CN102816724B - 一株放射形根瘤菌及其胞外多糖与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株新的放射形根瘤菌菌株和其所产生的胞外多糖，以及该胞外多糖的制备方法和应用。所述的菌株是保藏号为CGMCC NO.4524的放射形根瘤菌（Rhizobium radiobacter）S10菌株；所述的胞外多糖主要由半乳糖和葡萄糖组成，其摩尔比为1.00︰4.60～6.40，该胞外多糖的平均重量分子量在3.5×103～3.8×106道尔顿之间。本发明所述放射形根瘤菌菌株的胞外多糖水溶性好，且在低浓度时具有很好的粘度、很好的表面活性、很好的蛋白质可混性以及极好的稳定性/乳化性。
Description
技术领域
本发明涉及一株新的放射形根瘤菌菌株和由该菌株发酵产生的胞外多糖，以及该多糖的制备方法和应用。
背景技术
众所周知，某些特定的微生物（如乳酸菌、土壤杆菌、根瘤菌）在生长过程中，可以产生多种类型的多糖，根据这些多糖所处的位置，可以分为荚膜多糖和分泌到生长环境中的多糖，又称为胞外多糖。这些多糖对产生菌在自然环境中具有保护作用，可以使产生菌避免受到干燥、紫外辐射、渗透压变化、抗生素、噬菌体侵染所引起的伤害以及在体内抗吞噬作用。最近的研究发现，部分土壤杆菌所产生的胞外多糖具有作为增稠剂和/或胶凝剂的作用，如放射形土壤杆菌I-2001菌株（放射形根瘤菌旧称为放射形土壤杆菌）所产生的胞外多糖在膳食制品中用于高端配料的制作。因此，这些微生物来源的多糖成为某些增稠剂和/或胶凝剂的重要来源，开发和利用这些胞外多糖也日益成为食品添加剂研究领域的前沿。
发明内容
本发明的目的是提供一株新的放射形根瘤菌菌株和由该菌株所产生的胞外多糖，以及该胞外多糖的制备方法和应用。本发明的目的是通过以下技术方案来实现的。
本发明提供的技术方案之一是：一株新的放射形根瘤菌菌株，其是保藏号为CGMCC NO.4524的放射形根瘤菌(Rhizobium radiobacter)S10菌株。
该菌株经16S rRNA基因测序的结果如SEQ ID NO.1所示。
本发明提供的技术方案之二是：一种放射形根瘤菌的胞外多糖，所述的胞外多糖主要由半乳糖和葡萄糖组成，所述的半乳糖和葡萄糖的摩尔比为1.00︰4.60～6.40，该胞外多糖的平均重量分子量在3.5×103～3.8×106道尔顿之间。
本发明中，所述的胞外多糖为一种纯白色的丝状物或粉末，在λ=195nm处有强烈的吸收；10.0mg/mL的所述多糖的水溶液澄清透明、无色、无味，pH值为6.0～7.1。
本发明中，所述的胞外多糖可以由前述保藏号为CGMCC NO.4524的放射形根瘤菌（Rhizobium radiobacter）S10菌株产生，也可以由其它的可以产胞外多糖的放射形根瘤菌菌株产生。较佳地，所述的胞外多糖由前述保藏号为CGMCC NO.4524的放射形根瘤菌（Rhizobium radiobacter）S10菌株所产生。
本发明中，较佳地，所述的胞外多糖中平均重量分子量在2.0×106～3.8×106道尔顿之间的胞外多糖占80～85%，平均重量分子量在3.5×103～2.0×106道尔顿之间的胞外多糖占15～20%，以上百分比均指占总的胞外多糖的重量百分比。
在本发明的一较佳实例中，本发明的放射形根瘤菌胞外多糖中的半乳糖和葡萄糖的摩尔比为1.00︰5.19；平均重量分子量为3,377,709道尔顿的胞外多糖占83.97%，平均重量分子量为6,596道尔顿的胞外多糖占16.03%，以上百分比均指占总的胞外多糖的重量百分比。
在本发明的另一较佳实例中，本发明的放射形根瘤菌胞外多糖中的半乳糖和葡萄糖的摩尔比为1.00︰5.23；平均重量分子量为2,948,419道尔顿的胞外多糖占87.90%，平均重量分子量为3,578道尔顿的胞外多糖占12.10%，以上百分比均指占总的胞外多糖的重量百分比。
本发明提供的技术方案之三是：一种放射形根瘤菌胞外多糖的制备方法。
本发明中，所述的制备方法可以是将所述的放射形根瘤菌按照现有技术内常规的培养方法培养得到发酵液，然后将发酵液采用常规的多糖分离方法分离得到胞外多糖。
较佳地，所述的制备方法包括如下步骤：
1）发酵，即将放射形根瘤菌于24～38℃下，在无菌培养基中发酵24～120小时得发酵液；其中，所述的无菌培养基为下列任一种：①固形物含量为3～12%(w/w)的脱脂乳；②3～12%(w/w)脱盐乳清和③常规的用于培养放射形根瘤菌的无菌合成培养基；
2）灭酶，即将步骤1）制得的发酵液在95～100℃加热10～30分钟，以灭活发酵液中使多糖发生降解的酶；
3）收获上清液，即在经过步骤2）灭酶处理后的发酵液中加入三氯乙酸，使其终浓度达到4～10％(w/v)，静置8～16小时，离心获得发酵上清液；
4）沉淀、透析和干燥，即在步骤3）获得的上清液中加入2～4倍体积的体积百分数为80～100%的乙醇，离心或过滤收集沉淀物并将沉淀物溶于蒸馏水，用截留分子量为10,000D的透析袋在蒸馏水中透析48～72小时，每12~24小时换水一次，在温度不超过105℃下干燥或者真空冷冻干燥得胞外多糖粗品。
本发明中，所述的胞外多糖粗品包括85～95%的前述放射形根瘤菌胞外多糖和5～15%的游离蛋白，所述的百分比为质量百分比。
本发明中，步骤1）中所述常规的用于培养放射形根瘤菌的无菌合成培养基由碳水化合物、氮源和无机盐组成；较佳地，所述的碳水化合物选自葡萄糖、蔗糖和乳糖中的任一种或多种，所述的氮源选自胰蛋白胨和/或酵母浸出物，所述的无机盐选自MgCl2和磷酸盐中的任一种或多种；更佳地，所述的限定化学组成的无菌合成培养基包括下列各组分：10g/L蔗糖，3g/LKH2PO4，5g/LNa2HPO4，2.5g/L蛋白胨和0.25g/L MgSO4·7H2O，其pH值为7.0。
本发明中，所述的步骤1）还可以为：将用平板培养活化后的放射形根瘤菌接种于所述的无菌培养基中，用同样的培养条件培养得到含有多糖的发酵液；或者，将所述的放射形根瘤菌接种于所述的无菌培养基中发酵6～48小时，获得发酵种子液，再将发酵种子液接种于上述无菌培养基发酵，得到发酵液。
在本发明的一较佳实例中，所述的步骤1）为：将保藏号为CGMCCNO.4524的放射形根瘤菌（Rhizobium radiobacter）S10菌株于24～38℃下，在所述无菌培养基中发酵6～48小时，获得发酵种子液，再按0.5～8%（v/v）的接种量接种于所述的无菌培养基发酵，得到发酵液。
更佳地，所述的步骤1）为：将保藏号为CGMCC NO.4524的放射形根瘤菌（Rhizobium radiobacter）S10菌株于26～35℃下，在所述无菌培养基中发酵20～26小时，获得发酵种子液，再按2～4%（v/v）的接种量接种于所述无菌培养基发酵，得到发酵液。
最佳地，所述的步骤1）为：将保藏号为CGMCC NO.4524的放射形根瘤菌（Rhizobium radiobacter）S10菌株于28～33℃下，在所述无菌培养基中发酵24小时，获得发酵种子液，再按3%（v/v）的接种量接种于所述无菌培养基发酵，得到发酵液。
在本发明的另一较佳实例中，本发明的制备方法包括如下步骤：
1）将保藏号为CGMCC NO.4524的放射形根瘤菌（Rhizobiumradiobacter）S10菌株于24～38℃下，在无菌培养基中发酵24～120小时得发酵液；
2）将上述发酵液在95～100℃加热10～15分钟，然后离心或过滤获得发酵上清液；
3）加入2～3倍体积的体积百分数为95%乙醇于上述发酵上清液中，离心或过滤收集沉淀物，在温度不超过105℃下干燥得胞外多糖粗品；
其中，步骤1）所述发酵的温度优选25～35℃，更优选28℃；所述发酵的时间优选24～120小时，更优选120小时。
本发明所获得的胞外多糖粗品可以直接碾碎进行包装，也可以作为增稠剂、胶凝剂或多糖粉的生产原料使用。
本发明中，较佳地，在步骤4）之后还包括步骤5）：将制得的胞外多糖粗品进行进一步的纯化，以去除蛋白和其它杂质。
本发明中，所述进一步的纯化可以是现有技术中的任何常规的分离纯化的步骤。较佳地，所述进一步的纯化是采用三氯乙酸法去除蛋白和采用透析法去除其它杂质。所述的三氯乙酸法为将胞外多糖粗品用50～80℃蒸馏水溶解，使胞外多糖粗品的终浓度为0.3~1.5%（w/w），待溶液冷却至15～25℃时加入三氯乙酸，使三氯乙酸的最终质量浓度为4～10%，再将溶液于0～8℃放置过夜，离心或过滤去除沉淀物。所述的透析法为将去除沉淀后的胞外多糖溶液用截留分子量为10,000道尔顿的透析膜在0～8℃透析48～72小时；在透析过程中较佳地还可以进行多次换水。更佳地，步骤5）还包括，经过透析后的多糖溶液还可以采用凝胶排阻层析的方法进行更进一步的纯化。
本发明中，纯化后的多糖溶液可进行干燥以获得粉末状的多糖，干燥方法可以为本领域常规，较佳地选自热风干燥、低温干燥、冷风干燥、冷冻干燥、真空干燥和真空冷冻干燥中的任一种，更佳的干燥方法选自冷风干燥、冷冻干燥、真空干燥和真空冷冻干燥中的任一种。
本发明提供的技术方案之四是：一种增稠组合物，其包括前述胞外多糖和生理学上可接受的载体。
本发明中，所述的生理学上可接受的载体为常规，可以是食品领域常规的增稠剂辅料，如食品胶、淀粉等，也可以是其他领域符合国家相应标准的增稠剂辅料。
本发明提供的技术方案之五是：前述胞外多糖或增稠组合物在食品、医药和相关领域的应用。
本发明中，由于放射形根瘤菌（Rhizobium radiobacter）S10胞外多糖或多糖粗品能很好的溶于水形成胶态水溶性聚合物，能在低浓度时具有很高的粘度、很好的表面活性、很好的蛋白质可混性以及极好的稳定性/乳化性。基于这些性质，本发明所述胞外多糖或胞外多糖粗品可以被用作增稠剂、稳定剂、悬浮剂、乳化剂或润滑剂及其相关用途。
本发明的积极进步效果在于：本发明公开了一株新的放射形根瘤菌菌株及其胞外多糖与应用，同时公开了该菌株胞外多糖的制备方法。本发明所述菌株的胞外多糖水溶性好，且在低浓度时具有很好的粘度、很好的表面活性、很好的蛋白质可混性以及极好的稳定性/乳化性。本发明人经过严密的实验分析了所述胞外多糖的理化性质，并且验证了其作为食品添加剂和化妆品添加剂的效果，表明其具有广阔的应用前景。
生物材料的保藏
本发明的放射形根瘤菌菌株，于2010年12月30日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），地址为北京市朝阳区北辰西路1号院，中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC NO.4524，名称为放射形根瘤菌（Rhizobium radiobacter）S10。
附图说明
以下结合附图说明本发明的特征和有益效果。
图1为本发明放射形根瘤菌S10胞外多糖粗品在DEAE-SepharoseCL-6B离子交换柱上的洗脱曲线图；其中，纵坐标为洗脱液经过硫酸-苯酚比色法在n=490nm处的光吸收值OD，横坐标为试管号。
图2为本发明放射形根瘤菌S10胞外多糖带电荷部分峰2在Sepharose4B分子筛凝胶柱上的洗脱曲线图；其中，纵坐标为洗脱液经过硫酸-苯酚比色法在n=490nm处的光吸收值OD，横坐标为试管号。
图3为不同浓度下本发明放射形根瘤菌S10胞外多糖粗品在不同剪切速率下（1/s）的粘度，其中浓度从上到下分别为0.25％，0.5％，1.0％，测定温度为25℃。
图4为不同转速下（1/s）各样品的粘度值；其中系列C为发酵乳1，系列1为发酵乳2，系列2为发酵乳3，系列3为发酵乳4。
具体实施方式
下面用实施例来进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，均按照本领域常规方法和条件，或按照商品说明书选择；下列实施例中未特别说明的实验材料，均常规市售可得。
实施例1菌株的获得
本发明中的放射形根瘤菌菌株可通过如下途径获得：从新疆伊宁采集的开菲尔发酵乳中取出开菲尔颗粒，在无菌生理盐水中用无菌药勺捣碎，然后以无菌生理盐水系列稀释，取1mL稀释后的菌液加入到培养皿中，注入46℃、含有2％（w/v）脱脂乳的琼脂平板培养基中，待平板完全凝固后，30℃培养48小时。选取拉丝性好、呈黏液状且有明显突起的菌落，转接到含10％（w/v）灭菌脱脂乳的液体培养基中，30℃培养48小时，加入三氯乙酸，使其终浓度达到4％(w/v)，4℃静置10小时，离心（4℃，9000rpm）取上清加入3倍体积预冷的乙醇沉淀过夜，离心（4℃，9000rpm）取沉淀，透析冻干，即为胞外多糖粗品，苯酚硫酸法测多糖粗品产量，从而筛选出一株高产胞外多糖的菌株。该菌株为革兰氏阴性无芽孢杆菌，好气、有鞭毛。在营养琼脂及脱脂乳平板培养基上形成光滑、黏液状菌落且有明显突起，大多连成一片。该菌株16S rRNA基因序列在基因文库中的进入号为JX498970(Genebankaccess number JX498970)，根据其生理生化特性及16S rDNA序列分析的结果，经中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）鉴定为（Rhizobium radiobacter）S10菌株，并进行了保藏，保藏号为CGMCCNO.4524。
该菌株的微生物学特性如表1所示：
表1（Rhizobium radiobacter）S10菌株理化试验结果
实施例2
将保存的放射形根瘤菌S10接种到灭菌的10.0%（w/w)脱盐乳清中，于30℃培养72小时得到种子液。然后按0.5%（v/v）接种量转接到灭菌的12%(w/w)脱盐乳清中，于24℃发酵120小时得到发酵液。然后通过加热将发酵液的温度提升至100℃，并保温10分钟，待冷却至20℃时，然后加入三氯乙酸（TCA），使TCA的最终浓度为4%，在4℃放置12小时后，于4℃、9000rpm下离心20分钟去除沉淀物，收集上清液。在经过预冷的上清液中加入2倍体积的100%（v/v）酒精，在6℃放置12小时，过滤收集沉淀物，将沉淀物用50℃的蒸馏水充分溶解，采用截留分子量为10,000道尔顿的膜，在4℃透析72小时，中间换蒸馏水四次。经过透析后的胞外多糖溶液进行真空冷冻干燥，获得白色丝状的胞外多糖粗品（预留其1/3供实施例5之用）。
将获得的部分胞外多糖粗品按50℃蒸馏水溶解，配制成0.3%(w/w)溶液，待冷却至低于25℃后，加入三氯乙酸（TCA）至TCA终浓度为10%（w/v），在4℃放置12小时后，于4℃、9000rpm下离心20分钟去除沉淀物，收集上清液。收集的上清液采用截留分子量为10,000道尔顿的膜，在0℃透析52小时，中间换水4次。透析后的多糖溶液经过冷冻干燥后，用重蒸水配制成5.0mg/ml的溶液，进行离子交换[柱填料：DEAE-Sepharose CL-6B，柱子：3.5×35cm，洗脱液：Tris-HCl缓冲液（0.05mol/L，pH 7.60），流速：3mL/min，梯度洗脱液：含2M NaCL的Tris-HCl缓冲液（0.05mol/L，pH 7.60），]和凝胶排阻层析[柱填料：Sepharose 4B，柱子：2.0×75cm，洗脱液：重蒸馏水，上样浓度：7.0mg/mL，流速：0.25mL/min]后，得到2个纯化的多糖组份（多糖纯品），用于实施例8单糖组成及实施例9中胞外多糖分子量的分析。
实施例3
从30℃好氧培养24小时的2%（w/w）脱脂乳琼脂挑取新鲜培养的放射形根瘤菌S10菌落，转接到灭菌的12%（w/w）脱脂乳中，于38℃培养24小时，获得种子液。然后将上述种子液按3%体积比的接种量接种于灭菌的12%（w/w）脱脂乳中，于38℃培养24小时,获得S10多糖发酵液。将发酵液加热到95℃，保温30分钟，采用压滤的方式去除沉淀，收集发酵上清液。待冷却至25℃以后，加入4倍体积80%（v/v）的酒精，在6℃静置12小时，用多层尼龙布过滤收集沉淀。沉淀后的酒精溶液通过蒸馏回收，可以反复使用。采用乙醇沉淀所得到的胞外多糖经过低温烘干（温度不超过105℃），即获得胞外多糖粗品（预留其1/3供实施例5之用）。
将获得的部分胞外多糖粗品制备成多糖纯品，方法同实施例2。
实施例4
从30℃好氧培养24小时的2%（w/w）脱脂乳琼脂挑取新鲜培养的放射形根瘤菌S10菌落，转接到无菌的限定化学组成培养基，其组成为（g/L）：蔗糖10，KH2PO43，Na2HPO45，蛋白胨2.5，MgSO4·7H2O 0.25，pH 7.0。于24℃培养72小时得到种子液，然后按8%（v/v）接种量转接到上述无菌的限定化学组成培养基中，于28℃发酵120小时得到发酵液。然后通过加热将发酵液的温度提升至95℃以上，并保温10分钟，待冷却至20℃时，然后加入三氯乙酸（TCA），使TCA的最终浓度为4%（w/v），在4℃放置8小时后，于4℃、9,000rpm下离心20分钟去除沉淀物，收集上清液。在经过预冷的上清液中加入3倍体积的95%（v/v）酒精，在6℃放置12小时，过滤收集沉淀物，将沉淀物用50℃的蒸馏水充分溶解，采用截留分子量为10,000道尔顿的膜，在4℃透析48小时，中间换蒸馏水四次，得到胞外多糖溶液。该胞外多糖溶液经过冷冻干燥后得到胞外多糖粗品（预留其1/3供实施例5之用）。
将获得的部分胞外多糖粗品制备成多糖纯品，方法同实施例2。
实施例5
将实施例2～4预留的多糖粗品用50℃蒸馏水溶解，配制成0.5%(w/w)溶液，待冷却至25℃后，加入三氯乙酸（TCA）至TCA终浓度为10%（w/v），在4℃放置16小时后，于4℃、9000rpm下离心20分钟去除沉淀物，分别收集上清液和沉淀。收集的上清液采用截留分子量为10,000道尔顿的膜，在4℃透析72小时，中间换水4次，获得多糖溶液。然后采用凯氏定氮法和苯酚-硫酸法分别测定沉淀部分的游离蛋白质含量和多糖溶液中胞外多糖的含量，结果见表2，并预留部分多糖溶液供实施例6使用。说明：蛋白部分在沉淀中，多糖存留于溶液中。
表2
结论：本发明的胞外多糖粗品中，多糖的含量在87～95wt%之间，游离蛋白的含量在5～12wt%之间。
实施例6
将实施例5中的由实施例2～4预留的多糖粗品制得的多糖溶液采用苯酚-硫酸法（Dubois,M.,K.A.Gilles,J.K.Hamilton,P.A.Rebers,and F.Smith,1956.Colorimeteric method for determination of sugars and related substances.Anal.Chem.28:350-356）测定其碳水化合物的含量，以葡萄糖为基准，结果以mg/L来表示，放射形根瘤菌S10胞外多糖的产量见表3。
表3
| 胞外多糖 | 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 |
| 产量mg/L | 2,984 | 2,548 | 1,792 |
结论：采用本发明的制备方法从每升发酵液中得到的多糖的产量在1,792～2,984mg之间。
实施例7
分别取上述实施例2～4的胞外多糖粗品样品溶于蒸馏水中，配制成10.0mg/mL的溶液。
结果显示：各溶液澄清透明、无色、无味；在λ=195nm处有强烈的吸收；它们的pH值见表4。
表4
| 多糖粗品 | 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 |
| pH值 | 6.58 | 6.04 | 7.08 |
结论：10.0mg/mL的多糖溶液的pH值在6.0～7.10之间。
实施例8
取实施例2~4中制备的胞外多糖纯品样品采用高效阴离子色谱法测定多糖的单糖组成。
（1）多糖水解：
吸取100μL浓度为4-5mg/mL的多糖纯品样品溶液于5mL的具塞刻度试管中，加入100μL的4moL/LTFA，充N2封管，110℃烘箱中水解2h；冷却后打开盖，加200μL甲醇后用N2吹干，如此重复加甲醇并用N2吹3次，去除TFA，将其残渣用水溶解定容至5mL，用0.45μm微孔膜过滤后供进样分析。
（2）色谱条件：
色谱柱：CarboPac PA203mm i.d.×150mm；
流动相：A，H2O；B，250mmol/L NaOH；C，1mol/LNaAc，三元梯度洗脱；流速：0.5mL/min；积分脉冲安培检测器，Au工作电极，Ag/AgCL参比电极；进样体积：20μL；柱温：30℃。
结果显示：各胞外多糖样品都是分别由半乳糖、葡萄糖等糖基组成的，各糖基的摩尔比见表5。
表5
结论：在本发明的胞外多糖中，半乳糖、葡萄糖的摩尔比为1.00︰4.60～6.40。
实施例9
对实施例2中制备的胞外多糖溶液，进行高效液相（HPLC）分析：将不同分子量的标准Dextran相继进样，记录保留时间TR，以TR为横坐标，LgM为纵坐标绘制标准曲线，得出分子量与保留时间TR的回归方程。待测样品按下述步骤进样，根据所得TR，通过回归方程计算样品的相对分子量。高效液相色谱条件：
色谱仪：Waters 2690；
检测器：Waters 2410示差折光检测器和紫外检测器；
色谱柱：Waters UltrahydrogelTM Linear(Ф7.8mm×300mm ID)
两柱串连流动相：0.1mol/L NaNO3；
柱温：45℃；
流速：0.9mL/min；
进样量：20μL。
结果表明：在保留时间14min和20min处出现2个吸收峰，经过与标准分子量的多糖色谱对比，该多糖由大小不同的两部分多糖组成，该两部分多糖及其占据总多糖的比例见表6。
表6
| 吸收峰出现的时刻 | 平均重量分子量（道尔顿） | 占有比例wt% |
| 14min | 3,377,709 | 83.97 |
| 20min | 6,596 | 16.03 |
结论：实施例2的胞外多糖的平均重量分子量在6,596～3,377,709之间。
实施例10
将实施例4中制备的胞外多糖溶液进行离子交换[柱填料：DEAE-Sepharose CL-6B，柱子：3.5×35cm洗脱液：Tris-HCl缓冲液（0.05mol/L，pH 7.60），流速：3mL/min，梯度洗脱液：含2M NaCL的Tris-HCl缓冲液（0.05mol/L，pH 7.60），]和凝胶排阻层析[柱填料：Sepharose 4B，柱子：2.0×75cm，洗脱液：重蒸馏水，上样浓度：5.0mg/mL，流速：0.25mL/min]后，可以得到2个单独的多糖组份，分别为图1中的离子交换的吸收峰1、2。其中，带电荷部分峰2在Sepharose 4B分子筛凝胶柱上的洗脱曲线如图2所示。采用与实施例9相同的方法对获得的多糖组分进行测定，所获得的2个单独的多糖组份的平均重量分子量及其占据总多糖的重量比例见表7。
表7
| 吸收峰 | 平均重量分子量（道尔顿） | 比例wt% |
| 1 | 2,948,419 | 87.90 |
| 2 | 3,578 | 12.10 |
结论：实施例4的胞外多糖的平均重量分子量在3,578～2,948,419之间。
注：在图1中，随着洗脱时间先后顺序依次出现的峰分别为吸收峰1和峰2。
实施例11
利用S10胞外粗多糖生产O/W型化妆品乳液。配方如表8:
表8 O/W型化妆品乳液配方比较
| 名称 | 乳液1（w/%） | 乳液2（w/%） |
| S10粗多糖 | 0.4 | - |
| 黄原胶 | - | 0.4 |
| L-角叉胶 | 0.5 | 0.5 |
| 丙二醇 | 5.0 | 5.0 |
| C16AE | 2 | 2 |
| 液体石蜡 | 5 | 5 |
| 香精、防腐剂 | 适量 | 适量 |
| 水 | 适量至100 | 适量至100 |
将乳液1和乳液2放置1个月，均没有出现分层现象，且两种产品均具有很好的保湿性，使用后皮肤感觉柔软，吸收快，不黏腻，说明S10胞外多糖在化妆品乳液使用中能起到与黄原胶一样的作用。
实施例12
利用S10胞外多糖粗品作为增稠剂生产酸奶。配方如表9：
表9
将以上样品经95℃灭菌5min，按0.05%（w/w）接种量接入市售酸乳菌种，40℃发酵6h，冷藏过夜。同时观察各样品的外观及测定pH值，用TA公司的ARES流变仪测试不同转速下的粘度。试验结果如表10、图3和图4所示：
表10
| 名称 | pH值 | 外观 |
| 发酵乳1 | 4.46 | 质地均一，细腻有弹性，少量乳清析出 |
| 发酵乳2 | 4.76 | 有少量乳清析出，柔软有粘性，细腻 |
| 发酵乳3 | 4.49 | 有少量乳清析出，质地柔软、细腻 |
| 发酵乳4 | 4.48 | 有较多乳清析出，质地稍硬，紧致 |
添加S10多糖后的发酵乳，质地均一有弹性，风味清香，与空白对照组（发酵乳1）相比能明显提高发酵乳的粘度，与添加工业化产品结冷胶的阳性对照组（发酵乳2）相比，该多糖1.5‰添加量与对照1.0‰添加量有着相近的粘度，表明该胞外多糖可以作为增稠剂在发酵乳(如酸奶)中应用。
Claims (6)
1.一株放射形根瘤菌(Rhizobium radiobacter)S10，其特征在于，其保藏号为CGMCC NO.4524。
2.一种放射形根瘤菌胞外多糖的制备方法，其特征在于，其包括如下步骤：
1）将放射形根瘤菌于24～38℃下，在无菌培养基中发酵24～120小时得发酵液；其中，所述的无菌培养基为下列任一种：①按重量比计算固形物的含量为3～12%的脱脂乳，②质量百分数为3～12%的脱盐乳清和③无菌的限定化学组成培养基，所述的无菌的限定化学组成培养基的组成为：蔗糖10g/L，KH2PO43g/L，Na2HPO45g/L，蛋白胨2.5g/L，MgSO4·7H2O0.25g/L，pH7.0；所述的放射形根瘤菌是保藏号为CGMCC NO.4524的放射形根瘤菌（Rhizobium radiobacter）S10菌株；
2）将步骤1）制得的发酵液在95～100℃加热10～30分钟，以灭活发酵液中使多糖发生降解的酶；
3）在经过步骤2）灭酶处理后的发酵液中加入三氯乙酸，使其最终的质量体积百分数达到4～10％，静置8～16小时，离心获得发酵上清液；
4）在步骤3）获得的上清液中加入2～4倍体积的体积百分数为80～100%的乙醇，离心或过滤收集沉淀物并将沉淀物溶于水，用截留分子量为10,000D的透析袋在水中透析48～72小时，每12～24小时换水一次，在温度不超过105℃下干燥或者真空冷冻干燥得胞外多糖粗品。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤1）中所述发酵中放射形根瘤菌的接种量为0.5～8%，所述百分比为体积百分比。
4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤1）为：将保藏号为CGMCC NO.4524的放射形根瘤菌（Rhizobium radiobacter）S10菌株于24～38℃下，在所述无菌培养基中发酵6～48小时，获得发酵种子液，再按0.5～8%的接种量接种于所述的无菌培养基发酵，得到发酵液，所述百分比为体积百分比。
5.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，其在步骤4）之后还包括步骤5）：将制得的胞外多糖粗品进行进一步的纯化，以去除蛋白和其它杂质；所述进一步的纯化是采用三氯乙酸法去除蛋白和采用透析法去除其它杂质。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述的三氯乙酸法为将胞外多糖粗品用50～80℃蒸馏水溶解，使其质量浓度为0.3～1.5%，待溶液冷却至15～25℃时加入三氯乙酸，使三氯乙酸的最终质量浓度为4～10%，在0～8℃放置过夜，离心或过滤去除沉淀物；所述的透析法为将去除沉淀后的胞外多糖溶液用截留分子量为10,000道尔顿的透析膜在0～8℃透析48～72小时。
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