JPH034786A - アルカリセルラーゼ、これを産生する微生物及びアルカリセルラーゼの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は新規なアルカリセルラーゼ、これを産生ずる微
生物、及び該アルカリセルラーゼの製造法に関する。

〔従来の技術〕

従来、繊維素分解酵素セルラーゼの開発は、ｉ＜イオマ
ス資源（特にセルロース資源）の有効利用を一大目標と
して、進められてきており、多くの場合、カビ類にその
供給源を求めてきている。セルラーゼ生産菌として分離
されて来た菌株は、多種類にわたり、アスペルギルス属
、ペニシリウム属、トリコデルマ属、フザリウム属、フ
ミコーラ届、アクレモニウム属等の糸状菌（カビ）を中
心に、シュウトモナス属、セルロモナス属、ルミノコッ
カス属、バチルス属等の細菌、更に、ストレプトマイセ
ス属、サーモアクチノマイセス属等の放線菌でも報告さ
れている。

一方、セルラーゼの新規な産業的用途として、衣料用洗
浄剤の配合成分としての利用が検訓され注目を集めてい
る（特公昭５９−４９２７９号公報、特公昭６０〜２３
１５８号公報、特公昭６０−３６２４０号公報）。しか
し、自然界に於いて、微生物の産生ずるセルラーゼのほ
とんどが、中性乃至酸性領域に於いて最大且つ安定な酵
素活性を示す、所謂中性若しくは酸性セルラーゼに分類
されるものであって、衣料用洗浄剤組成物中に配合する
ための条件を有するセルラーゼ、すなわち、アルカリ領
域で最大活性を示す所謂アルカリセルラーゼの存在は極
めて少ないのが実情である。尚、ここで言う°ｒアルカ
リセルラーゼは至適ｐ　Ｈがアルカリ領域にあるものを
言う。

すなわち、従来、衣料用洗浄剤組成物において使用し得
るアルカリセルラーゼの生産方法としては、好アルカリ
性バチルス属細菌の培養によりセルラーゼ八を採取する
方法（特公昭５Ｏ−２）１５１５号公報）、セルロモナ
ス屈に属する好アルカリ性細菌を培養してアルカリセル
ラーゼ３０１−Ａを生産する方法（特開昭５８−２２４
６８６号公報）、好アルカリ性バチルスＮα１１３９を
培養してカルボキシメチルセルラーゼを生産する方法（
Ｆｕｋｕｍｏｒｉ、　Ｆ、、　Ｋｕｄｏ、　Ｔ。

ａｎｄ　ｌ１ｏｒｉｋｏｓｈｉ、　　Ｋ、、　　Ｊ、　
Ｇｅｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、　　１３１３３３９
、　　（１９８５））及びストレプトマイセス属の一１
重を用いてアルカリセルラーゼを生産する方法（特開昭
６１−１９４８３号公報）が報告されているに過ぎず、
しかもいずれも工業的発酵生産に適うものでは無かった
。

ところが、最近、好アルカリ性細菌の一種であるバチル
ス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ、）　ＫＳＭ−
６３５（ＦＩＥＲＭ　ＢＰ−１４８５）　（特開昭６３
−１０９７７１号公報）が、衣料用洗浄剤組成物として
適したアルカリセルラーゼＫ（特開昭６３−１０９７７
６号公報）を高生産することが見出され、アルカリセル
ラーゼの工業的発酵生産が行われるに至っている。更に
好アルカリ性菌によらずとも、培養が容易な中性細菌に
よってもアルカリセルラーゼ（特開昭６３−１３７６７
７゜２４０７８５、２４０７７７、２４０７８６号公報
、特開昭６４−３７２８５号公報、Ｓ、Ｋａｗａｉ　ｅ
ｔ　ａｌ、、Δｇｒｉｃ、　Ｄｉａｌ、　Ｃｈｅｍ、。

５２、１４２５（１９８ｇ））及びアルカリ領域におい
ても高活性を維持し得るアルカリ耐性セルラーゼ　（特
開昭６３−１４１５８６．１４６７８６．２７３４７４
．２７３４７５．２７９７９０号公報、特開昭６４−３
７２８６号公報）を生産し得ることも見出されている。

〔発明が解決しようとする課題〕

しかしながら、工業的発酵生産に適うアルカリセルラー
ゼの例は現在までのところ上記の例のみであり、更に様
々な特色を有するアルカリセルラーゼ及びその生産菌の
開発が望まれていた。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者は、アルカリセルラーゼを生産する（微生物を
自然界に求め、鋭意探索を続けて来たが、今般、栃木県
那須郡の土壌より採取したバチルス属に属する微生物が
、衣料用洗浄剤組成物の添加成分として有効であり、グ
ルカナーゼ活性を有することから、ビール製造等の分野
にも応用できる新規なアルカリセルラーゼを生産するこ
とを見出し、本発明を完成した。

したがって、本発明は新規なアルカリセルラー−ｔ！’
　Ｋ−１９、これを産生ずる微生物（バチルス・エスピ
ーＫＳＭ−１９）及び該アルカリセルラーゼの製造法を
提供するものである。

本発明のアルカリセルラーゼを生産する上記微生物は、
次のような菌学的性状を示す。なお、以下において菌株
の分類に用いた培地は次の培地１〜２１の２１種類であ
り、これらは何れも別途滅菌した炭酸す）　ＩＪウム（
ＮａｚＣ（ｌｌ＋）を１．０重量％（以下、単に％とい
う）含有する。

使用した培地の組成（表示は％）： 培地１．ニュートリエンドブロス、０．８；バクト寒天
、１．５ 培地２．ニュートリエンドブロス、０．８培地３．ニュ
ートリエンドブロス、０．８；バクトゼラチン、２０．
０；バクト寒天、１．５培地４．バイトリドマスミルク
、１０．５培地５．ニュートリエンドブロス、　　０．
８　；　ＫＮＯ３゜０．１ 培地６．バタトペプトン、　　０．７　；ＮａＣＡ、　
　０．５　；ブドウ糖、０．５ 培地７．３ＯＭ寒天培地、指示量 培地８．ＴＳＩ寒天培地（栄研化学製）、指示量培地９
．バクトペブトン、１．５；酵母エキス。

０．５；可溶性澱粉、２．０　；　Ｋ２ＨｐＯ，、０，
１；Ｍｇ５Ｌ・７Ｈ，０，０，０２；バクト寒天、１．
５培地１０．　Ｋｏｓｅｒ培地、指示量 培地１１．　ＣＩ＋ｒｉｓｔｅｎｓｅｎ培地（栄研化学
製）、指示量培地１２．■酵母エキス、　０．０５；Ｎ
ａ２５ｏ４．０．１；Ｋ１１２ＰＯ，。

０．１；ブドウ糖、１．０ ■酵母エキス、　０．０５；Ｎａ、Ｓｏ、、　０．１；
Ｋ１１２Ｐｏ、。

０、工；ブｌ’つ糖、　　１，０；　ＣａＣＪ　２・２
１（２０゜０．０５：　　Ｍｎ５Ｏ＝　　’　　４　〜
６＋１２０．　０．０１：Ｆｅ５０．　・７Ｈ２０，０
，００１；　Ｍｇ５Ｏ，−７１１□０゜０．０２ 窒素源としては、硝酸す）　Ｕラム、亜硝酸ナトリウム
、塩化アンモニウム及びリン酸アンモニウムを総窒素含
量として （１，０４１２％となる様に上記■及び■のＪ＆地に加
えて用いた。

培地１３．キングＡ培地“栄研”　（栄研化学製）指示
量 培地１４．キングＢ培地“栄研”　（栄研化学製）指示
ｍ 培地１５．尿素培地“栄研”　（栄研化学製）、指示量 培地１６．チトクローム・オキシダーゼ試験用濾紙（日
永製薬製） 培地１７．３％過酸化水素水 培地１８．バタトペブトン、０．５．酵母エキス、０．
５；ブドウ糖、　　１，０；に２ＨＰＯ，、０，１；Ｍ
ｇ５Ｏ＜・７Ｈ２０，０，０２ 培地１９．バクトペブトン、　２．７；ＮａＣｊ２　、
５．５ニブドウ糖、　０．５：に２１１ＰＯ，、ｏ、３
；ブロムチモールブルー　０．０６；バクト寒天、１．
５培地２０．　（Ｎ１１．）　ｄｌＰＬ、　０．１；Ｋ
Ｃｆ　、　０．０２；Ｍｇ５Ｏ，・７１１２０゜０．０
２；酵母エキス、　０．０５；　［ｉ、　１．０培地２
１．カゼイン、０．５；バクト寒天、　１．５；酵母エ
キス、０．５；ブドウ糖、　　１．０；に２１１Ｐ０４
．　０．１；Ｍｇ５Ｌ・７Ｈ，０，０，０２ （菌学的性質） （ａ）　　顕微鏡的観察結果 菌体の大きさは、Ｏ：　５〜Ｌ　２　μｍ　ｘ　１．２
〜５．８μｍの桿菌であり、菌体の準端に楕円形の内生
胞子＜０．７〜１．２μｍ　ｘＬ２〜Ｌ７μｍ　）を作
る。

周鞭毛を有し運動性がある。ダラム染色は陽性。

ら）各種培地に於ける生育状態 ■肉汁寒天平板培養（培地１） 生育状態は良好。集落の形状は不規則であり、表面は円
滑、周縁は波状である。又集落の色調は乳白色で光沢が
ある。

■　肉汁液体培養（培地２） 生育は良好。

■　肉汁ゼラチン穿刺培養（培地３） 生育は良好。ゼラチンの液化は認められた。

■　リドマスミルク培地（培地４） ミルクの凝固、ペプトン化は認められない。

又、リドマスの変色は培地がアルカリ性のため、判定で
きない。

（Ｃ）　　生理学的性質 ■　硝酸塩の還元及び脱窒反応（培地５）硝酸塩の還元
は陽性。脱窒反応は陰性。

■　ＭＲテスト（培地６） 陰性、陽性は判定できない。

■　ＶＰテスト（培地６） 陽性。

■　インドールの生成（培地７） 陰性。

■　硫化水素の生成（培地８） 陰性。

■　澱粉の加水分解（培地９） 陽性。

■　クエン酸の利用（培地１０．１１）コーサ培地で陰
性。クリステンセン培地では、陰性か陽性か判定できな
い。

■　無機窒素源の利用（培地１２） 硝酸塩、アンモニウム塩ともに利用する。

■色素の生成（培地１３．１４） キングＢ培地で黄色色素を生成する。

■　ウレアーゼ（培地１５） 陰性。

■　オキシダーゼ（培地１６） 陽性。

■　カタラーゼ（培地１７） 陽性。

■　生育の範囲（培地１８） 生育の温度範囲は、２０〜３７℃、生育最適温度範囲は
３０〜３７℃。生育のｐｌ範囲は、ｐ１１７〜１１、生
育最適ｐＨはｐＨ１０，５であった。

■　酸素に対する態度 好気性。

■　０−Ｆテスト（培地１９） アルカリ性の為変色は判定できない。好気状態でのみ生
育する。

■　糖の利用性（培地２０．＋：生育する、：生育せず
） １、　　Ｌ−アラビノース　　　＋ ２、　　Ｄ−キシロース　　　　＋ ３、　　Ｄ−グルコース　　　　＋ ４、　　Ｄ−マンノース　　　　＋ ５、　　Ｄ−フラクトース　　　＋ ６、Ｄ−ガラクトース　　　＋ ７、麦芽糖　　　　　　　　十 ８、ショ糖　　　　　　　　十 ９、乳糖　　　　　　　　　十 １０、トレハロース　　　　　　＋ １１、Ｄ−ソルビット １２、Ｄ−マンニット　　　　」− １３、イノジット １４、グリセリン　　　　　＋ １５、デンプン　　　　　　　＋ ■　食塩含有培地に於ける生育（培地１を改変） 食塩濃度が７％で生育良好。１０％で生育せず。

■　カゼインの分解（培地２１） 陽性。

［相］　Ｇ＋Ｃ含量（Ｔｍ法） 本発明にかかる菌の１］昌のＧ十Ｃ含ｍは、約３８、０
　ｍｏ１％である。

以上の菌学的性質に関する検討に基づき、バーシーズ・
マニュアル・オブ・システィマティク・バクテリオロジ
−（［ｌｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｎｕａｌ　ｏｆＳｙｓ
ｔｅｍａｔｉｃ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）第２巻お
よびザ・ジーナス・バチルス（Ｔｈｅ　Ｇｅｎｕｓ　Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ”　Ｒｕｔｈ、Ｂ。

Ｇｏｒｄｏｎ、Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ　Ｈａｎｄｂｏ
ｏｋ　　Ｎｏ、４２７゜Δｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｒ
ｅ５ｅａｒｃｈ　５ｅｒｖｉｃｅ、Ｕ、Ｓ、Ｄｅｐａｒ
ｔｍｅｎＬｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ　Ｗａｓｈｉ
ｎｇｔｏｎ　Ｄ、Ｃ，、（１９７３））を参照し、比較
検索した結果、本菌株は有胞子桿菌であるバチルス（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ）属の一種であると認められる。しかし
、本菌株は中性領域では生育できず、専らアルカリ領域
で良好な生育を示すことから、最近、１１ｏｒｉｋｏｓ
ｈｉと八ｋｉｂａ（“ＡｌｋａｌｏｐｈｉｌｉｃＭｉｃ
ｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ”、Ｊａｐａｎ　５ｃｉｅｎｔｉ
ｆｉｃ　５ｏｃｉｅｔｙＰｒｅｓｓ　（Ｔｏｋｙｏ）、
１９８２年刊）の主張している、所謂好アルカリ性　（
Ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｉｃ）細菌に属し、従来の中性で
生育するバチルス属細菌とは区別される。

そして、本菌株の上記菌学的性質は、公知の好アルカリ
性バチルスのいずれとも一致しないので、これを新規菌
株と判断して、バチルス・エスピーＫＳＭ−１９と命名
し、工業技術院微生物工業技術研究所に、微工研菌寄第
１０４８１号（Ｆ［ＥＲＭ　Ｐ−１０４８１）として寄
託した。

本発明アルカリセルラーゼを製造するには、例えばＣＭ
Ｃアーゼ活性及び／又はグルカナーゼ活性を測定し、ア
ルカリセルラーゼ生産菌を選択し、これを培養し、その
培養物から該アルカリセルラーゼを取得する方法が挙げ
られる。更に本発明のアルカリセルラーゼは、例えば、
上記の好アルカリ性バチルス・エスピー　ＫＳＭ−１９
（１’ＢＲＭ　Ｐ−１０４’８１）及びこれより誘導さ
れた高力価の当該酵素生産性を有する各種突然変異株を
用いる発酵法により製造することができる。

また、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ、　ＫＳＭ−６４（ＦＢ
ＲＭ　Ｐ−１０４８２）もβ−１，，３−；　　１，４
−グルカン及びβ−１，３−グルカンに対して高い分解
活性を有するアルカリセルラーゼであるアルカリセルラ
ーゼに−６４を生産することが本発明者らによって明ら
かにされている。

従って、本発明の製造法を実施するには、ＫＳＭ−１９
の他にＫＳＭ−６４を用いる他、これらの変異株を用い
ることができる。

上記の菌株を用いて本発明のアルカリセルラゼを得るに
は、適当な培地に該菌株を接種し、常法に従って培養す
れば良い。培養培地としては、資化し得る窒素源と炭素
源を適宜組み合わせて含有せしめたものが使用される。

この炭素源及び窒素源については、特に制限はない。例
えば、窒素源としては、硝安、硫安、塩安、リン酸アン
モニウＡ、［２ソータ、コーングルテンミール、大豆粉
、コーンスチーブリカー、カザミノ酸、酵母エキス、フ
ァーマメディア、イワシミーノペ肉エキス、ペプトン、
バイブロ、アジパワー　コーンソイビーンミール、コー
ヒー粕、綿実油粕、カルチベーター　アジプロン、ゼス
トなどが、また、炭素源としては、籾殻、麩、濾紙、一
般紙頚、おが屑等の植物繊維質、廃糖蜜、転化糖、ＣＭ
Ｃ、アビセル、セルロース綿、キシラン、ペクチン、リ
ボース、アラビノース、キシロース、グルコース、マン
ノース、フラクトース、ガラクトース、乳糖、麦芽糖、
蔗糖、トレハロース、マンニット、グリセリン、澱粉、
酢酸、などが挙げられる。その他１こ、　リ　ン酸、　
Ｈｇ２＋、　　□ａ２＋、　　Ｍｎ２＋、　　ｚｎ２＋
、　　Ｃｏ２＋Ｎａ”、　Ｋ＋などの無機塩や、必要で
あれば、無機、有機微量栄養源を添加することもできる
。

斯くして得られた培養物からの目的物質であるアルカリ
セルラーゼの採取及び精製は、後記実施例に示す如く、
一般の酵素の採取及び精製の手段に準じて行うことがで
きる。即ち、遠心分離又は濾過等の通常の固液分離手段
により菌体を培養物から除去して粗酵素液を得ることが
できる。この粗酵素液は、そのまま使用することもでき
るが、必要に応じて塩析法、沈澱法、限外濾過法等の分
離手段により粗酵素を得、さらに公知の方法により精製
結晶化して、精製酵素として使用することも可能である
。

次に、斯くして得られる本発明の提供する新規酵素、ア
ルカリセルラーゼに−１９の酵素学的性質について説明
する。

なお酵素活性のａｌｌ定は、以下の方法に従って行った
。

（１）　ＣＭＣアーゼ活性 ２．５％ＣＭＣ（サンローズＡ０１シ、山１場国策バル
ブ社製）０．４ｍＡ、５００ｍＭ　　グリシン緩衝液（
ｐ９）０．２ｍ！、及び脱イオン水０．３ｍＡからなる
基質溶液に酵素液０．１＋＋＋ｊｌ！を加え、３０℃で
、２０分間反応させた。反応後、３，５−ジニ）ローサ
リチル酸（３，５−ｄｉｎｉｔｒｏ−ｓａｌｉｃｙｌｉ
ｃ　ａｃｉｄ（ＤＮＳ））法にて、還元糖の定量を行っ
た。即ち、反応液１．ＯｍβにＯＮｓ試Ｎ１．Ｑ（ｎｌ
を加え、５分間、１００℃で加熱発色させ、冷却後、４
．０ｍβの脱イオン水を加えて希釈し、波長５３５ｎｍ
で比色定量した。酵素の力価は、１分間に１μｍｏｌの
グルコースに相当する還元糖を生成する酵素量を１単位
とした。

尚、用いた緩衝液は、次の通りである。

２１１３〜８　マクイルパイン緩衝液 ９１１８〜１１　　グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液
ｐＨ１２〜１３　　塩化カリウム−水酸化ナトリウム緩
衝液 （２）　　ｐ−ニトロフェニルグルコシド及びｐ−ニト
ロフェニルセロビオシド分解活性 ０．８μｍｏｌ　ｐ−ニトロフェニルセロビオシド（シ
グマ社製）又はｐ−ニトロフェニルグルコシド（シグマ
社製）と５０μｍｏｌ　　ＩＪン酸緩衝液（ｐ７．０）
又は１００　μｍｏｌグリシン緩衝液（ｐＨ９）とを含
有する反応液り、０ｍｆｆ１中に適当量の酵素液を３０
℃で作用させた後、Ｉ　Ｍ　Ｎａ２ＣＯａを０，４ｍｆ
ｌ加え、遊離するｐ−ニトロフェノールを４１０ｎｍで
比色定量した。酵素力価は、１分間に１μｍｏｌのｐ−
ニトロフェノールを遊離させる酵素量を１単位とした。

（３）　　アビセル、セルロース粉末、リン酸膨潤セル
ロース、アルカリ膨潤セルロース及び濾紙分解油イイ１
５ １０ｍｇアビセル（メルク社）及び１００μｍｏｌグリ
シン緩衝液（ｐＨ１９）を含有する反応液１．０ｍβ中
に適当■の酵素を加え、３０℃で２８　Ｏｒｐｍで振ｋ
ｎ　Ｌながら反応させた。反応後、ＤＮＳ法にて還元糖
の定量を行った。酵素力価は、１分間に１μｍｏｌのグ
ルコースに相当する還元糖を生成する酵素量を１単位と
した。

その他の活性も、上記の方法に準じて行った。

基質としては、東洋濾紙社製のセルロース粉末、セルラ
ーゼ活性検定用濾紙（東洋Ｎｏ、５１−特）及び、富国
等の方法（Ｔｏｍｉｔａ、　Ｙ、　ｅｔ　ａｌ、　；Ｊ
、Ｆｅｒｍｅｔ。

Ｔｅｃｈｎｏｌ、、　５２，２３５．１９７４）に従っ
て処理したアルカＩＪ　Ｉｌｇ　潤セルロース、リンＩ
％ｔ　［ｌｉＪ　ｆｌセルロースヲ使用した。

（４）　　β−１，３−；１，４−グルカナーゼ活性、
β−１，３−グルカナーゼ活性 β−１，３−；　１．４−グルカナーゼ活性、β−１，
３−グルカナーゼ活性は、基質としてリケナン（ｆｒｏ
ｍ　［，１ｓｎｅｒａ　ｂａｒｕｂａｔａ、　　シグマ
社製）及び−ｙミを用いて、（３）に牟じて活性を測定
した。

（酵素学的性質） （１）作用 ＣＭＣ、セルロース粉末、アビセル等の繊維素によく作
用し、これらを溶解せしめ、還元糖を生成する。

（２）基質特異性 本酵素の基質特異性の一例を第１表に示した。

本酵素は、ＣＭＣの他にも、セルロース粉末、リン酸膨
潤セルロース、アビセル、アルカリ膨潤セルロース、濾
紙、ｐ−ニトロフェニルグルコキシド及びｐ−ニトロフ
ェニルセロビオシドなどに活性を有し、更に、β−１，
３−；１，４−グルカンであるリケナンに非常に高い氷
解活性を有し、β−１，３−グルカンであるラミナリン
にも作用した。

以下余白 第　　１ 表 ＊ｐ−ニトロフェニルセロビオシド ＊＊ｐ−ニトロフェニルグルコシド （３）　　作用ｐＩＩ及び至適ｐＨ ＣＭ　Ｃに対する作用ρ１１範囲は、４．５〜１２．５
と広範囲であり、至適作用ｐｌ＋は、９．０である。ま
た、７、０〜１１．０の範囲に於いても至適ｐＨに於け
る活性の５０％以上の相対活性を有する（第１図）。

（４）ｐＨ安定性 それぞれのｐＨで３０℃、１時間保持した後の残存活性
を測定し、ｐＨ（安定性を調べた。その結果、ｐ＋！４
．５〜１１．０の範囲で極めて安定であり、ｐＨ４，０
〜１２．０に於いても約５０％以上の活性を維持するく
第２図）。

（５）作用温度及び至適温度 本酵素は、１０〜７０℃の広範囲で作用し、その至適温
度は、５０℃である。又、３５〜６０℃の範囲に於いて
も至適温度での活性の５０％以上を有する（第３図）。

（６）温度安定性 グリシ：／−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９，０）中で、各温
度で１０分間加熱処理後の残存活性を測定した結果、本
酵素は、５０℃でもほとんど失活せず、５５℃に於いて
も約５０％の残存活性を有していた（第４図）。

（７）分子量 本酵素は、バイオゲルＡ０．５ｍ（バイオラッド社製）
を用いたゲル濾過法によれば、約１２±２万及び３，４
±０．２万（微小ピーク）にＣＭＣを基質とした活性ピ
ークを有する。

（８）金属イオンの影響 各種金属イオン（Ｎａ”　　Ｋ”　　Ｃａ”　　Ｃｕ”
Ｃｏ２＋、　Ｃｄ”、　Ｍｎ”、　Ｍｇ２＋、　Ｂａ２
＋、　Ｎｉ２＋、　１ｇ２＋Ｆｅ２＋、　ｐｂ２＋、　
Ｚｎ２＋、八ｐ　３＋、　ｐｅ３＋）を活性測定時に共
存させてその影響を検討した結果、１１　ｇ　２”Ｐｂ
”　（ｌ　ｍＭ）の添加は、阻害効果を与え、ＣＯ２＋
Ｍｎ２＋　（１ｍＭ）の添加は、活性化効果を与えた。

（９）界面活性剤の影響 本酵素は、各種界面活性剤（例えば、ＬＡＳ、八５ＳＢ
Ｓ、　ＡＯ３、α−３ＦＢ　、　ＳＡＳ　、石鹸、ポリ
オキシエチレンセカンダリ−アルキルエーテル、５Ｏ８
）を０．０５％添加しても酵素活性に阻害は認められな
かった。

αＣプロプアーゼの影響 洗剤用プロテアーゼ、例えば、ＡＰＩ−２１（昭和電工
）、マクサターゼ（ｌ［１ｌｓ）　、サビナーゼ、アル
カラーゼ、エスペラーゼ（ノボ）を活性測定時に共存（
０，２Ａｌｌ／β）させ、その影響を調べたところ、何
れのプロテアーゼに対しても強い耐性を有することが判
った。

ＯＤ　　キレート剤の影響 キレート剤であるＢＤＴＡ、　ＢＧＴ八、トリポリリン
酸ソーダ、ゼオライト、クエン酸を活性測定時に共存さ
せ、その影響を検討したが、阻害は認められなかった。

〔発明の効果〕

本発明のアルカリセルラーゼに−１９は、至適ｐＨが９
であるが、ｐＨ７，０〜１１．０の範囲においても至適
ｐｌ＋における活性の５０％以上の相対活性を有し、ｐ
Ｈ１４，５〜１１．０の範囲において極めて安定である
。

また、界面活性剤、プロテアーゼ、キレート剤等の洗浄
剤配合成分によっても殆ど阻害を受けない。

従って本酵素は、洗浄剤組成物の配合成分として有利に
使用できるものである。

また、本発明のアルカリセルラーゼはβ−１，３；１，
４−グルカナーゼ活性及びβ−１，３−グルカナーゼ活
性を有しているので、大麦等の穀物由来のβ−グルカン
を分解することができる。従って、例えばビール製造時
の麦汁の濾過時間の短縮又は製品ビールの混濁防止等の
技術に利用することができる。

〔実施例〕 以下、実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、
本発明はこれらに限定されるものではない。

実施例１ 栃木県那須郡の土壌を薬匙−杯（約０．５　ｇ　）をと
り、滅菌生理食塩水に懸濁し、８０℃で１０分間熱処理
した。この熱処理液の上清を適当に希釈して、分離用寒
天培地（培地Ａ）に塗布した。次いで、これを３０℃に
て３日間培養し、集落を形成させた。集落の周囲にＣＭ
Ｃの溶解に基づく透明帯を形成するものを選出し、ＣＭ
Ｃアーゼ生産菌を取得した。

以下余白 培地Ａ ＭＣ ポリペプトン 酵母エキス Ｈ２ＰＤ４ ＭｇＳＯ４・７　Ｈ２Ｏ ａＣＯ３ ０，５ ０，５ ０，１ ０，０ ０，８ ｐＨ約１０ 培地Ｂ　　　ＣＭＣ１％ 肉エキス　　　　　１．５　　％ 酵母エキス　　　　０．５　　％ ＫＨ，ＰＯ，０，１％ ｐＨ　約１０ 続いて、培地ＡのＣ’ＭＣに代えてリケナン１％を添加
した寒天培地に取得菌を移植し、３０℃にて３日間培養
し集落を形成させた。コンツーレッド法により集落の周
囲にリケナンの分解に基づく透明帯を形成するものを選
出し、リケナーゼ生産閑を取得した。

更に、取得菌を培地Ｂの液体培地に接種し、３０℃で３
日間振盪培養した。培養後、遠心分離した上清液につい
て、ＣＭＣアーゼ活性及びリケナーゼ活性をｐＨ３〜１
３にて測定し、アルカリセルラーゼ生産菌を選択した。

上述の方法により、本発明のＫＳＭ−１９菌（ＦＢＲＭ
　Ｐ−１０４８１）を取得することができた。

実施例２ 実施例１で得たバチルス・エスピーＫＳＭ〜１９菌ヲ実
施例１の液体培地已に接種し、３０℃で３日間振の培養
した。培養後、菌体を遠心分離して除き、粗酵累液とし
た。更に、通常の方法に従って、エタノール乾爆粉末と
し、セルラーゼ酵素標品（第２表）を得ることが出来た
。

実施例３ 実施例１の液体培地已に於いて、（ＪＪＣに代えてセロ
ビオースを１％、ポリペプトンに代えてＣ３Ｌを５％添
加した培地に、ＫＳＭ−１９菌を接種し、３０℃で２乃
至３日間振盪培養した。遠心分離上清についてＣＭＣ了
−ゼ活性を測定した結果、７６９Ｕ／ｌのＣＭＣアーゼ
活性、１２３８Ｕ　／　ｆｆのりヶナン分解活性、２８
５　Ｕ／ｌのラミナリン分解活性が得られた。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明のアルカリセルラーゼの反応ｐＨと相
対活性との関係を示す図面、第２図は、処理ｐｔ＋と残
存活性との関係を示す図面、第３図は、本発明アルカリ
セルラーゼの反応温度と相対活性との関係を示す図面、
第４図は、処理温度と残存活性との関係を示す図面であ
る。 以　　上 （酵素活性はｐｌ（９に於ける測定値である。）反 応ｐＨ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、次の物理化学的性質を有するアルカリセルラーゼＫ
   −１９。 （１）作用 カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、セルロース、
   濾紙、アビセル等の繊維素によく作用し、これらを溶解
   せしめ、還元糖を生成する。 （２）基質特異性 ＣＭＣの他にも、セルロース粉末、リン酸膨潤セルロー
   ス、アルカリ膨潤セルロース、アビセル、濾紙、ｐ−ニ
   トロフェニルグルコシド及びｐ−ニトロフェニルセロビ
   オシドに対する活性を有する。 （３）作用ｐＨ及び至適ｐＨ ＣＭＣに対する作用ｐＨ範囲は、４．５〜１２．５であ
   る。至適ｐＨは９であり、７．０〜１１．０の範囲にお
   いても至適ｐＨに於ける活性の５０％以上の相対活性を
   有する。 （４）ｐＨ安定性 ＣＭＣを基質とした場合、ｐＨ４．５〜１１．０で極め
   て安定で失活せず、ｐＨ４．０〜１２．０においても、
   約５０％以上の活性を維持する。 （５）最適温度 ＣＭＣに対する作用温度は、１０〜７０℃の広範囲にわ
   たり、その至適温度は、５０℃である。又、３５〜６５
   ℃の範囲に於いても、至適温度での活性の５０％以上を
   有する。 （６）分子量 ＣＭＣを基質とした場合、約１２±１万及び３．４±０
   ．２万（微小ピーク）に活性のピークを有する。（バイ
   オゲルＡ０．５ｍを用いたゲル濾過法による。） （７）金属イオンの影響 ＣＭＣを基質とした場合、Ｈｇ＾２＾＋、Ｐｂ＾２＾＋
   により阻害され、Ｃｏ＾２＾＋、Ｍｎ＾２＾＋により活
   性化される。 （８）界面活性剤の影響 ＣＭＣを基質とした場合、直鎖アルキルベンゼンスルホ
   ン酸塩、アルキル硫酸塩、ポリオキシエチレンアルキル
   スルホン酸塩、α−オレフィンスルホン酸塩、２−スル
   ホ脂肪酸塩、二級アルカンスルホン酸塩、ドデシルスル
   ホン酸塩、石鹸、ポリオキシエチレンセカンダリーアル
   キルエーテルは活性を殆ど阻害しない。 （９）プロテアーゼの影響 ＣＭＣを基質とした場合、プロテアーゼに対して耐性を
   有する。 （１０）キレート剤の影響 ＣＭＣを基質とした場合、ＢＤＴＡ、ＥＧＴＡ、クエン
   酸、トリポリリン酸ソーダ、ゼオライトは活性を阻害し
   ない。 ２、バチルス属に属し、アルカリ培地で生育するアルカ
   リセルラーゼＫ−１９生産菌。 ３、バチルス・エスピー（￥Ｂａｃｉｌｌｕｓ￥ｓｐ．
   ）ＫＳＭ−１９と命名され、微工研菌寄第１０４８１号
   として寄託された請求項２記載のアルカリセルラーゼＫ
   −１９生産菌。 ４、バチルス属に属し、β−１，３−；１，４−グルカ
   ナーゼ活性及びβ−１，３−グルカナーゼ活性を有する
   アルカリセルラーゼを生産する微生物を培養し、その培
   養物から該アルカリセルラーゼを取得することを特徴と
   するアルカリセルラーゼの製造法。 ５、バチルス属に属し、アルカリ培地で生育するアルカ
   リセルラーゼＫ−１９生産菌を培養し、その培養物から
   アルカリセルラーゼＫ−１９を取得することを特徴とす
   るアルカリセルラーゼＫ−１９の製造法。