉浆体添加复合酶有利于使红豆杉叶片细胞壁溶解，使更多的胞内物质溶解出来，有利于后期发酵，并使发酵速度变快，凝结芽孢杆菌能够在较高温度下保持良好的生长态势发酵，同时抑制一些不耐热有害菌的生长，并且凝结芽孢杆菌可以通过代谢产生大量乳酸，降低周围环境pH值，从而抑制嗜碱性致病菌的生长，还可以产生细菌素及类细菌素物质，如抑菌物质凝固素，抑制杂菌的生长，从而为发酵菌提供了良好的生长环境，提高了发酵速度，通过前期酶解和凝结芽孢杆菌发酵，将发酵速度提高了一倍以上，减少了因环境潮湿等不明因素引起杂菌(如霉菌)生长，进一步保证了发酵品的稳定性。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进：
进一步，红豆杉叶片在打浆前经过清洗、消毒和冻干处理。
采用上述进一步技术方案的有益效果为：经过上述处理，可避免杂菌的引入，且可进一步提高发酵速度。
进一步，步骤(1)中复合酶为纤维素酶、半纤维素酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、和淀粉酶中的至少两种组成。
进一步，步骤(1)中复合酶质量为红豆杉浆体质量的0.2-0.35％。
进一步，步骤(1)中酶解时间为20-26h。
进一步，步骤(2)中凝结芽孢杆菌质量为酶解红豆杉浆体质量的0.1-0.2％。
进一步，步骤(2)中碳源质量为酶解红豆杉浆体质量的5-10％。
进一步，步骤(2)中碳源为葡萄糖、乳糖、白糖、红糖、阿拉伯糖、壳寡糖和海藻糖中至少两种。
进一步，步骤(2)中有机酸和无机盐的总质量为酶解红豆杉浆体质量的0.008-0.02％。
进一步，步骤(2)中有机酸和无机盐的质量比为5-8：1。
进一步，步骤(2)中有机酸为柠檬酸、苹果酸、叶酸和抗坏血酸中至少一种。
进一步，有机酸为叶酸。
进一步，步骤(2)中无机盐为钾盐、锰盐和钠盐中至少一种。
进一步，无机盐为硫酸锰。
采用上述进一步技术方案的有益效果为：根据凝结芽孢杆菌的培养特性，叶酸和硫酸锰具有促进凝结芽孢杆菌生长的作用，可进一步提高发酵速度。
进一步，步骤(3)中复合菌种是由酵母菌、巴氏醋杆菌和以下7种菌中至少两种混合而成，这7种菌分别为：枯草芽胞杆菌、植物乳杆菌植物亚种、类干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、嗜热链球菌、戊糖乳杆菌和唾液乳杆菌。
采用上述进一步技术方案的有益效果为：第二次发酵采用上述复合菌种，可使发酵物口感富有层次，且进一步降低pH值，进一步降低了苦味的程度。
进一步，步骤(3)中复合菌质量为第一次发酵红豆杉浆体质量的0.2-0.3％。
进一步，步骤(3)中有机酸为檬酸、苹果酸、叶酸、抗坏血酸中至少一种。
进一步，步骤(3)中有机酸质量为第一次发酵红豆杉浆体质量的1-3％。
进一步，步骤(3)中氮源为酵母膏、蛋白胨、玉米浆、黄豆粉和多肽至少一种。
进一步，步骤(3)中氮源质量为为第一次发酵红豆杉浆体质量的3.5-5％。
进一步，步骤(3)中碳源为葡萄糖、乳糖、果糖、阿拉伯糖、壳寡糖和海藻糖中至少一种。
进一步，步骤(3)中碳源质量为第一次发酵红豆杉浆体质量的8-10％。
进一步，步骤(4)中果汁为菠萝、木瓜、苹果、梨、柠檬中至少两种经榨汁制得。
进一步，步骤(4)中复合菌种是由酵母菌和以下7种菌中至少一种混合而成，这7种菌分别为：枯草芽胞杆菌、植物乳杆菌植物亚种、类干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、嗜热链球菌、戊糖乳杆菌和唾液乳杆菌。
进一步，步骤(4)中复合菌种质量为果汁质量的0.5-1％。
进一步，步骤(4)中碳源为葡萄糖、乳糖、白糖、红糖、阿拉伯糖、壳寡糖、海藻糖和低聚果糖中至少一种。
进一步，步骤(4)中碳源质量为果汁质量的5-10％。
进一步，步骤(5)中过滤后的液体与发酵果汁混合的质量比为1：0.2-0.4。
进一步，步骤(5)中混合液螯合后，pH值为2-3时，添加果胶酶后静置，再进行杀菌处理。
进一步，添加果胶酶的质量为混合液质量的0.1-0.2％。
本发明还提供上述具有抑菌功能的红豆杉发酵液制品的制备方法制得的具有抑菌功能的红豆杉发酵液制品。
本发明还提供具有抑菌功能的红豆杉发酵液制品在制备抑菌药物方面的应用。
本发明具有以下有益效果：本发明提供了一种通过以红豆杉枝叶为主，和果汁共发酵获得有益物质，如紫杉醇、黄酮、溶菌酶和氨基酸的方法。同时，得到的发酵液制品对革兰氏阴性和阳性菌都有较好抑菌效果。本发明的制备方法制备的具有抑菌功能的红豆杉发酵液制品口感略酸、微苦，紫杉醇含量可达到1.13mg/L，总黄酮含量可达到1398mg/kg，溶菌酶可达到121.91IU/L，总的制备时间可达31天左右。
具体实施方式
以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。以下实施例及对比例中果汁发酵均与红豆杉浆体发酵同时进行。
实施例1：
一种具有抑菌功能的红豆杉发酵液制品的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备红豆杉浆体
取新鲜红豆杉叶片，清水清洗三次，再使用无菌水进行超声波清洗5min，然后沥干水分，使含水率为45％，于紫外线波长254mm下，照射3min杀菌，杀菌后的红豆杉叶片采用快速冻干技术，于-20℃条件下冻干，最后将红豆杉叶片和无菌水按照重量份1：2混合，再在破壁机中以45000转/min的速度进行粉碎，制得红豆杉浆体；
(2)酶解红豆杉浆体
在红豆杉浆体中添加由纤维素酶和菠萝蛋白酶组成的复合酶，混合均匀后，静置24小时，进行酶解处理，制得酶解红豆杉浆体；其中，复合酶质量为红豆杉浆体质量的0.2％，复合酶中纤维素酶和菠萝蛋白酶的质量比为3：1；
(3)第一次发酵红豆杉浆体
在酶解红豆杉浆体中加入葡萄糖、乳糖、叶酸、硫酸锰和凝结芽孢杆菌，慢速搅拌均匀后，加热至45℃，进行第一次发酵，发酵时间为12天，pH值为4.9时，结束第一次发酵，制得第一次发酵红豆杉浆体；其中，葡萄糖和乳糖总质量为酶解红豆杉浆体质量的10％，葡萄糖和乳糖的质量比为5:1，叶酸和硫酸锰总重量为酶解红豆杉浆体质量的0.02％，叶酸和硫酸锰的质量比为5:1，凝结芽孢杆菌质量为酶解红豆杉浆体质量的0.2％；
(4)第二次发酵红豆杉浆体
在第一次发酵红豆杉浆体中加入柠檬酸、净化玉米浆、葡萄糖、乳糖和由酵母菌、枯草芽胞杆菌、类干酪乳杆菌和巴氏醋杆菌组成复合菌种，充分搅拌混合均匀后，于室温条件下，进行第二次发酵，发酵时间为15天，当pH为2.9时，停止发酵，制得第二次发酵红豆杉浆体；其中，柠檬酸质量为第一次发酵红豆杉浆体质量的1％，净化玉米浆质量为第一次发酵红豆杉浆体质量的3.5％，葡萄糖和乳糖总质量为第一次发酵红豆杉浆体质量的8％，葡萄糖和乳糖的质量比为2：3，复合菌种质量为第一次发酵红豆杉浆体质量的0.2％，复合菌种中酵母菌、枯草芽胞杆菌、类干酪乳杆菌和巴氏醋杆菌的质量比为1：2：2：1；
(5)发酵果汁
取新鲜菠萝和青柠檬经洗净、晾干、切块、榨汁，制得果汁，向果汁中加入葡萄糖和由酵母菌、嗜热链球菌、鼠李糖乳杆菌组成复合菌种，慢速搅拌均匀后，于30℃条件下发酵，发酵时间为15天，当pH为3时，停止发酵，制得发酵果汁；其中葡萄糖质量为果汁质量的10％，复合菌种质量为果汁质量的0.5％，复合菌种中酵母菌、嗜热链球菌和鼠李糖乳杆菌重量比为4：2：1；
(6)复配、螯合、调制以红豆杉为主的发酵物
将第二次发酵红豆杉浆体在200目滤网下进行压滤，过滤后的液体与发酵果汁混合后，将混合液体于常温下螯合72h，添加果胶酶，慢速搅拌后，静置24小时，测量得pH值为2.6时，采用UHT法，于135℃杀菌5秒，取上层清液得到具有抑菌功能的红豆杉发酵液制品；其中，过滤后的液体与发酵水果汁的质量比为1：0.3，果胶酶质量为混合液体质量的0.15％。
实施例2：
一种具有抑菌功能的红豆杉发酵液制品的制备方法，包括以下步骤：
(1)准备红豆杉浆体
取新鲜红豆杉叶片，清水清洗三次，再使用无菌水进行超声波清洗3min，然后沥干水分，使含水率为55％，再于紫外线波长254mm下，照射8min杀菌，杀菌后的红豆杉叶片采用快速冻干技术，于-22℃条件下冻干，最后将红豆杉叶片和无菌水按照重量份1：1.8混合，再在破壁机中以40000转/min的速度进行粉碎，制得红豆杉浆体；
(2)酶解红豆杉浆体
在红豆杉浆体中添加由纤维素酶、半纤维素酶和菠萝蛋白酶组成的复合酶，混合均匀后，静置20小时，进行酶解处理，制得酶解红豆杉浆体；其中，复合酶质量为红豆杉浆体质量的0.25％，复合酶中纤维素酶、半纤维素酶和菠萝蛋白酶的质量比为2：2：1；
(3)第一次发酵红豆杉浆体
在酶解红豆杉浆体中加入葡萄糖、白糖、叶酸、硫酸锰和凝结芽孢杆菌，慢速搅拌均匀后，加热至45℃，进行第一次发酵，发酵时间为15天，pH值为4.8时，结束第一次发酵，制得第一次发酵红豆杉浆体；其中，葡萄糖和白糖总质量为酶解红豆杉浆体质量的5％，葡萄糖和白糖的质量比为1：1，叶酸和硫酸锰总重量为酶解红豆杉浆体质量的0.01％，叶酸和硫酸锰的质量比为6：1，凝结芽孢杆菌质量为酶解红豆杉浆体质量的0.15％；
(4)第二次发酵红豆杉浆体
在第一次发酵红豆杉浆体中加入苹果酸、酵母膏、葡萄糖、壳寡糖和由酵母菌、植物乳杆菌植物亚种、类干酪乳杆菌和巴氏醋杆菌组成复合菌种，充分搅拌混合均匀后，于室温条件下，进行第二次发酵，发酵时间为14天，当pH为2.9时，停止发酵，制得第二次发酵红豆杉浆体；其中，苹果酸质量为第一次发酵红豆杉浆体质量的2％，酵母膏质量为第一次发酵红豆杉浆体质量的4％，葡萄糖和壳寡糖总质量为第一次发酵红豆杉浆体质量的10％，葡萄糖和壳寡糖的质量比为2：3，复合菌种质量为第一次发酵红豆杉浆体质量的0.25％，复合菌种中酵母菌、植物乳杆菌植物亚种、类干酪乳杆菌和巴氏醋杆菌的重量比为2：1.5：1.5：1；
(5)发酵果汁
取新鲜菠萝、木瓜和葡萄经洗净、晾干、切块、榨汁，制得果汁，向果汁中加入葡萄糖、红糖和由酵母菌、枯草芽胞杆菌、植物乳杆菌植物亚种组成复合菌种，慢速搅拌均匀后，于37℃条件下发酵，发酵时间为15天，当pH为2.5时，停止发酵，制得发酵果汁；其中，菠萝、木瓜和葡萄的质量比为2：2：1，葡萄糖质量为果汁质量的8％，红糖质量为果汁质量的2％，复合菌种质量为果汁质量的0.5％，复合菌种中酵母菌、枯草芽胞杆菌和植物乳杆菌植物亚种重量比为4：2：1；
(6)复配、螯合、调制以红豆杉为主的发酵物
将第二次发酵红豆杉浆体在200目滤网下进行压滤，过滤后的液体与发酵水果汁混合后，将混合液体于常温下螯合76h，添加果胶酶，慢速搅拌后，静置24小时，测量得pH值为2时，采用UHT法，于135℃杀菌5秒，取上层清液得到具有抑菌功能的红豆杉发酵液制品；其中，过滤后的液体与发酵水果汁的质量比为1：0.2，果胶酶质量为混合液体质量的0.1％。
实施例3：
一种具有抑菌功能的红豆杉发酵液制品的制备方法，包括以下步骤：
(1)准备红豆杉浆体
取新鲜红豆杉叶片，清水清洗三次，再使用无菌水进行超声波清洗3min，然后沥干水分，使含水率为50％，再于紫外线波长254mm下，照射10min杀菌，杀菌后的红豆杉叶片采用快速冻干技术，于-25℃条件下冻干，最后将红豆杉叶片和无菌水按照重量份1：1.8混合，再在破壁机中以80000转/min的速度进行粉碎，制得红豆杉浆体；
(2)酶解红豆杉浆体
在红豆杉浆体中添加由纤维素酶、半纤维素酶和和木瓜蛋白酶组成的复合酶，混合均匀后，静置24小时，进行酶解处理，制得酶解红豆杉浆体；其中，复合酶质量为红豆杉浆体质量的0.25％，复合酶中纤维素酶、半纤维素酶和和木瓜蛋白酶的质量比为2：2：1；
(3)第一次发酵红豆杉浆体
在酶解红豆杉浆体中加入葡萄糖、海藻糖、红糖、叶酸、硫酸锰和凝结芽孢杆菌，慢速搅拌均匀后，加热至45℃，进行第一次发酵，发酵时间为12天，pH值为4.9时，结束第一次发酵，制得第一次发酵红豆杉浆体；其中，葡萄糖、海藻糖和红糖总质量为酶解红豆杉浆体质量的6％，葡萄糖、海藻糖和红糖的质量比为1：1：2，叶酸和硫酸锰总重量为酶解红豆杉浆体质量的0.01％，叶酸和硫酸锰的质量比为5：1，凝结芽孢杆菌质量为酶解红豆杉浆体质量的0.1％；
(4)第二次发酵红豆杉浆体
在第一次发酵红豆杉浆体中加入叶酸、抗坏血酸、蛋白胨、葡萄糖、海藻糖、阿拉伯糖和由酵母菌、鼠李糖乳杆菌、类干酪乳杆菌和巴氏醋杆菌组成复合菌种，充分搅拌混合均匀后，于室温条件下，进行第二次发酵，发酵时间为13天，当pH为2.8时，停止发酵，制得第二次发酵红豆杉浆体；其中，叶酸质量为第一次发酵红豆杉浆体质量的1.5％，抗坏血酸质量为第一次发酵红豆杉浆体质量的1.5％，蛋白胨质量为第一次发酵红豆杉浆体质量的5％，葡萄糖、海藻糖和阿拉伯糖总质量为第一次发酵红豆杉浆体质量的9％，葡萄糖、海藻糖和阿拉伯糖的质量比为2：3：0.5，复合菌种质量为第一次发酵红豆杉浆体质量的0.3％，复合菌种中酵母菌、鼠李糖乳杆菌、类干酪乳杆菌和巴氏醋杆菌的质量比为2：1.5：1.5：1；
(5)发酵果汁
取新鲜菠萝、黄柠檬和苹果经洗净、晾干、切块、榨汁，制得果汁，向果汁中加入葡萄糖、红糖和由酵母菌、类干酪乳杆菌、戊糖乳杆菌组成复合菌种，慢速搅拌均匀后，于35℃条件下发酵，发酵时间为15天，当pH为3时，停止发酵，制得发酵果汁；其中，葡萄糖质量为果汁质量的5％，红糖质量为果汁质量的5％，复合菌种质量为果汁质量的1％，复合菌种中酵母菌、类干酪乳杆菌和戊糖乳杆菌的质量比为4：2：1；
(6)复配、螯合、调制以红豆杉为主的发酵物
将第二次发酵红豆杉浆体在200目滤网下进行压滤，过滤后的液体与发酵水果汁混合后，将混合液体于常温下螯合72h，添加果胶酶，慢速搅拌后，静置24小时，测量得pH值为2.8时，采用UHT法，于135℃杀菌8秒，取上层清液得到具有抑菌功能的红豆杉发酵液制品；其中，过滤后的液体与发酵水果汁的质量比为1：0.3，果胶酶质量为混合液体质量的0.15％。
实施例4
一种具有抑菌功能的红豆杉发酵液制品的制备方法，包括以下步骤：
(1)准备红豆杉浆体
取新鲜红豆杉叶片，清水清洗三次，再使用无菌水进行超声波清洗3min，然后沥干水分，使含水率为50％，再于紫外线波长254mm下，照射8min杀菌，杀菌后的红豆杉叶片采用快速冻干技术，于-22℃条件下冻干，最后将红豆杉叶片和无菌水按照重量份1：2.5混合，再在破壁机中以50000转/min的速度进行粉碎，制得红豆杉浆体；
(2)酶解红豆杉浆体
在红豆杉浆体中添加由纤维素酶、淀粉酶和木瓜蛋白酶组成的复合酶，混合均匀后，静置26小时，进行酶解处理，制得酶解红豆杉浆体；其中，复合酶质量为红豆杉浆体质量的0.35％，复合酶中纤维素酶、淀粉酶和木瓜蛋白酶的质量比为2：1：2；
(3)第一次发酵红豆杉浆体
在酶解红豆杉浆体中加入葡萄糖、阿拉伯糖、壳寡糖、叶酸、硫酸锰和凝结芽孢杆菌，慢速搅拌均匀后，加热至55℃，进行第一次发酵，发酵时间为16天，pH值为4.9时，结束第一次发酵，制得第一次发酵红豆杉浆体；其中，葡萄糖、阿拉伯糖和壳寡糖总质量为酶解红豆杉浆体质量的10％，葡萄糖、阿拉伯糖和壳寡糖的质量比为2：2：1，叶酸和硫酸锰总重量为酶解红豆杉浆体质量的0.008％，叶酸和硫酸锰的质量比为8：1，凝结芽孢杆菌质量为酶解红豆杉浆体质量的0.1％；
(4)第二次发酵红豆杉浆体
在第一次发酵红豆杉浆体中加入柠檬酸、抗坏血酸、娃娃鱼多肽、葡萄糖、低聚果糖、阿拉伯糖和由酵母菌、植物乳杆菌植物亚种、嗜热链球菌、唾液乳杆菌和巴氏醋杆菌组成复合菌种，充分搅拌混合均匀后，于室温条件下，进行第二次发酵，发酵时间为13天，当pH为2.8时，停止发酵，制得第二次发酵红豆杉浆体；其中，柠檬酸质量为第一次发酵红豆杉浆体质量的1.5％，抗坏血酸质量为第一次发酵红豆杉浆体质量的1.5％，娃娃鱼多肽质量为第一次发酵红豆杉浆体质量的4％，葡萄糖、低聚果糖、阿拉伯糖总质量为第一次发酵红豆杉浆体质量的10％，葡萄糖、低聚果糖、阿拉伯糖的质量比为2：3：0.5，复合菌种质量为第一次发酵红豆杉浆体质量的0.3％，复合菌种中酵母菌、植物乳杆菌植物亚种、嗜热链球菌、唾液乳杆菌和巴氏醋杆菌的重量比为2：1.5：1：1：1；
(5)发酵果汁
取新鲜菠萝、苹果、梨和柠檬经洗净、晾干、切块、榨汁，制得果汁，向果汁中加入葡萄糖、乳糖、低聚果糖和由酵母菌、嗜热链球菌、唾液乳杆菌组成复合菌种，慢速搅拌均匀后，于35℃条件下发酵，发酵时间为15天，当pH为3.5时，停止发酵，制得发酵果汁；其中，菠萝、苹果、梨和柠檬的质量比为4：2：3：1，葡萄糖质量为果汁质量的4％，乳糖质量为果汁质量的2％，低聚果糖质量为果汁质量的3％，复合菌种质量为果汁质量的0.8％，复合菌种中酵母菌、嗜热链球菌和唾液乳杆菌重量比为4：2：1；
(6)复配、螯合、调制以红豆杉为主的发酵物
将第二次发酵红豆杉浆体在200目滤网下进行压滤，过滤后的液体与发酵水果汁混合后，将混合液体于常温下螯合70h，添加果胶酶，慢速搅拌后，静置24小时，测量得pH值为3时，采用UHT法，于135℃杀菌8秒，取上层清液得到具有抑菌功能的红豆杉发酵液制品；其中，过滤后的液体与发酵水果汁的质量比为1：0.4，果胶酶质量为混合液体质量的0.2％。
对比例1
一种红豆杉发酵液制品的制备方法，包括以下步骤：
(1)准备红豆杉浆体
取新鲜红豆杉叶片，清水清洗三次，再使用无菌水进行超声波清洗3min，然后沥干水分，使含水率为50％，再于紫外线波长254mm下，照射10min杀菌，杀菌后的红豆杉叶片采用快速冻干技术，于-25℃条件下冻干，最后将红豆杉叶片和无菌水按照重量份1：1.8混合，再在破壁机中以80000转/min的速度进行粉碎，制得红豆杉浆体；
(2)第一次发酵红豆杉浆体
在红豆杉浆体中加入葡萄糖、海藻糖、红糖、叶酸、硫酸锰，慢速搅拌均匀后，加热至45℃，进行第一次发酵，发酵时间为21天，pH值为4.9时，结束第一次发酵，制得第一次发酵红豆杉浆体；其中，葡萄糖、海藻糖和红糖总质量为红豆杉浆体质量的6％，葡萄糖、海藻糖和红糖的质量比为1：1：2，叶酸和硫酸锰总重量为红豆杉浆体质量的0.01％，叶酸和硫酸锰的质量比为5：1；
(3)第二次发酵红豆杉浆体
在第一次发酵红豆杉浆体中加入叶酸、抗坏血酸、蛋白胨、葡萄糖、海藻糖、阿拉伯糖和由酵母菌、鼠李糖乳杆菌、类干酪乳杆菌和巴氏醋杆菌组成复合菌种，充分搅拌混合均匀后，于室温条件下，进行第二次发酵，发酵时间为95天，当pH为2.8时，停止发酵，制得第二次发酵红豆杉浆体；其中，叶酸质量为第一次发酵红豆杉浆体质量的1.5％，抗坏血酸质量为第一次发酵红豆杉浆体质量的1.5％，蛋白胨质量为第一次发酵红豆杉浆体质量的5％，葡萄糖、海藻糖和阿拉伯糖总质量为第一次发酵红豆杉浆体质量的9％，葡萄糖、海藻糖和阿拉伯糖的质量比为2：3：0.5，复合菌种质量为第一次发酵红豆杉浆体质量的0.3％，复合菌种中酵母菌、鼠李糖乳杆菌、类干酪乳杆菌和巴氏醋杆菌的重量比为2：1.5：1.5：1；
(4)发酵果汁
取新鲜菠萝、黄柠檬和苹果经洗净、晾干、切块、榨汁，制得果汁，向果汁中加入葡萄糖、红糖和由酵母菌、类干酪乳杆菌、戊糖乳杆菌组成复合菌种，慢速搅拌均匀后，于35℃条件下发酵，发酵时间为15天，当pH为3时，停止发酵，制得发酵果汁；其中，葡萄糖质量为果汁质量的5％，红糖质量为果汁质量的5％，复合菌种质量为果汁质量的1％，复合菌种中酵母菌、类干酪乳杆菌和戊糖乳杆菌质量比为4：2：1；
(5)复配、螯合、调制以红豆杉为主的发酵物
将第二次发酵红豆杉浆体在200目滤网下进行压滤，过滤后的液体与发酵水果汁混合后，将混合液体于常温下螯合72h，添加果胶酶，慢速搅拌后，静置24小时，测量得pH值为2.8时，采用UHT法，于135℃杀菌8秒，取上层清液得到红豆杉发酵液制品；其中，过滤后的液体与发酵水果汁的质量比为1：0.3，果胶酶质量为混合液体质量的0.15％。
对比例2
一种红豆杉发酵液制品的制备方法，包括以下步骤：
(1)准备红豆杉浆体
取新鲜红豆杉叶片，清水清洗三次，再使用无菌水进行超声波清洗3min，然后沥干水分，使含水率为50％，再于紫外线波长254mm下，照射10min杀菌，杀菌后的红豆杉叶片采用快速冻干技术，于-25℃条件下冻干，最后将红豆杉叶片和无菌水按照重量份1：1.8混合，再在破壁机中以80000转/min的速度进行粉碎，制得红豆杉浆体；
(2)酶解红豆杉浆体
在红豆杉浆体中添加由纤维素酶、半纤维素酶和和木瓜蛋白酶组成的复合酶，混合均匀后，静置24小时，进行酶解处理，制得酶解红豆杉浆体；其中，复合酶质量为红豆杉浆体质量的0.25％，复合酶中纤维素酶、半纤维素酶和和木瓜蛋白酶的质量比为2：2：1；
(3)第一次发酵红豆杉浆体
在酶解红豆杉浆体中加入葡萄糖、海藻糖、红糖、叶酸、硫酸锰，慢速搅拌均匀后，加热至45℃，进行第一次发酵，发酵时间为15天，pH值为4.9时，结束第一次发酵，制得第一次发酵红豆杉浆体；其中，葡萄糖、海藻糖和红糖总质量为酶解红豆杉浆体质量的6％，葡萄糖、海藻糖和红糖的质量比为1：1：2，叶酸和硫酸锰总重量为酶解红豆杉浆体质量的0.01％，叶酸和硫酸锰的质量比为5：1；
(4)第二次发酵红豆杉浆体
在第一次发酵红豆杉浆体中加入叶酸、抗坏血酸、蛋白胨、葡萄糖、海藻糖、阿拉伯糖和由酵母菌、鼠李糖乳杆菌、类干酪乳杆菌和巴氏醋杆菌组成复合菌种，充分搅拌混合均匀后，于室温条件下，进行第二次发酵，发酵时间为85天，当pH为2.8时，停止发酵，制得第二次发酵红豆杉浆体；其中，叶酸质量为第一次发酵红豆杉浆体质量的1.5％，抗坏血酸质量为第一次发酵红豆杉浆体质量的1.5％，蛋白胨质量为第一次发酵红豆杉浆体质量的5％，葡萄糖、海藻糖和阿拉伯糖总质量为第一次发酵红豆杉浆体质量的9％，葡萄糖、海藻糖和阿拉伯糖的质量比为2：3：0.5，复合菌种质量为第一次发酵红豆杉浆体质量的0.3％，复合菌种中酵母菌、鼠李糖乳杆菌、类干酪乳杆菌和巴氏醋杆菌的质量比为2：1.5：1.5：1；
(5)发酵果汁
取新鲜菠萝、黄柠檬和苹果经洗净、晾干、切块、榨汁，制得果汁，向果汁中加入葡萄糖、红糖和由酵母菌、类干酪乳杆菌、戊糖乳杆菌组成复合菌种，慢速搅拌均匀后，于35℃条件下发酵，发酵时间为15天，当pH为3时，停止发酵，制得发酵果汁；其中，葡萄糖质量为果汁质量的5％，红糖质量为果汁质量的5％，复合菌种质量为果汁质量的1％，复合菌种中酵母菌、类干酪乳杆菌和戊糖乳杆菌质量比为4：2：1；
(6)复配、螯合、调制以红豆杉为主的发酵物
将第二次发酵红豆杉浆体在200目滤网下进行压滤，过滤后的液体与发酵水果汁混合后，将混合液体于常温下螯合72h，添加果胶酶，慢速搅拌后，静置24小时，测量得pH值为2.8时，采用UHT法，于135℃杀菌8秒，取上层清液得到红豆杉发酵液制品；其中，过滤后的液体与发酵水果汁的质量比为1：0.3，果胶酶质量为混合液体质量的0.15％。
结果检测
一、发酵时间
对实施例1-4和对比例1-2的红豆杉发酵液制品的制备时间进行统计，结果见表1，由表1可知，采用本发明方法制备具有抑菌功能的红豆杉发酵液制品，发酵速度得到了很大的提高，节约了发酵时间。
表1红豆杉发酵液制品的制备时间
二、发酵口感及紫杉醇、总黄酮(以芦丁计)和溶菌酶含量测定
对实施例1-4和对比例1-2制备的红豆杉发酵液制品的口感及紫杉醇、总黄酮(以芦丁计)和溶菌酶含量进行测定，其中，发酵口感中，酸度以“微酸、略酸、酸”代表酸度依次上升，苦度以“微苦、稍苦、苦”代表苦度依次上升，紫杉醇含量采用高效液相色谱仪检测，总黄酮含量采用分光光度计检测，溶菌酶含量采用酶联免疫分析试剂盒检测。
以上检测结果见表2，由表2可知，采用本发明的制备方法制备的具有抑菌功能的红豆杉发酵液制品口感略酸、微苦，紫杉醇含量可达到1.13mg/L，总黄酮含量可达到1398mg/kg，溶菌酶可达到121.91IU/L。
表2发酵口感及紫杉醇、总黄酮(以芦丁计)和溶菌酶含量
三、氨基酸含量测定
对实施例1制备的具有抑菌功能的红豆杉发酵液制品中氨基酸含量采用HPLC法进行测定，检测结果见表3，由表3可知，本发明制备的具有抑菌功能的红豆杉发酵液制品中总氨基酸含量超过了0.2mg/mL。
表3具有抑菌功能的红豆杉发酵液制品中氨基酸含量
测试项目 测试结果(mg/L) 测试项目 测试结果(mg/L)
门冬氨酸 0.067 谷氨酸 0.032
羟脯氨酸 0.002 丝氨酸 0.017
甘氨酸 0.007 组氨酸 0.003
精氨酸 0.004 苏氨酸 0.007
丙氨酸 0.019 脯氨酸 0.009
酪氨酸 0.005 缬氨酸 0.007
蛋氨酸 0.001 半胱氨酸 0.005
异亮氨酸 0.006 亮氨酸 0.007
苯丙氨酸 0.006 赖氨酸 0.006
四、抑菌效果
对实施例1制备的具有抑菌功能的红豆杉发酵液制品采用悬液定量抑菌试验，测其对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、溶血性链球菌的抑菌效果。具体操作方法为：将试验菌24h新鲜斜面培养物用PBS洗下，用0.03mol/L PBS(pH7.2～7.4)稀释至5.0×105CFU/mL～4.5×106CFU/mL菌悬液备用，取无菌试管，加入5.0mL发酵液制品，置于20℃的水浴中5min后，再加入0.1mL菌悬液，迅速混匀，并立即计时，待试验菌与发酵液原液相互作用至1min、3min、5min、8min、10min时，分别吸取1.0mL试验菌与样品的混合液接种2个平皿，倾注培养基，进行培养计数，计算杀灭对数值，试验重复3次，取平均值。菌量无法计数时，以PBS做10倍系列稀释，选适宜稀释度分别吸取1.0mL接种2个平皿，做活菌培养计数，同时用PBS代替样品，进行平行试验，作为阳性对照，阳性对照回收菌落数在1.0×104CFU/mL～9.0×104CFU/mL之间，取同批次PBS、培养基作阴性对照，所有试验样本和对照样本均在36℃培养，试验重复3次，计算杀灭对数值；其中，金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的培养使用营养琼脂培养基，溶血性链球菌的培养使用肉浸液肉汤培养基。检测结果见表4，由表4可知，当使用发酵液制品对菌悬液作用5min以上时，悬液内的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌以及溶血性链球菌的降低对数值均大于3，当作用8min以上时，降低对数值均大于3.5，表明本发明制备的具有抑菌功能的红豆杉发酵液制品具有一定的抑菌效果，其起作用的有效成分为总黄酮和溶菌酶。
表4试验菌降低的对数值
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种具有抑菌功能的红豆杉发酵液药物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将红豆杉叶片经打浆制成红豆杉浆体，加入复合酶进行酶解，制得酶解红豆杉浆体；
（2）在酶解红豆杉浆体中加入碳源、有机酸、无机盐和凝结芽孢杆菌，于45-55℃条件下，进行第一次发酵，当pH为4-5时，停止发酵，制得第一次发酵红豆杉浆体；
（3）在第一次发酵红豆杉浆体中加入有机酸、氮源、碳源和复合菌种，于室温条件下，进行第二次发酵，当pH为2-3时，停止发酵，制得第二次发酵红豆杉浆体；
（4）在果汁中加入碳源和复合菌种，于30-37℃条件下发酵，当pH为2.5-3.5时，停止发酵，制得发酵果汁；
（5）将第二次发酵红豆杉浆体过滤，过滤后的液体与发酵果汁混合得混合液体，于常温条件下，螯合70-76h，当pH值为2-3时，经杀菌取上清液，制得具有抑菌功能的红豆杉发酵液药物；
步骤（1）中复合酶为由纤维素酶、半纤维素酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、和淀粉酶中的至少两种组成；
步骤（3）中复合菌种是由酵母菌、巴氏醋杆菌和以下7种菌中至少两种混合而成，这7种菌分别为：枯草芽胞杆菌、植物乳杆菌植物亚种、类干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、嗜热链球菌、戊糖乳杆菌和唾液乳杆菌；
步骤（4）中复合菌种是由酵母菌和以下7种菌中至少一种混合而成，这7种菌分别为：枯草芽胞杆菌、植物乳杆菌植物亚种、类干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、嗜热链球菌、戊糖乳杆菌和唾液乳杆菌。
2.根据权利要求1所述的具有抑菌功能的红豆杉发酵液药物的制备方法，其特征在于，步骤（1）中复合酶质量为红豆杉浆体质量的0.2-0.35%。
3.根据权利要求1所述的具有抑菌功能的红豆杉发酵液药物的制备方法，其特征在于，步骤（2）中凝结芽孢杆菌质量为酶解红豆杉浆体质量的0.1-0.2%。
4.根据权利要求1所述的具有抑菌功能的红豆杉发酵液药物的制备方法，其特征在于，步骤（3）中复合菌质量为第一次发酵红豆杉浆体质量的0.2-0.3%。
5.根据权利要求1所述的具有抑菌功能的红豆杉发酵液药物的制备方法，其特征在于，步骤（5）中混合液螯合后，pH值为2-3时，添加果胶酶后静置，再进行杀菌处理。
6.权利要求1-5任一项所述的具有抑菌功能的红豆杉发酵液药物的制备方法制得的具有抑菌功能的红豆杉发酵液药物。
7.权利要求6所述的具有抑菌功能的红豆杉发酵液药物在制备抑菌药物方面的应用。
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