CN105315024A - 一种生产有机肥的复合菌系的筛选方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种生产有机肥的复合菌系的筛选方法，该方法是首先从腐熟有机肥或动物粪便中采集样品，再将样品利用不同培养基分离出菌种，通过滤纸崩溃试验和透明圈实验，筛选出产酶效果较好的优势菌株，再将优势菌株进行鉴定、纯化、富集培养，在获得优势菌株的基础上进行拮抗试验，通过对菌株组合活力的分析，得到优化组合的机肥复合菌系。本发明的有机肥复合菌系具有很好的兼容性，且产酶能力明显高于单一菌株，其纤维素酶、蛋白酶和淀粉酶的活性达到了193.5、25.3和55.7（U/ml）。因此，本发明获得复合菌系能够高效降解秸秆、动物粪便等农业废弃物而得到有机肥料，既可以清洁环境，又可以加工成生物有机肥料，实现农业的可持续发展。
Description
技术领域
本发明涉及一种生产有机肥的复合菌系的筛选方法，属于农业微生物技术领域。
背景技术
随着我国农业和农业加工业的集约化发展，大量农业固体有机废弃物资源被肆意浪费，如水稻、小麦、玉米、油菜等作物秸秆就地焚烧，规模化养殖后的畜禽粪便和加工业的下脚料等随地弃置，这不仅造成严重的环境污染，而且造成大量的养分资源(C、N、P、K、S及微量元素)流失。自20世纪90年代中期以来，农业有机废弃物的处置问题已成为我国广大农村生态环境所面临的严峻问题。农业废弃物资源化处理对于缓解资源不足、减少环境污染、拓展农业的外部功能和提高农业的综合效益具有重要意义，如果得以充分利用，不仅能维持和不断提高土壤肥力，从而达到农业可持续发展，也使农业生态系统中各种养分资源循环起到再利用和净化环境等作用。土壤施入有机肥后，有机质增加，可促进土壤微团聚体数量的增加，改善土壤的物理性质。以传统有机肥料为物质基础的传统农业，是一种封闭的循环，不从农业以外投入新的物质和能量，不能保证大面积平衡增产和持续的高产稳产。
随着无公害食品、绿色食品和有机食品的迅猛发展，利用农业废弃物生产精制商品有机肥料已成为有机肥料的发展方向。在处理农业废弃物资源，特别是畜禽粪便过程中，缩短其无害化、资源化处理的时间，提高堆肥质量是至关重要的技术环节。因此筛选和分离农业废弃物发酵复合菌，研究其产酶特性，对减轻农业废弃物给环境的压力和开发这些资源具有重要的意义。国内外已有大量研究表明，分离筛选出具有降解能力强的微生物对于解决农业废弃物资源利用具有很好的应用前景，而目前的研究主要集中在单一菌株降解的研究，然而单一菌株产酶量小，降解率低，不易推广。而且农业废弃秸秆主要是由纤维素、蛋白质和糖类等大分子物质组成，很多学者偏重于对单一种类降解的研究，这样往往使秸秆的降解不彻底。因此筛选出高效降解废弃秸秆复合菌株具有重要现实意义。
发明内容
本发明的目的在于：提供一种生产有机肥的复合菌系的筛选方法，该方法筛选出的复合菌系产酶量大、菌种之间协同性好、具有高效的降解能力。
本发明的技术方案：一种生产有机肥的复合菌系的筛选方法包括以下步骤：
a、初选菌种：将腐熟有机肥样品或动物粪便样品放入含有增殖培养基的三角瓶中，在30℃、200转/min条件下培养3~5d，然后分别稀释涂布于17份分离筛选培养基上，再从17份分离筛选培养基中分离纯化152株菌，将每株菌分别接种于装有滤纸条培养基的试管中，经过7d的30℃恒温培养，测定滤纸条溃烂程度，选取透明圈/菌落直径比值最大且滤纸崩溃程度最大的菌株8株进行扩繁；其中，分离筛选培养基为现有的用于菌种分离筛选的培养基，它是根据微生物利用碳源的特点，可选定蛋白质、淀粉及纤维素为唯一碳源的培养基，那么只有利用这些碳源的微生物才能大量正常生长，而其他微生物就可能死亡或淘汰。
b、复选菌种：将初选得到的8个菌株接入滤纸条培养基上，并30℃温度下培养3d，然后采用Folin试剂显色法测定蛋白酶、采用次亚碘酸法测定淀粉酶以及采用3，5—二硝基水杨酸显色法测定纤维素酶，根据三种酶的测定结果，选取产酶能力最强的3株菌株；
c、确定优势菌株组合：将步骤（b）得到3株菌株两两组合分别放在pH为6~6.5、温度为30℃~35℃、接种量为3%的PDA平板上进行培养，3d后选取生长良好且没有产生抑制作用的一组菌株组合，作为有机肥复合菌系。
前述的增殖培养基为液体发酵培养基：它是由KH2PO42.0g/L、Mg2SO40.3g/L、CaCl0.3g/L、FeSO4.7H2O0.005g/L、ZnSO4·7H2O0.0014g/L、MnSO4·4H2O0.0016g／L及CoCl20.002g/L组成的溶液，其pH值为5.5，并在该溶液中每100mL加5g秸秆粉。
前述的秸秆粉为玉米杆粉、稻杆粉及油菜杆均匀混合而成，按质量分数计算玉米杆粉：稻杆粉：油菜杆粉的比例为1:1:1。
前述的滤纸条培养基为浸润有培养液的滤纸条，所述的培养液由lg的（NH）2SO4、lg的KH2PO4、0.5g的MgSO4·7H2O及0.1g的酵母浸膏溶解在1000mL的蒸馏水制得。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明通过对腐熟有机肥样品或动物粪便样品进行分离筛选，并配制高效菌株组合，从而得到有机肥复合菌系，该有机肥复合菌系具有很好的兼容性，且产酶能力明显高于单一菌株，其纤维素酶、蛋白酶和淀粉酶的活性达到了193.5、25.3和55.7（U/ml）。因此，本发明获得复合菌系能够高效降解秸秆、动物粪便等农业废弃物而得到有机肥料，既可以清洁环境，又可以加工成生物有机肥料。将加工后生物有机肥料应用于农业生产中，可提高农作物产量、改善农产品品质、生产出优质的农产品，并可增进地力、培肥土壤、实现农业的可持续发展。
附图说明
图1为本发明的实施流程图；
图2为本发明的复合菌系与单一菌株的产酶能力比较图；
图3为培养时间对复合菌系的生长及产酶的影响关系图；
图4为培养温度对复合菌系的生长及产酶的影响关系图；
图5为pH对复合菌系的生长及产酶的影响关系图；
图6为接种量对复合菌系的生长及产酶的影响关系图。
具体实施方式
为了使本发明目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例
参见图1，本发明一种生产有机肥的复合菌系的筛选方法，包括以下步骤：
a、初选菌种：将腐熟有机肥样品或动物粪便样品放入含有增殖培养基的三角瓶中，在30℃、200转/min条件下培养3~5d（即培养3～5天），然后分别稀释涂布于17份分离筛选培养基上，再从17份分离筛选培养基中分离纯化152株菌，将每株菌分别接种于装有滤纸条培养基的试管中，经过7d的30℃恒温培养，测定滤纸条溃烂程度，选取透明圈/菌落直径比值最大且滤纸崩溃程度最大的菌株8株进行扩繁；参见表1，H、C的比值（透明圈直径H和菌落直径C之比）可作为判断单位菌株分泌降解酶能力的高低。比值越大，说明单位菌种可能产生的酶作用能力越强。
表1所筛菌株菌落直径、透明圈直径及滤纸崩溃程度
注：“＋”表示产生崩溃，“＋＋”表示多处崩溃，“＋＋＋”表示完全崩溃。
b、复选菌种：将初选得到的8个菌株接入滤纸条培养基上，并30℃温度下培养3d，然后采用Folin试剂显色法测定蛋白酶、采用次亚碘酸法测定淀粉酶以及采用3，5—二硝基水杨酸显色法测定纤维素酶；结果见表2，从中我们可以看出：对于纤维度酶，菌株MA6的产酶量最大，即酶活力最高，HA4次之，但显著高于其他菌株；菌株HA7和SA2之间的酶活力无显著差异。8个菌株的纤维素酶活力大小比较为：MA6＞HA4＞HA7＞SA2＞MA7＞MB13＞SB10＞MB9，结合差异显著性可知：MA6、HA4、HA7和SA2菌株的纤维素酶活力较好。对于蛋白酶，HA4的酶活力最高，SA2次之，但两种菌株的酶活力无显著差异。8种菌种的纤维素酶活力大小比较为：HA7＞SA2＞HA4＞MA6＞MB13＞MA7＞SB10＞MB9，结合差异显著性可知：HA4和SA2菌株的纤维素酶活力较好。对于淀粉酶，SA2和HA4的酶活力显著高于其他菌株。综合三种酶活力的分析结果，选取产酶能力最强的3株菌株，即HA4、SA2和MA6菌株；
表2所筛菌种的酶活力（U/ml）
| 菌株编号 | 纤维素酶 | 蛋白酶 | 淀粉酶 |
| SA2 | 159.27 b | 19.20 a | 45.23 a |
| SB10 | 112.35 c | 7.23 d | 13.16 e |
| MA6 | 192.93 a | 13.25 b | 20.19 c |
| MA7 | 122.79 c | 10.08 c | 15.34 d |
| MB9 | 78.65 d | 3.44 e | 11.57 e |
| MB13 | 116.15 c | 12.91 b | 12.37 e |
| HA7 | 184.13 ab | 15.63 b | 17.63 cd |
| HA4 | 172.74 b | 21.56 a | 36.93 b |
在30℃下菌株SA2、MA6在PDA平板培养基上生长旺盛，菌丝较发达，有孢子，菌落外围为白色。菌株SA2菌落内部为绿色孢子，而菌株MA6菌落中间有白色菌丝，菌丝长3.15-10.45nm，有分枝。结合产孢结构测量结果，鉴定菌株SA2、MA6均为绿色木霉(TrichodermaviridePers.)。菌株HA4在平板培养基上菌落呈圆形，边缘平整有白色菌丝，表面粗糙，呈灰绿色，布满一层分生孢子粉，菌落背面棕色，结合产孢结构测量结果，鉴定菌株HA4为斜卧青霉(PenicilliumdecumbensThom）。
c、确定优势菌株组合：将步骤（b）得到3株菌株两两组合分别放在pH为6~6.5、温度为30℃~35℃、接种量为3%的PDA平板上进行培养，3d后观察PDA平板上每组菌株的生长情况：菌株SA2占据了大部分平板，而菌株MA6生长缓慢，说明SA2生长优势比MA6明显，前者对后者产生了竞争抑制作用；而SA2和HA4可以在同一个PDA平板上都生长良好，并没有产生抑制作用，因此，选取SA2+HA4作为有机肥复合菌系。下面分别对有机肥复合菌系的最适培养时间、最适温度、最适pH值及最适接种量进行测试：
（1）最适培养时间：将复合菌系SA2+HA4接种于液体发酵培养基中，30℃下摇床震荡（125r/min)培养，每天取样测定OD620和发酵液中纤维素酶活力、蛋白酶活力、淀粉酶活力，结果见图3，复合菌系SA2+HA4经过4天的增值生长后进入稳定期，在第4天左右复合菌系浓度处于最大值；复合菌系产酶情况：三种酶活变化曲线与菌系生长曲线基本一致，淀粉酶活力在第3天达到最大值，纤维素酶和蛋白酶活力在第4天达到最大值，这说明复合菌系对淀粉的分解能力强于纤维素和蛋白质，先利用淀粉作为能源物质达到快速迅速繁殖目的，再对纤维素和蛋白质等进行分解。
（2）最适温度：将复合菌系SA2+HA4接种在液体培养基于不同温度下（20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃）摇床震荡（125r/min)培养3天测定OD620和发酵液中纤维素酶活力、蛋白酶活力、淀粉酶活力，结果见图2-4。由图4，复合菌系SA2+HA4产纤维素、蛋白酶和淀粉酶的最适温度在30℃~35℃之间。3种酶活力的变化与复合菌的生长曲线有很好的一致性，温度过高或过低都不利于酶解反应的进行。
（3）最适pH值：采用不同初始pH（5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.0)的液体培养基培养3d，测定OD620和发酵液中纤维素酶活力、蛋白酶活力、淀粉酶活力，结果如图5所示，复合菌系SA2+HA4产酶的最适pH在6～6.5之间。这也是复合菌生长最适宜的pH，说明微生物的生长与酶活具有很好的相关性。
（4）最适接种量：将复合菌系SA2+HA4（活菌浓度2.0×106cfu·mL-1）分别按不同接种量（1%、2%、3%、4%、5%、6%）摇床震荡（125r/min)培养3天测定OD620和发酵液中纤维素酶活力、蛋白酶活力、淀粉酶活力，结果见图6，酶活力随着接种量的增加成先上升后下降的趋势，接种量在3%时，三种酶活力最大。原因是接种量过低菌体繁殖慢，产酶量低；接种量过高，菌株之间存在竞争抑制作用，从而使产酶量降低。
通过对复合菌系的产酶条件的分析可知，复合菌系SA2+HA4在pH为5、温度为30℃、接种量为3%培养3d产酶最优。在上述条件下比较单一菌株SA2、MA6、HA4和复合菌系的产酶能力，如图2所示：复合菌系SA2+HA4的产酶能力明显高于单一菌株，纤维素酶、蛋白酶和淀粉酶的活性达到了193.5、25.3和55.7（U/ml）。对于纤维素酶，复合菌系的产酶量最大，MA6次之，两者之间差异不显著，但都显著高于SA2和HA4；对于蛋白酶，复合菌系SA2+HA4与单一菌株之间的差异都达到了显著水平，4种组合的蛋白酶活力大小比较为：SA2+HA4＞HA4＞SA2＞MA6，其中SH2和HA4之间差异不显著；对于淀粉酶，复合菌系SA2+HA4也是显著高于单一菌株，4种组合的淀粉酶活力大小比较为：SA2+HA4＞SA2＞HA4＞MA6，处理之间都达到了显著水平。由以上分析可知，在同等条件下复合菌系SA2+HA4的的产酶能力明显优于单一菌株，表明菌株SA2和HA4的混合培养对产酶体系之间具有较好的协同效应。
Claims (4)
1.一种生产有机肥的复合菌系的筛选方法，其特征在于包括以下步骤：
初选菌种：将腐熟有机肥样品或动物粪便样品放入含有增殖培养基的三角瓶中，在30℃、200转/min条件下培养3~5d，然后分别稀释涂布于17份分离筛选培养基上，再从17份分离筛选培养基中分离纯化152株菌，将每株菌分别接种于装有滤纸条培养基的试管中，经过7d的30℃恒温培养，测定滤纸条溃烂程度，选取透明圈/菌落直径比值最大且滤纸崩溃程度最大的菌株8株进行扩繁；
b、复选菌种：将初选得到的8个菌株接入滤纸条培养基上，并30℃温度下培养3d，然后采用Folin试剂显色法测定蛋白酶、采用次亚碘酸法测定淀粉酶以及采用3，5—二硝基水杨酸显色法测定纤维素酶，根据三种酶的测定结果，选取产酶能力最强的3株菌株；
c、确定优势菌株组合：将步骤（b）得到3株菌株两两组合分别放在pH为6~6.5、温度为30℃~35℃、接种量为3%的PDA平板上进行培养，3d后选取生长良好且没有产生抑制作用的一组菌株组合，作为有机肥复合菌系。
2.根据权利要求1所述的生产有机肥的复合菌系的筛选方法，其特征在于：所述的增殖培养基为液体发酵培养基：它是由KH2PO42.0g/L、Mg2SO40.3g/L、CaCl0.3g/L、FeSO4.7H2O0.005g/L、ZnSO4·7H2O0.0014g/L、MnSO4·4H2O0.0016g／L及CoCl20.002g/L组成的溶液，其pH值为5.5，并在该溶液中每100mL加5g秸秆粉。
3.根据权利要求2所述的生产有机肥的复合菌系的筛选方法，其特征在于：所述的秸秆粉为玉米杆粉、稻杆粉及油菜杆均匀混合而成，按质量分数计算玉米杆粉：稻杆粉：油菜杆粉的比例为1:1:1。
4.根据权利要求1所述的生产有机肥的复合菌系的筛选方法，其特征在于：所述的滤纸条培养基为浸润有培养液的滤纸条，所述的培养液由lg的（NH）2SO4、lg的KH2PO4、0.5g的MgSO4·7H2O及0.1g的酵母浸膏溶解在1000mL的蒸馏水制得。
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