CN106399145A - 一株放射性根瘤菌及其发酵产可得然胶的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一株放射性根瘤菌及其产可得然胶的方法，属于生物工程技术领域。具体涉及从土壤中分离并鉴定获得一株产可得然胶的放射性根瘤菌(Rhizobium radiobacter)JNU‑CD01，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号为CGMCC 12099，以及利用该微生物菌株以葡萄糖为原料发酵产可得然胶的方法。该菌株在好氧发酵条件下，以葡萄糖为原料，通过流加廉价无机氮源的策略使可得然胶产量提高两倍以上，达到65.27g/L。因此，本发明发酵产可得然胶的方法具有生产效率高、操作简便以及成本低廉等优点。

Description

一株放射性根瘤菌及其发酵产可得然胶的方法
技术领域
一株放射性根瘤菌及其产可得然胶的方法，属于生物工程技术领域。具体涉及采用从土壤中分离鉴定获得的放射性根瘤菌(Rhizobium radiobacter)CGMCC 12099以葡萄糖为原料发酵产可得然胶的方法。
背景技术
可得然胶是一种由D-葡萄糖以β-1,3糖苷键连接组成的无支链的胞外多聚糖。具有可得然胶能力的菌株主要为粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)，也有少量报道三叶草根瘤菌属(Rhizobium trifolii)、放射土壤杆菌(Agrobacterium radiobacter)等其它菌种也可产生可得然胶。可得然胶不溶于水、乙醇，易溶于碱液，二甲基亚砜，具有独特的热凝性质，当被加热至55℃时，可形成低固型凝胶，继续加热至80℃以上，可以形成有较高强度和弹性的高固型凝胶。由于这一特殊性质，使得可得然胶在食品方面有着极其广泛的应用，可以作为食品增稠剂、结构改良剂应用于果冻、面条、可食用纤维以及新型减肥保健食品。可得然胶是继黄原胶、结冷胶之后第3个被美国FDA批准的由微生物发酵生产的可食用多糖，我国卫生部也于2006年正式批准该凝胶在部分食品中应用。目前，可得然胶的生产工艺主要是微生物发酵，但是存在着生产强度低、分离提取效率低以及产品质量低等问题。
发明内容
本发明的目的是提供了一种微生物发酵生产可得然胶的的菌种和方法，该菌株从土壤中分离鉴定得到，并能够利用葡萄糖为原料发酵生产可得然胶。
以下是本发明技术方案的详细描述。
本发明所采用的菌株是从土壤中筛选获得的，筛选方法为苯胺蓝筛选平板，筛选平板上呈现深蓝色变色圈的菌株，再经过划线分离后，进行液体培养基发酵复筛验证其可得然胶产生能力。
本发明筛选得到的能有效合成可得然胶的微生物JNU-CD01，经16S rRNA的基因测定和基于《伯杰氏细菌鉴定手册》的生理生化鉴定，将该菌鉴定为放射性根瘤菌(Rhizobiumradioobacter)。
微生物菌株的培养与发酵条件：
斜面培养基组成：葡萄糖20-50g/L，酵母膏5-10g/L，蛋白胨5-10g/L，琼脂20g/L，pH调至6.0-7.5；
种子培养基组成：葡萄糖20-100g/L，氮源5-25g/L，KH2PO4 1.5-5g/L，MgSO4 0.25-1g/L，pH调至6.0-7.5。
发酵培养基组成：葡萄糖20-100g/L，氮源1-30g/L，KH2PO4 1.5-5g/L，MgSO4 0.25-1g/L，FeSO4·7H2O0.02-0.1g/L，MnSO4 0.02-0.1g/L，CoCl2·6H2O 0.01-0.1g/L，ZnCl20.01-0.1g/L，pH调至6.0-7.5。
斜面培养基，种子培养基和发酵培养基灭菌温度为115-121℃，15-20min。
将斜面保藏的菌株划线于固体琼脂平板培养基，并在27-35℃下静置培养48-72小时活化。
用接种环将斜面活化后的菌落接入液体种子培养基中，250mL三角瓶装液量10-80mL，500mL三角瓶装液量20-160ml，1L三角瓶装液量20-300ml，培养温度27-35℃，摇床转速90-200r/min，培养时间18-22小时。
按0.5％-10％(v/v)的接种量将培养好的种子液接入发酵培养基，培养温度27-37℃，发酵罐培养搅拌桨转速200-700r/min，通气量0.5-2.5vvm，三角瓶培养90-200r/min，好氧培养2-4天。
发酵过程通过流加氨水或NaOH调控pH5.0-7.5。
发酵过程通过流加方式将葡萄糖浓度控制在5-80g/L。
发酵过程中氮源通过分批次和连续流加方式加入发酵培养基。
本发明的有益效果：本发明从土壤中筛选分离得到一株高产可得然胶的菌株，鉴定为放射性根瘤菌(Rhizobium radioobacter)，保藏号：CGMCC 12099；该菌株以葡萄糖为原料发酵生产可得然胶产量为10-70g/L，所得到的凝胶强度符合食品安全国家标准中对可得然胶的要求，可满足可得然胶的工业生产要求。
本发明的突出优点是采用筛选得到的菌株在发酵过程中通过分批次和连续流加氮源方式使可得然胶的产量和生产强度均提高2-3倍。
以下是放射性根瘤菌(Rhizobium radioobacter)CGMCC 12099的筛选、鉴定及发酵生产可得然胶的实施例。但本发明并不限于所列出的几个实例。
生物材料样品保藏信息：
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期：2016年1月25日；保藏编号CGMCC 12099；分类命名：Rhizobium radioobacter。
具体实施方式
实施例1产可得然胶的菌株的分离鉴定
本发明采用苯胺蓝显色平板来筛选可以产可得然胶的菌株。可得然胶可与苯胺蓝特异性结合并产生深蓝色的颜色反应，因此挑选在苯胺蓝平板上显深蓝色，且菌落较大的菌株进行摇瓶复筛。根据文献中已报道的可得然胶提取方法进行产物提取和初步鉴定，最终从87株候选菌株中筛选到一株高产可得然胶的菌株JNU-CD01，按《伯杰氏细菌鉴定手册》对该菌株进行生理生化特性鉴定(见表1)，并对该菌株的16S rRNA的编码基因进行测序，在NCBI网站进行同源性比对(见表2)。
基于对该菌株JNU-CD01的生理生化性质分析和16S rRNA的编码基因序列比对，鉴定为放射性根瘤菌(Rhizobium radioobacter)，现保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号：CGMCC 12099。
表1 菌株JNU-CD01的生理生化特性鉴定
注：+：反应阳性，-：反应阴性
表2 菌株JNU-CD01的16S rRNA的基因编码序列在NCBI数据库的同源性比对
实施例2不同葡萄糖浓度对摇瓶发酵产可得然胶的影响
将活化后的放射性根瘤菌CGMCC 12099种子液以10％(v/v)的接种量接入装有不同葡萄糖浓度发酵培养基的500mL三角瓶中，发酵培养基组成：葡萄糖20-100g/L，氮源1-30g/L，KH2PO4 1.5-5g/L，MgSO40.25-1g/L，FeSO4·7H2O 0.02-0.1g/L，MnSO4 0.02-0.1g/L，CoCl2·6H2O 0.01-0.1g/L，ZnCl2 0.01-0.1g/L，pH调至6.0-7.5。500mL三角瓶装液量50ml，培养温度25-37℃，摇床转速120r/min，培养时间60小时，不同葡萄糖浓度下发酵产可得然胶的数据见表3。
表3 放射性根瘤菌CGMCC 12099在不同葡萄糖浓度下摇瓶发酵产可得然胶
实施例3不同葡萄糖浓度对5-L发酵罐中分批发酵产可得然胶的影响
将活化后的放射性根瘤菌CGMCC 12099种子液以10％(v/v)的接种量接入装有3L发酵培养基的5-L发酵罐中，初始葡萄糖浓度80g/L，发酵温度27-32℃，通空气量0.5-2.5vvm，发酵罐搅拌转速200-700r/min，NaOH控制发酵液pH5.0-7.5，发酵时间72h，发酵结果见表4。
表4 放射性根瘤菌CGMCC 12099在5-L发酵罐分批发酵产可得然胶
实施例4 5-L发酵罐中补料(葡萄糖)分批发酵产可得然胶
将活化后的放射性根瘤菌CGMCC 12099种子液以10％(v/v)的接种量接入装有3L发酵培养基的5-L发酵罐中，初始葡萄糖浓度50g/L，发酵温度27-32℃，通空气量0.5-2.5vvm，发酵罐搅拌转速200-700r/min，NaOH控制发酵液pH 5.0-7.5，发酵过程中补料流加葡萄糖，葡萄糖浓度控制在5-50g/L，葡萄糖添加量折算最终发酵液体积160g/L，发酵时间120h，发酵结果见表5。
表5 放射性根瘤菌CGMCC 12099在5-L发酵罐中补料(葡萄糖)分批发酵产可得然胶
实施例5两次添加氮源(NH4)2HPO4对5-L发酵罐中分批发酵产可得然胶的影响
将活化后的放射性根瘤菌CGMCC 12099种子液以10％(v/v)的接种量接入装有3L发酵培养基的5-L发酵罐中，初始葡萄糖浓度50g/L，发酵温度27-32℃，通空气量0.5-2.5vvm，发酵罐搅拌转速200-700r/min，NaOH控制发酵液pH 5.0-7.5，发酵过程中控制葡萄糖浓度在5-50g/L，葡萄糖添加量折算最终发酵液体积170g/L，发酵过程中在32h，60h分别补加(NH4)2HPO4浓度3g/L和2g/L，发酵时间120h，发酵结果见表5。
表5 采用两次添加氮源策略在5-L发酵罐中分批发酵产可得然胶
实施例6流加氮源(NH4)2HPO4对5-L发酵罐中分批发酵产可得然胶的影响
将活化后的放射性根瘤菌CGMCC 12099种子液以10％(v/v)的接种量接入装有3L发酵培养基的5-L发酵罐中，初始葡萄糖浓度50g/L，发酵温度27-32℃，通空气量0.5-2.5vvm，发酵罐搅拌转速200-700r/min，NaOH控制发酵液pH 5.0-7.5，发酵过程中控制葡萄糖浓度在5-50g/L，葡萄糖添加量折算最终发酵液体积160g/L，发酵过程中35h到44h连续流加(NH4)2HPO4，合计加入(NH4)2HPO4浓度5.5g/L，发酵时间120h，发酵结果见表6。
表6 采用流加氮源策略在5-L发酵罐中分批发酵产可得然胶

Claims (5)

1.一种发酵产可得然胶的微生物菌株，其分类属根瘤菌科根瘤菌属的放射性根瘤菌(Rhizobium radiobacter)菌株JNU-CD01，所述菌株的保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号为CGMCC 12099。
2.一种微生物发酵生产可得然胶的方法，其特征是：
菌种为权利要求1所述的放射性根瘤菌(Rhizobium radiobacter)CGMCC 12099。
种子培养基组成：葡萄糖20-100g/L，氮源5-25g/L，KH2PO4 1.5-5g/L，MgSO4 0.25-1g/L，pH调至6.0-7.5。
发酵培养基组成：葡萄糖20-100g/L，氮源1-30g/L，KH2PO4 1.5-5g/L，MgSO4 0.25-1g/L，FeSO4·7H2O 0.02-0.1g/L，MnSO4 0.02-0.1g/L，CoCl2·6H2O 0.01-0.1g/L，ZnCl2 0.01-0.1g/L，pH调至6.0-7.5。
发酵培养：按0.5％-10％(v/v)的接种量将种子液接入发酵培养基，培养温度25-37℃，通气比0.5-2vvm，搅拌转速100-700r/min，好氧培养2-3天。
发酵过程用氨水或NaOH维持发酵液pH 5.0-7.5。
3.根据权利要求2中所述方法，其特征是：氮源包括酵母膏，蛋白胨，牛肉膏，尿素，(NH4)3PO4，(NH4)2HPO4，NH4H2PO4，(NH4)2SO4，NH4Cl，NH4NO3，(NH4)2CO3，NH4HCO3。
4.根据权利要求2中所述方法，其特征是：葡萄糖为一次性加入或补料添加。
5.根据权利要求2中所述方法，其特征是：氮源为连续流加或分次补料添加。
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