CN103444981A

CN103444981A - 米曲霉降解食用药用真菌菌渣生产蛋白饲料的方法

Info

Publication number: CN103444981A
Application number: CN2012101697682A
Authority: CN
Inventors: 张志才; 陈钧; 任晓锋; 黄达明
Original assignee: Jiangsu University
Current assignee: Dongtai Haibin Science And Technology Pioneer Park Management Co ltd; Jiangsu Huizhi Intellectual Property Services Co ltd
Priority date: 2012-05-29
Filing date: 2012-05-29
Publication date: 2013-12-18
Anticipated expiration: 2032-05-29
Also published as: CN103444981B

Abstract

本发明米曲霉降解食用药用真菌菌渣生产蛋白饲料的方法，涉及生物工程领域。涉及利用秸秆为主要原料，通过米曲霉（Aspergillus oryzae）发酵，生产蛋白饲料的方法，其生产工艺流程是秸秆经过粉碎、预湿等预处理工艺，米曲霉经过液体摇瓶培养、一级种子培养、与秸秆混合进行固态发酵，得到发酵秸秆的蛋白饲料。此发酵工艺简便，不会对环境造成污染，也不会对资源造成浪费。采用此方法制得的饲料蛋白质含量15～30%，木质素降解率为34～76%，饲料得率45～60%。饲料由于米曲霉的作用降解木质素、纤维素，因而提高了秸秆的利用率。

Description

米曲霉降解食用药用真菌菌渣生产蛋白饲料的方法

技术领域

本发明涉及生物工程领域，特指未经高温、高压处理的食用药用真菌菌渣通过米曲霉降解菌渣中的木质素、纤维素，生产蛋白饲料的工艺流程。

背景技术

菌渣即食用菌废料又被称作菌糠、下脚料，是栽培食用菌后的培养料。随着食用菌产业的发展，菌渣的数量急剧增加，据中国食用菌协会的统计，2008年的食用菌产量1830万吨，菌渣4570万吨，福建省2009年食用菌产量196.9752 万吨，菌渣492.438万吨。

随着食用菌栽培技术的普及，食用菌种植面积迅速扩大，品种不断增多。食用菌集中规模化生产，采摘后蘑菇渣大量积累，已成为不容忽视的环境问题。菌渣中含有糖类、有机酸、酶和生物活性物质，含有丰富的蛋白质及其他营养成分（见下表），在农业生产上具有较高的潜在利用价值。利用食用菌菌渣废料，可提高经济效益，减少对环境的污染，实现废物循环利用和农业的可持续发展。

表：各种菌渣的营养价值

米曲霉能分泌多种酶类如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、果胶酶、植酸酶、糖化酶等，因此该菌在现代工业中的应用领域不断扩展。Tejomyee S. B.等人从被久效磷污染的土壤中分离得到米曲霉，研究其对农药久效磷的生物降解作用，研究结果表明在较短时间里米曲霉对久效磷降解的高效性。Truong Q.T.等人研究了用米曲霉处理含有高浓度悬浮体的木薯淀粉加工废水中的情况，通过改变多种影响米曲霉生长的因素来提高其对废水的降解效率，其降解率可高达90%。Xiang J.M.等人从烟叶中分离得到了能降解尼古丁的米曲霉，研究利用米曲霉的静息细胞分析对尼古丁的降解途径。通过对降解过程中间产物的分析，最终确定了利用真菌降解尼古丁的新途径。Parshetti G.K.等人研究了米曲霉NCIM-1146对活性蓝-25的生物降解作用。研究发现活性蓝的脱色是通过真菌的吸收然后才被降解的，在摇床培养条件下比静置培养具有较快的吸收和脱色。添加葡萄糖后提高了米曲霉对活性蓝的降解。由此可见米曲霉具有降解较难降解有机物的能力。

发明内容

本发明人经过深入的研究，摸索出一种以食用药用真菌的菌渣为主要原料，通过米曲霉菌体固体培养降解菌渣中的木质素、纤维素，生产蛋白饲料的工艺。该工艺不同于过去的方法在于所使用的菌种是被美国食品药物管理局(FDA)和美国饲料公定协会(AAFCO)、我国农业部认定的可以直接饲喂动物的饲料级微生物添加剂的米曲霉菌种，采用菌渣作为主要原料，通过固态发酵获得蛋白饲料。

本发明目的是提供了一种以米曲霉为菌种，以使用药用真菌菌渣为原料进行固态发酵的生产蛋白饲料的工艺，以米曲霉为出发菌株，进行试管扩大培养、液体摇瓶培养、一级种子培养和固体发酵培养，得到降解菌渣的蛋白饲料。

本发明所用的菌种是米曲霉任何一种菌种，如中国普通微生物菌种保藏管理中心（CCGMC）、中国农业微生物菌种保藏管理中心(ACCC)、中国工业微生物菌种保藏管理中心 (CICC)、中国医学微生物菌种保藏管理中心(CMCC)、国家兽医微生物菌种保藏中心 (CVCC)和抗生素菌种保藏管理中心等等保藏的菌种。

本发明所使用的原料是任意一种食用药用真菌菌渣，平菇、香菇、草菇、灵芝、猴头、鸡腿菇、蘑菇、杏鲍菇、金针菇、凤尾菇等等人工栽培的食用药用真菌菌渣。

具体的，本发明所述的发酵工艺中，其试管扩大培养基为马铃薯蔗糖培养基

本发明所述的发酵工艺中,其液体摇瓶培养基和一级种子培养基均为（克/升）：葡萄糖5～30，酒石酸铵0.1～5，苯甲醇0.2～3，硫酸镁0.2～1，吐温80 0.5～10，磷酸二氢钾2～9，邻苯二甲酸3～18， pH 5～8，120～140℃灭菌20～40分钟；

其中所述的摇瓶培养工艺条件为，接种一环米曲霉试管斜面孢子于装有16～48%（体积比）培养基的三角瓶中，在转速：150转/分，25～35℃，培养24～72小时；其中所述的一级种子培养工艺为，按1～20%（体积比）的接种量将摇瓶培养种子液接种到一级种子培养基中，在温度25～35℃，搅拌转速50～200转/分，通气量0.2～2：1体积/体积/每分钟（通气气体体积/发酵液体积/每分钟），培养18～72小时；

本发明所述的固体发酵培养基组成为：菌渣10千克，水20～60千克，尿素0.05～0.2千克；硫酸铜5～15克，硫酸亚铁5～15克，硫酸锰5～20克，该培养基各成分可以按同等比例放大；

其中所述的固体发酵培养工艺为：按2～20%（种子液体积/发酵培养基重量），培养料厚度为0.1～0.4米，料宽0.5～2米，长度不限，通气量为0.3～1.5：1（气体体积/发酵培养基重量）/每分钟，培养时间为3天～23天，中途翻料1～2次。

在本发明所述的发酵工艺中，在进行摇瓶培养之前，首先将米曲霉菌种接入新配置的马铃薯蔗糖培养基中进行培养，培养温度25～35℃，培养时间48～144小时；4～10℃保存备用。

由本发明获得菌渣发酵物含有大量的黄色米曲霉孢子，发酵物色质米黄色至褐色，具有酒香味，蛋白质含量25～50%，饲料得率50～60%。

根据本发明所述的发酵培养工艺，结合本领域的基本知识，可以根据生产需要，增加二级、三级甚至四级种子罐，进一步扩大固态发酵生产规模，以进行工业化生产。二级、三级甚至四级种子罐采用的培养基与摇瓶培养基和一级种子培养基相同，接种量为5～20%，培养条件同于一级种子培养。

采用此工艺的优点采用固态发酵，并且不经高温高压处理，这样不会给环境造成污染，也不会浪费资源。

附图说明

图1是本发明米曲霉降解食用药用真菌菌渣生产蛋白饲料的方法的工艺流程图。

具体实施方式

根据此工艺采用的蛋白质测定采用南京建成生物工程公司生产的考马斯亮兰试剂盒测定。准确称取1克蛋白饲料，溶于50mL水中，室温振荡2小时，抽滤，滤液定容至50mL，即为样品液，用于蛋白质测定。测定操作步骤按试剂盒说明书进行。蛋白质含量按下列公式计算

为了进一步阐述本发明的技术方案所涉及的材料及工艺，给出了以下实施例，但是这些实施例不以任何形式限制本发明的范围。

实施例1

1、试管斜面菌种的制作

在新配置的马铃薯蔗糖培养基（诸葛健、王正祥主编的“工业微生物实验技术手册”，1994，367页）中接入一环米曲霉菌种（Aspergillus oryzae），26℃，培养时间50小时；4℃保存备用。

2、液体摇瓶培养菌种的制作

精确称取葡萄糖5克，酒石酸铵0.1克，苯甲醇0.2克，硫酸镁0.2克，吐温80 0.5克，磷酸二氢钾2克，邻苯二甲酸缓冲液3克，水1000 mL, pH 5，分装250mL三角瓶，每瓶50克，共20瓶，120 ℃灭菌 40分钟；冷却后，每瓶接入一环4℃保存的米曲霉菌种，在25℃，150转/分，培养 72小时；

3、一级液体菌种的制作

精确称取葡萄糖50克，酒石酸铵1克，苯甲醇2克，硫酸镁2克，吐温80 5克，磷酸二氢钾20克，邻苯二甲酸30克，水10L，装于15L的种子罐中，120℃灭菌20分钟；灭菌冷却后，按20%的接种量接入液体摇瓶菌种，在温度25 ℃，搅拌转速50 转/分，通气量0.2 ：1体积/体积/每分钟（通气气体体积/发酵液体积/每分钟），培养 72小时；

4、固体发酵蛋白饲料

杏鲍菇菌渣粉碎，称取该菌渣粉750千克，水1500 千克，尿素3.75 千克；硫酸铜375 克，硫酸亚铁375 克，硫酸锰375 克，充分拌匀，按体积比为20%的比例接入上述一级种子培养液，混合均匀，制成培养料厚度为0.1米，料宽0.5米，长度37.5米的料堆，控制温度25 ℃培养 23天，中途翻料 2次，，培养结束后发酵物烘干，粉碎即为蛋白饲料。

获得蛋白饲料含有大量的黄色米曲霉孢子，饲料呈桔黄色，有酒香味。蛋白质含量26.3%，饲料得率为52.1%。

实施例2

1、试管斜面菌种的制作

在新配置的马铃薯蔗糖培养基（诸葛健、王正祥主编的“工业微生物实验技术手册”，1994，367页）中接入一环米曲霉菌种（Aspergillus oryzae），30℃，培养时间100小时；7℃保存备用。

2、液体摇瓶培养菌种的制作

精确称取葡萄糖150克，酒石酸铵250克，苯甲醇15克，硫酸镁0.4克，吐温80 4克，磷酸二氢钾5克，邻苯二甲酸缓冲20克，水10 L, pH 6，分装250mL三角瓶，每瓶100克，共100瓶，130℃灭菌30分钟；冷却后，每瓶接入一环7℃保存的米曲霉菌种，在30℃，150转/分，培养50小时；

3、一级液体菌种的制作

精确称取葡萄糖2000克，酒石酸铵200克，苯甲醇150克，硫酸镁60克，吐温80 60克，磷酸二氢钾400克，邻苯二甲酸1000克，水100L，装于130L的种子罐中，130℃灭菌30分钟；冷却后，按10%的接种量接入上述液体摇瓶菌种，在温度30℃，搅拌转速125转/分，通气量1：1体积/体积/每分钟（通气气体体积/发酵液体积/每分钟），培养50小时；

4、固体发酵蛋白饲料

香菇菌渣粉碎，称取该菌渣粉1000千克，水3000千克，尿素10千克，硫酸铜600克，硫酸亚铁600克，硫酸锰1000克，充分拌匀，按体积比为10%的比例接入上述一级种子培养液，混合均匀，制成培养料厚度为0.2米，料宽1米，长度225米的料堆，控制温度30℃培养15天，中途翻料2次，培养结束后发酵物烘干，粉碎即为蛋白饲料。

获得蛋白饲料含有大量的黄色米曲霉孢子，发酵物黄褐色，有酒香味。蛋白质含量39.2%，饲料得率为59.2%。

实施例3

1、试管斜面菌种的制作

在新配置的马铃薯蔗糖培养基（诸葛健、王正祥主编的“工业微生物实验技术手册”，1994，367页）中接入一环米曲霉菌种（Aspergillus oryzae），35℃，培养时间144小时；10℃保存备用。

2、液体摇瓶培养菌种的制作

精确称取葡萄糖300克，酒石酸铵50克，苯甲醇30克，硫酸镁10克，吐温80 100克，磷酸二氢钾90克，邻苯二甲酸缓冲液180克，水10L, pH7.5，分装250mL三角瓶，每瓶120 mL，共80瓶， 140℃灭菌20分钟；冷却后，每瓶接入一环10℃保存的米曲霉菌种，在35℃，150转/分，培养72小时；

3、一级液体菌种的制作

精确称取葡萄糖1500克，酒石酸铵250克，苯甲醇150克，硫酸镁50克，吐温80 500克，磷酸二氢钾450克，邻苯二甲酸缓冲液900克，水50L，装于70L的一级种子罐中， 140℃灭菌40分钟；灭菌冷却后，按5%的接种量接入上述液体摇瓶菌种在温度35℃，搅拌转速200转/分，通气量2：1体积/体积/每分钟（通气气体体积/发酵液体积/每分钟），培养72小时；

4、二级液体菌种的制作

精确称取葡萄糖15000克，酒石酸铵2500克，苯甲醇1500克，硫酸镁500克，吐温80 5000克，磷酸二氢钾4500克，邻苯二甲酸缓冲液9000克，水500L，装于700L的一级种子罐中， 140℃灭菌40分钟；灭菌冷却后，按5%的接种量接入上述液体摇瓶菌种，在温度35℃，搅拌转速200转/分，通气量2：1体积/体积/每分钟（通气气体体积/发酵液体积/每分钟），培养18小时；

5、固体发酵蛋白饲料

猴头菇菌渣粉碎，过100目筛，称取该菌渣粉3500千克，水21000千克，尿素52.5千克；硫酸铜5000克，硫酸亚铁5000克，硫酸锰6000克，充分拌匀，按体积比为5%的接种量接入上述二级种子培养液，混合均匀，制成培养料厚度为0.3米，料宽2米，长度300米的料堆，控制温度35℃培养6天，中途翻料1次，培养结束后发酵物烘干，粉碎即为蛋白饲料。

获得的菌渣发酵蛋白饲料含有大量的黄色米曲霉孢子，发酵物褐色，有酒香味，蛋白质含量为48.7%，饲料得率为53.6%。

Claims

1.米曲霉降解食用药用真菌菌渣生产蛋白饲料的方法，其特征在于按照下述步骤进行：以使用药用真菌菌渣为原料进行固态发酵的生产蛋白饲料的工艺，以米曲霉为出发菌株，进行试管扩大培养、液体摇瓶培养、一级种子培养和固体发酵培养，得到降解菌渣的蛋白饲料。

2. 根据权利要求1所述的米曲霉降解食用药用真菌菌渣生产蛋白饲料的方法，其特征在于所用的菌种是米曲霉任何一种菌种，如中国普通微生物菌种保藏管理中心（CCGMC）、中国农业微生物菌种保藏管理中心(ACCC)、中国工业微生物菌种保藏管理中心 (CICC)、中国医学微生物菌种保藏管理中心(CMCC)、国家兽医微生物菌种保藏中心 (CVCC)和抗生素菌种保藏管理中心等等保藏的菌种。

3.根据权利要求1所述的米曲霉降解食用药用真菌菌渣生产蛋白饲料的方法，其特征在于所使用的原料是任意一种食用药用真菌菌渣，平菇、香菇、草菇、灵芝、猴头、鸡腿菇、蘑菇、杏鲍菇、金针菇、凤尾菇等等人工栽培的食用药用真菌菌渣。

4.根据权利要求1所述的米曲霉降解食用药用真菌菌渣生产蛋白饲料的方法，其特征在于所述的发酵工艺中，其试管扩大培养基为马铃薯蔗糖培养基。

5.根据权利要求1所述的米曲霉降解食用药用真菌菌渣生产蛋白饲料的方法，其特征在于本发明所述的发酵工艺中,其液体摇瓶培养基和一级种子培养基均为克/升：葡萄糖5～30，酒石酸铵0.1～5，苯甲醇0.2～3，硫酸镁0.2～1，吐温80 0.5～10，磷酸二氢钾2～9，邻苯二甲酸3～18， pH 5～8，120～140℃灭菌20～40分钟。

6.根据权利要求1所述的米曲霉降解食用药用真菌菌渣生产蛋白饲料的方法，其特征在于其中所述的摇瓶培养工艺条件为，接种一环米曲霉试管斜面孢子于装有体积比16～48%培养基的三角瓶中，在转速：150转/分，25～35℃，培养24～72小时；其中所述的一级种子培养工艺为，按1～20%（体积比）的接种量将摇瓶培养种子液接种到一级种子培养基中，在温度25～35℃，搅拌转速50～200转/分，通气量0.2～2：1体积/体积/每分钟（通气气体体积/发酵液体积/每分钟），培养18～72小时。

7.根据权利要求1所述的米曲霉降解食用药用真菌菌渣生产蛋白饲料的方法，其特征在于所述的固体发酵培养基组成为：菌渣10千克，水20～60千克，尿素0.05～0.2千克；硫酸铜5～15克，硫酸亚铁5～15克，硫酸锰5～20克，该培养基各成分可以按同等比例放大。

8.根据权利要求1所述的米曲霉降解食用药用真菌菌渣生产蛋白饲料的方法，其特征在于其中所述的固体发酵培养工艺为：按2～20%（种子液体积/发酵培养基重量），培养料厚度为0.1～0.4米，料宽0.5～2米，长度不限，通气量为0.3～1.5：1（气体体积/发酵培养基重量）/每分钟，培养时间为3天～23天，中途翻料1～2次。

9.根据权利要求1所述的米曲霉降解食用药用真菌菌渣生产蛋白饲料的方法，其特征在于所述的发酵工艺中，在进行摇瓶培养之前，首先将米曲霉菌种接入新配置的马铃薯蔗糖培养基中进行培养，培养温度25～35℃，培养时间48～144小时；4～10℃保存备用。