CN107964519A - 一种促进植物乳杆菌st-iii生长的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种促进植物乳杆菌ST‑III生长的方法，该方法包括以下步骤：分别向培养介质中接种植物乳杆菌ST‑III和肠膜明串珠菌BD01710，搅拌混合均匀后进行培养，培养温度为35‑40℃，培养时间为18‑26h，即可。本发明的积极进步效果在于：本发明基于传统发酵食品中的微生物组分析及微生物种间相互作用关系的研究结果，公布了一种促进植物乳杆菌ST‑III生长的方法。具体地，本发明通过共培养实验发现了肠膜明串珠菌BD01710对植物乳杆菌的生长促进作用，并在此基础上构建了基于肠膜明串珠菌和植物乳杆菌的二元发酵体系，该体系能实现植物乳杆菌ST‑III的生长。
Description
技术领域
本发明涉及微生物发酵技术领域，具体涉及一种促进植物乳杆菌ST-III生长的方法。
背景技术
植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)是一类重要的益生菌，因其降胆固醇、降血糖、抑制病原性细菌以及富集重金属等各种生理功能而成为功能性益生菌开发的热点。植物乳杆菌ST-III是一株性能优异的益生菌，因其广泛的生理活性，目前已被添加到各类产品中。然而，植物乳杆菌在乳品领域规模化应用还面临一个主要的技术瓶颈，目前已鉴定的植物乳杆菌菌株在很多天然食品介质中均难以生长。
为了解决上述问题，学术界及企业界建立了一系列促进植物乳杆菌生长的方法。如申请号为201210509515.5的中国专利，建立了一种植物乳杆菌发酵乳及其制备方法，通过向牛乳中加入适量氨基酸、核苷酸，解除了植物乳杆菌在乳中生长繁殖的限制性因子，使植物乳杆菌能在牛乳中能发酵产酸，并提高活性植物乳杆菌含量；以及申请号为201610826426.1的中国专利，通过加入植物乳杆菌增殖剂的方法实现了植物乳杆菌ST-III在乳中的生长，并在此基础上建立了发酵产品。上述研究虽然有一些技术突破，但总体上是通过向乳介质中加入额外的、促进生长的成分来实现植物乳杆菌的生长，在理论研究及实际生产应用中有很大的局限性。尤其在主打天然、无添加概念的当下，上述技术方案在产品开发中还存在一些问题。
发明内容
本发明的目的是针对植物乳杆菌ST-III在乳中几乎不生长与产酸缓慢、菌种数含量低等技术难题，经过实验发现肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)BD01710对植物乳杆菌ST-III的生长促进作用，在此基础上提供了一种富含植物乳杆菌ST-III的发酵乳，以及该发酵乳的制备方法。
本发明的为达到上述目的，具体通过以下技术方案得以实现的：
一种促进植物乳杆菌ST-III生长的方法，该方法包括以下步骤：分别向培养介质中接种植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)ST-III和肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)，搅拌混合均匀后进行培养，培养温度为35-40℃，培养时间为18-26h，即可；
所述的肠膜明串珠菌为保藏号CGMCC NO.6432的肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)BD01710。
进一步地，所述的植物乳杆菌ST-III的接种量为106-107CFU/mL，所述肠膜明串珠菌BD01710的接种量为106-107CFU/mL。
进一步地，所述的植物乳杆菌ST-III与肠膜明串珠菌的接种量之比为1:10-10:1。
进一步地，所述培养介质为由5-10％的全脂乳粉或脱脂乳粉、0-5％的蔗糖及补足至100％的水，经过溶解、混合、均质、杀菌、冷却后制得；所述百分比为质量百分比。
进一步地，所述培养介质为将原奶标准化后，加入3-8％蔗糖和0-1.5ppm葡萄糖酸锰，经过溶解、混合、均质、杀菌、冷却后制得；所述百分比为质量百分比。
进一步地，所述培养介质为无菌紫薯提取液，其制备方法包括以下步骤：取新鲜紫薯，洗干净后切成小块，清洗，榨汁，过滤取汁，煮沸1-10min，6000-8000g离心2-10min，取上清，加入终浓度为2-7％的蔗糖，溶解，调节pH至6.5-7.0，灭菌，冷却至室温，即得；所述百分比为质量百分比。
进一步地，所述的榨汁采用榨汁机压榨；所述的过滤采用100目纱布过滤；所述杀菌的温度为90-95℃，时间为5-20min。
本发明的积极进步效果在于：
1、本发明基于传统发酵食品中的微生物组分析及微生物种间相互作用关系的研究结果，公布了一种促进植物乳杆菌ST-III生长的方法。具体地，本发明通过共培养实验发现了肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)BD01710对植物乳杆菌的生长促进作用，并在此基础上构建了基于肠膜明串珠菌和植物乳杆菌的二元发酵体系，该体系能实现植物乳杆菌ST-III的生长。
2、在经过优选的复配比例下，该方法对植物乳杆菌ST-III生长促进作用明显。在紫薯提取液中，该体系经发酵，植物乳杆菌ST-III活菌数可达109CFU/mL以上；在植物乳杆菌生长困难的乳介质中，该体系经发酵后发生明显凝乳，其中植物乳杆菌ST-III活菌数可达5×108CFU/mL。
3、本发明的技术方案为益生菌在以乳和蔬果汁为代表的食品介质中的规模化应用提供了新的技术路径，在未来益生菌发酵制品的开发及益生菌制剂领域将有重要应用价值。
生物材料保藏信息：
本发明提供的肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)BD01710菌株，已于2012年08月13日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101。该菌株的保藏编号为：CGMCC No.6432。
附图说明
图1为本发明在植物乳杆菌ST-III在乳介质中加入BD01710与未加入BD01710的生长及凝乳对比图。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步详细说明。如没有特殊说明，本发明所采用的各种原料均可从市场上购买。未具体说明的步骤，为本领域常规制备手段。
一种促进植物乳杆菌ST-III生长的方法，该方法包括以下步骤：分别向培养介质中接种植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)ST-III和肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)，搅拌混合均匀后进行培养，培养温度为35-40℃，培养时间为18-26h，即可。
植物乳杆菌ST-III为光明乳业股份有限公司的专利菌株(菌种保藏号CGMCC0847，来源可参见公告号为CN 1207382C的中国专利)，以下称为ST-III。
所述的肠膜明串珠菌为保藏号CGMCC NO.6432的肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)BD01710(肠膜明串珠菌BD01710为光明乳业股份有限公司的专利菌株，其来源可参见公告号为CN 103013891B的中国专利)，以下称为BD01710。
植物乳杆菌ST-III和肠膜明串珠菌BD01710可分别通过在常规MRS培养基中活化，扩大培养，经过离心清洗分装等步骤，制备成原料中的植物乳杆菌ST-III和肠膜明串珠菌BD01710的冷冻干燥的浓缩菌粉，该操作为本领域常规操作。将肠膜明串珠菌BD01710的冻干粉作为植物乳杆菌ST-III在发酵乳中的辅助发酵剂，促进植物乳杆菌ST-III的生长。菌种的获得方式本领域常规操作。
如采用冻干粉形式获得，首先进行菌种活化，将冷冻保存的植物乳杆菌ST-III及肠膜明串珠菌BD01710菌种分别接种于MRS液体培养基中，在温度37℃下培养18-22h，如此传代培养2-3次得到活化的菌种；所述的MRS液体培养基组成如下：10g蛋白胨、10g牛肉膏、5g酵母浸粉、20g葡萄糖、2g磷酸氢二钾、5g乙酸钠、2g柠檬酸三钠、1g吐温80、200mg硫酸镁、54mg硫酸锰及1000mL蒸馏水，调节pH至6.5，121℃灭菌15min。MRS培养基为本领域常规培养基，可直接市购得。
将上述得的培养物，通过离心收集菌体，经蒸馏水清洗三次后进行分装，分装以后的菌体沉淀经冻干后保存。离心之前取少量样品通过平板倾注的方法进行细胞计数(计数结果用于调整两种发酵菌种的接种数量及比例)。在接种前以培养介质基液进行充分重悬。
本发明利用肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)对益生菌的生长促进作用实现益生菌在食品介质中的生长，尤其是乳介质中生长及凝乳，通过肠膜明串珠菌BD01710的促生长作用制得基于益生菌发酵的、高活菌数的益生菌发酵制品。所使用的肠膜明串珠菌BD01710属于公认安全的肠膜明串珠菌肠膜亚种(Leuconostoc mesenteroidessubsp.mesenteroides)。
肠膜明串珠菌BD01710属于被我国卫生部(卫生部公告2012年第8号)与美国食品药品监督管理局列为安全可食用菌种之一(FDA，1989)。所添加的肠膜明串珠菌BD01710可以产生葡聚糖及果聚糖等膳食纤维(ZL 201310443498.4),这些多糖本身可以作为健康的膳食补充剂，同时为上述发酵制品带来额外的质构上的优势。
进一步地，所述的植物乳杆菌ST-III的接种量为106-107CFU/mL，所述肠膜明串珠菌BD01710的接种量为106-107CFU/mL；或所述的植物乳杆菌ST-III与肠膜明串珠菌的接种量之比为1:10-10:1。
进一步地，所述原料乳为本领域的常规选择，由5-10％的全脂乳粉或脱脂乳粉、0-5％的蔗糖及补足至100％的水，经过溶解、混合、均质、杀菌、冷却后制得，较佳地为10％的全脂乳粉或脱脂乳粉、5％的蔗糖及补足至100％的水，将混合后的原料预热升温，在60-70℃、18-22MPa下进行均质，然后于90-95℃下，保温杀菌5-10min，然后冷却至40-45℃，制得原料乳；所述百分比为质量百分比。
或所述原料乳为将原奶标准化后，加入3-8％蔗糖和0-1.5ppm葡萄糖酸锰，经过溶解、混合、均质、杀菌、冷却后制得，较佳地为5％蔗糖和1.0ppm葡萄糖酸锰，将原料混合均匀后预热升温，在60-70℃、18-22MPa条件下进行均质，然后于90-95℃下，保温杀菌5-10min，然后冷却至35-42℃，待用。原料乳或使用其他适用于发酵乳制品的乳制品原料；所述百分比为质量百分比。
实施例1
原料准备：原料乳，由10％的全脂乳粉或脱脂乳粉、5％的蔗糖及补足至100％的水，经过充分溶解，混合均匀，均质(70℃，22MPa)，95℃杀菌10min,冷却至45℃待用。
分别向原料乳中接种植物乳杆菌ST-III(107CFU/mL)和肠膜明串珠菌BD01710(3×106CFU/mL)，搅拌混合均匀后进行培养，培养温度为37℃，培养时间为24h，得发酵乳样品。
对上述发酵乳样品进行取样，经梯度稀释后以平板计数法进行计数。与相同条件下仅接种植物乳杆菌ST-III进行比较，得到结果如表1，可见该发酵乳中活性植物乳杆菌ST-III的含量高于5×108CFU/mL。
表1：实施例1的发酵乳样品的pH值及活菌数
实施例2
原料准备：原料乳，由10％的全脂乳粉或脱脂乳粉、5％的蔗糖及补足至100％的水，经过充分溶解，混合均匀，均质(70℃，22MPa)，95℃杀菌10min,冷却至45℃待用。
分别向原料乳中接种植物乳杆菌ST-III(107CFU/mL)和肠膜明串珠菌BD01710(106CFU/mL)，搅拌混合均匀后进行培养，培养温度为40℃，培养时间为26h，得发酵乳样品。
对上述发酵乳样品进行取样，经梯度稀释后以平板计数法进行计数。与相同条件下仅接种植物乳杆菌ST-III进行比较，得到结果如表2，可见该发酵乳中活性植物乳杆菌ST-III的含量高于5×108CFU/mL。
表2：实施例2的发酵乳样品的pH值及活菌数
实施例3
原料准备：培养介质为原料乳，由10％的全脂乳粉或脱脂乳粉、5％的蔗糖及补足至100％的水，经过充分溶解，混合均匀，均质(60℃，22MPa)，95℃杀菌5min,冷却至40℃待用。
分别向原料乳中接种植物乳杆菌ST-III(106CFU/mL)和肠膜明串珠菌BD01710(107CFU/mL)，搅拌混合均匀后进行培养，培养温度为35℃，培养时间为18h，得发酵乳样品。
对上述发酵乳样品进行取样，经梯度稀释后以平板计数法进行计数。与相同条件下仅接种植物乳杆菌ST-III进行比较，得到结果如表3，所述的发酵乳中活性植物乳杆菌的含量高于5×108CFU/mL。
表3：实施例3的发酵乳样品的pH值及活菌数
实施例4
原料准备：培养介质为将原奶标准化后，加入5％蔗糖和1.0ppm葡萄糖酸锰，将原料混合均匀后预热升温，在60℃、18MPa条件下进行均质，然后于90℃下，保温杀菌10min，然后冷却至42℃。
分别向原料乳中接种植物乳杆菌ST-III(107CFU/mL)和肠膜明串珠菌BD01710(106CFU/mL)，搅拌混合均匀后进行培养，培养温度为37℃，培养时间为24h，得发酵乳样品。
对上述发酵乳样品进行取样，经梯度稀释后以平板计数法进行计数。与相同条件下仅接种植物乳杆菌ST-III进行比较，得到结果如表4，可见该发酵乳中活性植物乳杆菌ST-III的含量高于109CFU/mL。
表4：实施例4的发酵乳样品的pH值及活菌数
实施例5
原料准备：原料乳为将原奶标准化后，加入5％蔗糖和1.0ppm葡萄糖酸锰，将原料混合均匀后预热升温，在60℃、18MPa条件下进行均质，然后于90℃下，保温杀菌10min，然后冷却至35℃。
分别向原料乳中接种植物乳杆菌ST-III(107CFU/mL)和肠膜明串珠菌BD01710(3×106CFU/mL)，搅拌混合均匀后进行培养，培养温度为37℃，培养时间为24h，得发酵乳样品。
对上述发酵乳样品进行取样，经梯度稀释后以平板计数法进行计数。与相同条件下仅接种植物乳杆菌ST-III进行比较，得到结果如表5，可见该发酵乳中活性植物乳杆菌ST-III的含量高于109CFU/mL。
表5：实施例1的发酵乳样品的pH值及发酵乳中的活菌数
实施例6
原料准备：培养介质为无菌紫薯提取液，其制备方法包括以下步骤：取新鲜紫薯，洗干净后切成小块，清洗，采用榨汁机压榨，100目纱布过滤取汁，煮沸1min，6000g离心2min，取上清，加入终浓度为2％(w/v)的蔗糖，溶解，调节pH至6.5，90℃灭菌20min，冷却至室温。
分别向原料乳中接种植物乳杆菌ST-III(106CFU/mL)和肠膜明串珠菌BD01710(107CFU/mL)，搅拌混合均匀后进行培养，培养温度为35℃，培养时间为26h，得发酵乳样品。
对上述发酵乳样品进行取样，经梯度稀释后以平板计数法进行计数。与相同条件下仅接种植物乳杆菌ST-III进行比较，得到结果如表6，可见该发酵乳中活性植物乳杆菌ST-III的含量高于109CFU/mL。
表6：实施例6的发酵乳样品的pH值及活菌数
实施例7
原料准备：培养介质为无菌紫薯提取液，其制备方法包括以下步骤：取新鲜紫薯，洗干净后切成小块，清洗，榨汁，过滤取汁，煮沸10min，8000g离心10min，取上清，加入终浓度为7％(w/v)的蔗糖，溶解，调节pH至7.0，灭菌，冷却至室温。
分别向原料乳中接种植物乳杆菌ST-III(107CFU/mL)和肠膜明串珠菌BD01710(106CFU/mL)，搅拌混合均匀后进行培养，培养温度为40℃，培养时间为18h，得发酵乳样品。
对上述发酵乳样品进行取样，经梯度稀释后以平板计数法进行计数。与相同条件下仅接种植物乳杆菌ST-III进行比较，得到结果如表7，可见该发酵乳中活性植物乳杆菌ST-III的含量高于109CFU/mL。
表7：实施例7的发酵乳样品的pH值及活菌数
实施例8
原料准备：培养介质为无菌紫薯提取液，其制备方法包括以下步骤：取新鲜紫薯，洗干净后切成小块，清洗，榨汁，过滤取汁，煮沸5min，8000g离心8min，取上清，加入终浓度为5％(w/v)的蔗糖，溶解，调节pH至7.0，95℃灭菌10min，冷却至室温。
分别向原料乳中接种植物乳杆菌ST-III(3×106CFU/mL)和肠膜明串珠菌BD01710(107CFU/mL)，搅拌混合均匀后进行培养，培养温度为37℃，培养时间为24h，得发酵乳样品。
对上述发酵乳样品进行取样，经梯度稀释后以平板计数法进行计数。得到结果如表8，可见该发酵乳中活性植物乳杆菌ST-III的含量高于109CFU/mL。
表8：实施例8的发酵乳样品的pH值及活菌数
如图1所示，对于实施例1,同时接种了植物乳杆菌ST-III和肠膜明串珠菌BD01710的发酵乳与未接种肠膜明串珠菌BD01710的发酵乳，实施例1的发酵乳中植物乳杆菌ST-III的菌种量明显提高，且凝乳效果明显。
应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明做各种改动或修改，这些等价形式同样落雨本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (7)
1.一种促进植物乳杆菌ST-III生长的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：分别向培养介质中接种植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)ST-III和肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)，搅拌混合均匀后进行培养，培养温度为35-40℃，培养时间为18-26h，即可；
所述的肠膜明串珠菌为保藏号CGMCC NO.6432的肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)BD01710。
2.如权利要求1所述的促进植物乳杆菌ST-III生长的方法，其特征在于，所述的植物乳杆菌ST-III的接种量为106-107CFU/mL，所述肠膜明串珠菌BD01710的接种量为106-107CFU/mL。
3.如权利要求1所述的促进植物乳杆菌ST-III生长的方法，其特征在于，所述的植物乳杆菌ST-III与肠膜明串珠菌的接种量之比为1:10-10:1。
4.如权利要求1所述的促进植物乳杆菌ST-III生长的方法，其特征在于，所述培养介质为由5-10％的全脂乳粉或脱脂乳粉、0-5％的蔗糖及补足至100％的水，经过溶解、混合、均质、杀菌、冷却后制得；所述百分比为质量百分比。
5.如权利要求1所述的促进植物乳杆菌ST-III生长的方法，其特征在于，所述培养介质为将原奶标准化后，加入3-8％蔗糖和0-1.5ppm葡萄糖酸锰，经过溶解、混合、均质、杀菌、冷却后制得；所述百分比为质量百分比。
6.如权利要求1所述的促进植物乳杆菌ST-III生长的方法，其特征在于，所述培养介质为无菌紫薯提取液，其制备方法包括以下步骤：取新鲜紫薯，洗干净后切成小块，清洗，榨汁，过滤取汁，煮沸1-10min，6000-8000g离心2-10min，取上清，加入终浓度为2-7％的蔗糖，溶解，调节pH至6.5-7.0，灭菌，冷却至室温，即得；所述百分比为质量百分比。
7.如权利要求6所述的促进植物乳杆菌ST-III生长的方法，其特征在于，所述的榨汁采用榨汁机压榨；所述的过滤采用100目纱布过滤；所述杀菌的温度为90-95℃，时间为5-20min。
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