JPS63273475A - アルカリ耐性セルラーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は新規なアルカリ耐性セルラーゼ及びこれを産生
する微生物に関する。

〔従来の技術〕

繊Ｍ素分解酵素セルラーゼの開発は、従来、バイオマス
資源、特にセルロース資源の有効利用を一大目標として
進められてきた。セルラーゼ生産菌として分離されて来
た菌株は多種類にわたり、アスペルギルス属、ペニシリ
ウム属、トリコデルマ属、フザリウム属、フミコーラ属
、アクレモニウム属等の糸状菌を中心に、シュウトモナ
ス属、セルロモナス属、ルミノコツカス病、バチルス属
等の細菌、更に、ストレプトマイセス属、サーモアクヂ
ノマイヒス属等の放線菌でも報告されている。しかしな
がら、現時点では、バイオマス用セルラーゼの工業的規
模での利用は、多くはない。

一方、セルラーゼの新規な産業的用途として、衣料用洗
浄剤の配合成分としての利用が検討され注目を集めてい
る（特公昭５９−４９２７９＠公報、特公昭６０−２３
１５８号公報、特公昭６〇−３６２４（［公報）。しか
し、自然界において従来見出されたセルラーゼのほとん
どは、中性乃至酸性領域に於いて最大且つ安定な酵素活
性を示す、所謂中性若しくは酸性セルラーゼに分類され
るものであって、衣料用洗浄剤配合成分としての必要条
件である、アルカリ領域で最大活性を示すか、あるいは
アルカリ耐性を有するセルラーゼ、所謂アルカリセルラ
ーゼ及びアルカリ耐性セルラーゼの存在は、極めて少な
いのが実情である。

ここで言うアルカリセルラーゼとは、至ｉｐＨがアルカ
リ領域にあるものを言い、アルカリ耐性セルラーゼとは
、至適ｐＨは中性から酸性領域にあるが、アルカリ領域
に於いても至適ｐＨに於ける活性に比較して充分に活性
を有しかつ安定性を保持するらのを言う。

また、中性とはＩ）Ｈ６〜８の範囲を言い、アルカリ性
とはそれ以上のｌ）Ｈ範囲をいう。

即ち、従来、衣料用洗浄剤組成物として使用し得るアル
カリセルラーゼ及びアルカリ耐性セルラーゼの生産方法
としては、好アルカリ性バチルス属細菌の培養によりセ
ルラーぜＡを採取する方法（特公昭５０−２８５１５号
公報）、セルロモナス属に屈する好アルカリ性細菌を培
養してアルカリセルラーゼ３０１−Ａを生産する方法（
特開昭５８−２２４６８６号公報）、好アルカリ性バチ
ルス１ＩＱ１１３９を培養してカルボキシメチルセルラ
ーゼを生産する方法（Ｆｕｋｕｍｏｒｉ、Ｆ、　、にｕ
ｄｏ、　Ｔ。

ａｎｄ　ｆｌｏｒｉｋｏｓｈｉ、に、、　Ｊ、Ｇｅｎ、
Ｈｉｃｒｏｂｉｏｌ、、　１３１，３３３９゜（１９８
５））及びストレプトマイセス属の一種を用いてアルカ
リセルラーゼを生産する方法（特開昭６１−１９４８３
号公報）が報告されているに過ぎず、いずれも工業的発
酵生産に適うものでは無かった。

ところが、最近、本発明者らは好アルカリ性微生物の一
種であるバチルス　エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ、
）ＫＳＭ−６３５（ＦＥＲＭ　　Ｐ−８８７２）が、衣
料用洗浄剤組成物として適したアルカリセルラーゼＫを
効率良く生産すること、及び更に培養条件を選択するこ
とにより、より高収率で、アルカリセルラーゼＫが得ら
れ、アルカリセルラ−ゼ〔発明が解決しようとする問題
点〕 しかしながら、上記バチルス　エスピーＫＳＭ−６３５
の培養条件は、必ずしも工業的に有利なものと言えない
。すなわち、好アルカリ性菌株は培養中、ｐＨをアルカ
リ性に保ち続ける必要があるが、現在までのところ、好
アルカリ性菌株を用いる所謂アルカリ性発酵法の歴史は
浅く、通常の中性微生物と比較するとこれら好アルカリ
性微生物の生理、生化学についての知見は充分に蓄積さ
れておらず、工業的発酵生産を行うにあたっての培地調
製、培養方法が操作上の難点となっていた。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明者らはかかる問題点を解決するためにアルカリ領
域に至適ｐｌ＋を有するアルカリセルラーゼ或いは、ア
ルカリ領域に於いても、至適ｐＨに於ける最高活性に比
較しても高活性を維持し得るアルカリ耐性セルラーゼを
生産する生竹細菌を得べく、中性ｆｒｔ域で生育する菌
株を宿主として、該当するセルラーぜ遺伝子をクローニ
ングする、所謂遺伝子組換えの手段と併行し、自然界に
おいて該細菌の探索を続けて来た。

そして、その結果、栃木県芳賀郡の土壌から分離した菌
株は、アルカリ側においても充分作用を有し、且つ安定
性を保持する、所謂アルカリ耐性セルラーゼを産生ずる
ことを見出し、本発明を完成した。

本発明において用いられる菌株は、次のような菌学的性
質を有する。なお、以下の分類同定において用いた培地
は次の通りである。

培地　１．肉エキス、　ｉ、ｏ　：バクトベブトン、　
１．０　ｒ　ＮａＣｅ。

０．５；バクト寒天、　１．５　（ｔｉｌｌ　　７．２
）　　（表示は、重量％二以下同じ） 培地　２．肉エキス、　ｉ、ｏ　：バクトベブトン、　
１．０　：　ＮａＣｆ！。

０．５　（ｐｔｌ　　７．２＞ 培地　３．肉エキス、　１．０　；バクトペブトン、　
１，０　：　ＮａＣＪｅ。

０．５；ゼラチン、　１．０　（ｐＨ７，２）培地　４
．バクトリトマスミルク、１０．０培地　５．バクトペ
ブトン、　１．０　：にＮＯ３，０，１培地　６．バク
トベブトン、　１．０　；　　Ｈａｔｃｈ、　１．０培
地　７．バクトペブトン、　０．７　：ＮａＣｅ、　０
．５　ニブドウ糖。

０．５　（ｐｔｌ　　７．０＞ 培地　８．バクトベブトン、１．０ 培地　９．ＴＳＩ寒天（来朝化学製）；指示量培地１０
．肉エキス、　１．０　：バクトベブトン、　１．０　
；　ＮａＣ１！。

０．５：可溶性澱粉、０．２：寒天、１．５培地１１．
　ＮａＮＨａ　ＨＰＯ４・４Ｈ２０，０，１５；ＫＨ２
ＰＯ４゜０．１　；ＭＧＳＯＡ・７Ｈ２０，０，０２；
クエン酸ナトリウム、　０．２５　（ｐＨ６゜８） 培地１２．クリステンセン培地（来朝化学製）；指示ｍ
培地１３．ブドウ糖、１．Ｏ；ＫＨ２ＰＯ４、０，１：
ＭＧＳＯＡ・７Ｈ２０，０，０５；ＫＣＪ！、　０．０
２　：　　窒素源、０．１（窒素源は、硝酸ナトリウム
及びｒａ酸アンモニウムを用いた＞　　（ｐＨ７，２） 培地１４．キングＡ培地“来朝″（来朝化学製）；指示
量培地１５．キング８培地“来朝″（来朝化学製）：指
示量培地１６．尿素培地“来朝”（来朝化学製）二指水
量培地１７．チトクローム・オキシダーゼ試験用濾紙（
日本製薬９Ａ） 培地１８，３％過酸化水素水 培地１９．ＯＦ基礎培地（Ｄ　ｉ　ｒｃｏ社製）；指示
ｍ培地２０．　　（Ｎｔ−１４）　２　ＨＰＯ４，０，
１：ＫＣｊ！、　０．０２　：ＭＧＳＯＡ・７）１２０
．０．０２　：　ｖｆＥｉｌエキス、　０．０２　；　
ハ’）　ｔ４：天、　２．０　；　ＢＣＰ　（０，２％
溶液）、０．４培地２１．パクト・サブロー・デキスト
ロース寒天培地（Ｄｉｆｃｏ社製）；指示ｍ 培地２２．肉エキス、０．３；バクトベブトン、０．５
：酵１（）エキス、　１．０　；グリセリン、２．０培
地２３．フェニルアラニン　マロン酸塩培地（日永製薬
社製）；指示量 培地２４．スキムミルク、　５．０　：バクト寒天、１
．５培地２５．肉エキス、０．３：バクトベブトン、０
．５；Ｌ−チロシン、０．５：バクト寒天、１．５（菌
学的性質） （ａ）顕微鏡的ｉ！京結果 菌体の大きさは、０．４〜０．８ｍｘ１．５〜６．５趨
の桿菌であり、菌体の中央に円柱形又は楕円形の内生胞
子（０，６〜０．８趨×１．０〜２．５趨）を作る。

周鞭毛を有し運動性がある。ダラム染色は陽性。

抗酸性はない。

（ｂ）各種培地に於ける生育状態 ■肉汁寒天平板培養　（培地１） 生育状態は弱い。集落の形状は円形であり、表面は円滑
、周縁は円滑である。又集落の色調は淡黄色半透明で光
沢がある。

■肉汁寒天斜面地ｌｌ（培地１） 生育は弱く、その状態は拡布状で光沢が有り、淡黄色半
透明である。

■肉汁液体培！！　（培地２） 生育するが、その状態は弱い。

■肉汁ゼラチン穿刺培養　（培地３） 表層部に生育し、ゼラチンの液化が認められる。

■リドマスミルク培地　（培地４） ミルクの液化は認められるが、リドマス色素の明確な変
化はない。

（Ｃ）生理学的性質 ■！ｌｒ４酸塩の還元及び脱窒反応（培地５．培地６）
共に、陰性。

■ＭＲテスト　（培地７） 陰性、陽性は、はっきりせず（ＤＨ５，２）。

■■Ｐテスト　（培地７） 陰性、陽性は、はっきりせず（ｐＨ５，２）。

■インドールの生成　（培地８） 陰性。

■硫化水素の生成　（培地９） 陰性。

■澱粉の加水分解　く培地１０） 陽性。

■クエン酸の利用　（培地１１．培地１２）コーサ培地
及びクリステンセン培地で、ともに陽性。

■無機窒素源の利用　（培地１３） 硝酸塩、アンモニウム塩ともに利用する。

■色素の生成　〈培地１４．培地１５）陰性。

■ウレアーゼ　（培地１６） 陰性。

■オキシダーゼ　（培地１７） 陽性。

■カタラーゼ　（培地１８） 陽性。

■生育の範囲　（培地２） 生育の温度範囲は、１５〜５０℃、生育最適温度範囲は
２５〜４０℃ 生育の０１１範囲は、ｐＨ５〜１１、生育最適１）１１
範囲はＩ）Ｈ６−１０であった。

［有］酸素に対する態度 通性嫌気性。

■Ｏ−Ｆテスト　（培地１９） 好気嫌気共に生育する。

［相］糖の利用性　（培地２０＞（＋：利用する、−二
利用しない） １、　１−アラビノース　　　＋ ２、　　Ｄ−キシロース　　　　＋ ３、　０−グルコース　　　　＋ ４、　０−マンノース　　　　＋ ５、　０−７ラクトース　　　＋ ６、　　Ｄ−ガラクトース　　　− ７、麦芽糖　　　　　　　　− ８、ショ糖　　　　　　　　十 ９、　乳糖　　　　　　　　　十 １０、トレハロース　　　　　− １１、　Ｄ−ソルビット　　　　＋ １２、０−マンニット　　　　＋ １３、　　イノジット　　　　　　＋ １４、グリセリン　　　　　　＋ １５、　　デンプン　　　　　　　＋ ■ＶＰ培地に於けるｐＨ（培地７） ｐＨ５，２ ［相］食塩含有培地に於ける生育　（改変培地１）５％
で生育する。

７％で生育する。

１０％で生育せず。

＠　ｐＨ５，７に於ける生育　（培地２１）生育する。

［相］ジハイドロキシアセトンの生成　（培地２２）陰
性。

■フェニルアラニンの脱アミノ化　（培地２３）陰性。

＠カゼインの分解　（培地２４） 陽性。

■チロシンの分解　（培地２５） 陰性。

以上の菌学的性質について、バーシーズ・マニュアル・
オブ・デイタミネイティブ・バクテリオロジー（Ｂｅｒ
ｇｅｙ　’ｓ　Ｈａｎｎｕａｌ　ｏｆ　Ｄｅｔｅｒａ＋
１ｎａｔｉｖｅ８ａＣｔｅｒｉＯＩＯＱＶ　）第８版及
びザージーナス・バチルス（”Ｔｈｅ　Ｇｅｎｕｓ　Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ”、　Ｒｕｔｈ、　Ｅ、Ｇｏｒｄｏｎ著
Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ　Ｈａｎｄｂｏｏｋ　　ＮＨ３
２７、Ａａｒｉｃｕｌｔｕ−ｒａｌ　　１ｌｅｓｅａｒ
ｃｈ　　５ｅｒｖｉｃｅ　　、Ｕ、Ｓ、Ｄｅｐａｒｔｍ
ｅｎｔ　　ｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ、　Ｗａｓｈｉ
ｎｇｔｏｎ　Ｄ、Ｃ，（１９７３））を参照し比較、検
索した結果、本発明の菌株は、右胞子桿菌であるバチル
ス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属の一種であると認められる。

そして本菌株は、最近、掘越と秋葉（“Ａｌｋａｌｏｐ
ｈｉｌｉｃ　Ｈｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ”、　Ｊａｐ
ａｎＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　５ｏｃｉｅｔｙ　Ｐｒｅｓ
ｓ（Ｔｏｋｙｏ）　、　１９８２年刊）の主張している
、所謂好アルカリ性（＾Ｉｋａｌ−ｏｐｈｉｌｉｃ　）
微生物が０１１８以上のアルカリ培地に於いて生育し、
これ以下の中性１）Ｈ領域では生育出来ないのに対し、
弱酸性領域からアルカリ領域（ｐ１１５〜１１）に於い
て生育が可能である事から、この好アルカリ性微生物と
は明らかに異なるものであり、一般的な中性で生育可能
なバチルス属微生物と判断できる。

更に本菌株を他の公知のバチルス属の菌株と比較すると
、最も類縁の種としてバチルス・リケニホルミス（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ　ｌ＋ｃｈ［１ｉｆｏｒｌｉｓ）が挙げら
れる。しかしながら、公知のリケニホルミスに属する菌
株と本菌株とを比較すると、硝酸塩の還元能において相
異する。更に上記リケニホルミスに属する菌株は少なく
ともアルカリ耐性のセルラーゼを産生しないので本発明
省らは本菌株を新菌株と判断し、バチルス　エスピー　
ＫＳＭ−５３９と命名して工業技術院微生物工業技術研
究所に寄託した（ＦＥＲＭ　　Ｐ−９０１１）。

本発明の菌株を用いてアルカリ耐性セルラーゼ、セルラ
ーゼに−５３９を得るには、培地に該菌株を接種し、常
法に従って培養すれば良い。培地中には、責化し得る炭
素源及び窒ｙＦｉ源を適当は含有せしめておくことが好
ましい。この炭素源及び窒素源については特に制限はな
いが、その例としては、窒素源として無機態の硝安、硫
安、協奏、リン酸アンモニウム、硝酸ソーダや、コーン
グルテンミール、大豆粉、コーンスチーブリカー、カザ
ミノ酸、酵母エキス、ファーマメディア、イワシミール
、肉エキス、ペプトン、バイブロ、アジパワー、コーン
ソイビーンミール、コーヒー粕、綿実油粕、カルチベー
タ、アミフレックス及びアジプロン、ゼスト、アシック
スなどが挙げられる。

又、炭素源としては、籾殻、麩、濾紙、一般紙類、おが
屑などの植物繊維質、廃糖蜜、転化糖、カルボキシメチ
ルセルロース（ＣＭＣ）　、アビセル、セルロース綿、
キシラン、ペクチンに加え、責化し得る炭素源、例えば
、アラビノース、キシロース、グルコース、マンノース
、フラクトース、蔗糖、乳糖、ソルビトール、マンニト
ール、イノシトール、グリセリン、可溶性デンプンや寅
化し得る有機酸、例えば酢酸、クエン酸等が挙げられる
。

また、その他、リン酸、ＨＯ２＋　、　ＣＢ２＋　、　
Ｈｎ２＋　、　７ｎ２＋。

Ｃｏ２＋　、　Ｈａ十、　　に十などの無機塩や、必要
であれば、無機、有機微量栄養源を培地中に適宜添加す
ることもできる。

斯くして得られた培養物中からの目的物質であるセルラ
ーゼに−５３９の採取及び精製は、一般の酵素の採取及
び精製の手段に準じて行なうことが出来る。即ち、遠心
分離又は濾過等の通常の固液分離手段により菌体を培養
液から除去して粗酵素液を得ることが出来る。この粗酵
素液は、そのまま使用することも出来るが、必要に応じ
て、塩析法、沈澱法、限外か過払等の分離手段により粗
酵素を得、更に公知の方法により精製結晶化して、精製
酵素として使用することも可能である。

斯くして得られた本発明のアルカリセルラーゼに−５３
９は、以下に示す酵素学的性質を右する。なお、酵素活
性の測定は、以下の方法に従って行ない、また用いた緩
衝液は次の通りである。

ｐＨ３〜８　　　マクルベイン緩衝液 ｐ１１８〜１１　　グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液 １）１１１２〜１３　塩化カリウム−水酸化ナトリウム
緩衝液 酵素活性測定法： （１）ＣＭＣアーゼ活性 １０ｑＣＭＣ（Ａ−０１１，山陽国策バルブ社）、１０
０μｍｏｌ各種緩衝液（マクルベイン、リン酸、グリシ
ン−ＮａＯＨ等）を含む基質溶液０．９−に０．１ｄの
酵素溶液を加え、３０℃、２０分反応した。反応後、３
．５−ジニトロ−サリチル酸（３，５−ｄｉｎｉｔｒｏ
−ｓａｌｉｃｙｌｉｃ　ａｃｉｄ（ＤＮＳ）　）法にて
還元糖の定量を行った。すなわち、反応液１．０ｄにＤ
ＮＳ試薬１．Ｏｄを加え、５分間、１００℃で加熱発色
させ、冷却後、４．０　ｍの脱イオン水を加えて希釈し
た。これを波長５３５ｎｍで比色定潰した。酵素力価は
、上記の条件下で１分間に１μｓｏｌのグルコースに相
当する還元糖を生成１゛る酵素量を１単位とした。

（２）ｐ−ニトロフェニルセロビオシド分解活性０．１
μｇｏａｌ　ｐ−ニトロフェニルセロビオシド（シグマ
社）、１００μｌｏｌ　リン酸緩衝液（ｎ１１７．０）
を含む反応液１．Ｏｄ巾に適当量の酵素液を３０℃テ作
用サセタ後、１８　Ｎ８２ＣＯ３を０．３　ａ！　。

脱イオン水を１．７ｍｌ！順次加え、遊離するｐ−ニト
ロフェノールを４００　ｎ１１で比色定置した。酵素力
価は、上記の条件下で１分間に１μｓｏｌのｐ−二トロ
フェノールを遊離させる酵素量を１単位とした。

（３）アビセル、セルロース粉末、及び濾紙分解活性 ２０ηアビセル（メルク社）、２００μｌｏｔリン酸ａ
ｍ液（ＩＩＩＨ７，０）を含む反応液２．Ｏｄ中に適当
量の酵素液を加え、３０℃、２５Ｏｒｐｍｔ’＠とうし
ながら作用させた。反応後、冷却遠心分離（５℃、３０
００ｒｐｍ　、２０分）を行い、その上清１．０ｄを３
，５−ジニトロ−サリチル酸（３゜５−ｄｉｎｉｔｒｏ
−ｓａｌｉｃｙｌｉｃ　ａｃｉｄ（ＤＮＳ）　）法にて
還元糖の定量を行った。セルロース粉末分Ｗ４活性はセ
ルロース粉末（東洋濾紙社）を、濾紙分解活性は濾紙（
セルラーゼ活性検定用濾紙、東洋随５１−特）を用い、
アビセラーゼ活性の時と同様に行った。酵素力価は、上
記の条件下で１分間に１μｓｏｌのグルコースに相当す
る還元糖を生成する酵素量を１単位とした。

（４）セロビアーゼ活性 １０９セロビオース（関東化学社）、１００μｍｏｌリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７，０）を含む反応液１、Ｏｄ中に適
当量の酵素液を３０℃で作用させた後、１００℃、２分
処理し酵素を失活させた後、生成グルコース量をムロタ
ーゼ・ＧＯＤ法（Ｇｌｕｃｏｓｅ　Ｃ−Ｔｅ５ｔ、和光
純薬工業社）で測定した。

酵素力価は、上記の条件下で１分間に２μｓｏｌのグル
コースを生成する酵素量を１単位とした。

（酵素学的性質） （１）作用 セルロース、濾紙、アビセル、ＣＭＣ等のｉｎｓ素によ
く作用し、これらを溶解せしめ、グルコース等の還元糖
を生成する。

（２）基質特異性 本酵素はＣＭＣの他にも、セルロース粉末、アビセル、
濾紙及びｐ−ニトロフェニルセロビオシドに対する活性
を有していた。

（３）作用ｐＨ及び最適ｐＨ 作用ｐ＋＋範囲は、３〜１２，５と極めて広範囲に才た
る。最適ｐＨは、７であり、４〜１１の範囲にかいても
至適ｐＨに於ける活性の５０％以上の相対に性を有して
おり、過去に研究されたセルラーゼσ中でも最もアルカ
リ側で作用ｐＨ範囲が広い酵素２言える（第１図）。

（４）ｐＨ安定性 ゛各々のｐｌ＋で３０℃、１時間保持した後の残存り性
を測定し、ｐＨ安定性を調べた。その結果、ｐ１１５〜
１２で極めて安定で失活せず、ｐＨ３，５〜１２．５に
於いても、約５０％以上の活性を維持していた。

本酵素は、このように高アルカリ領域に於いても充分に
安定である（第２図）。

（５）　ｆｉｎ適温度 作用温僚は、１５〜８５℃の広範囲にわたり、その至適
温度は６０℃であった。又、４５〜７５℃の範囲に於い
ても、至適温度での活性の５０％以上を有していたく第
３図）。

（６）温度安定性 至適ｐＨに於いて、３０分間各温度で処理した模、）　
　残存活性を測定した結果、５０℃では安定してお：　
　リ、６０℃に於いても約５０％の残存活性を有しｉ　
　ていたく第４図）。

）（７）分子量 本酵素をセファデックスＧ−１００（“５ｅｐｈａ−ｄ
ｅｘＧ−１００°゛）によるゲル濾過法に基づき分子量
を測定したところ、約１．８万と約２．９万に主５　　
たるピークが観察された。

（８）金属イオンの影響 本酵素について、各種金属イオン（Ｍ３＋　、　Ｆ６３
＋。

Ｂａ２”　、　Ｃａ２＋　、　Ｃｄ２＋　、　Ｃｏ２＋
　、　Ｃｒ２＋　、　Ｃｕ２＋　、　Ｆｃ２÷。

１１ｇ”、　　Ｈｎ”、　　Ｎｏ”、　　ｍ”、　　Ｐ
ｂ”、　　Ｚｎ”、　　Ｌｉ十　。

に十、　Ｈａ”　）を活性測定時に共存させて、その影
響を検討したく各種金属イオン濃度は１ｍＨ，Ｋ”。

Ｈａ十は５ＱｍＨである）。

その結果、Ｈｇ２＋で阻害が、Ｃａ”　、　Ｃｄ２÷、
Ｂａ２＋１．：より活性化が認められた。

（９）界面活性剤の影響 各種界面活性剤（例えば、ＬＡＳ、Ａｓ、ＥＳ。

ＡＯ８，α−３ＦＥＳＳＡＳ、石鹸、ポリオキシエヂレ
ンセカンダリーアルキルエーテル）の酵素活性に及ぼす
影響を調べた。界面活性剤０．０５％溶液で３０℃、１
５分間処理後、活性測定を行った。その結果、何れの界
面活性剤によってもほとんど阻害を受けなかった。強力
なデタージエントであるソデイウム・ドデシルサルフェ
ートによっても活性の阻害は認められなかった。

（１０）プロテアーゼ耐性 洗剤用プロテアーゼ、例えばＡＰＩ−２１（昭和電工）
、マクサターゼ（ギスト社）及びアルカラーｔ！（ノボ
社）を、活性測定時に共存（０，１１Ｒｇ／ｄ）させて
その影響を調べたところ、何れのプロテアーゼに対して
も強い耐性を有することがわかった。

（１１）キレート剤の影響 キレート剤であるＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、クエン酸、ゼオ
ライト、トリポリリン酸ソーダを活性測定時に共存させ
、その影響を検討したが、はとんど阻害は認められなか
った。

〔発明の効果〕

本発明のセルラーゼに−５３９は、至適ｐＨを７に有す
るにもかかられず高アルカリのｐｔｌｌｏにおいても最
適ｐＨの８０％以上、Ｉ）Ｈｌｌに於いても６０％以上
の相対活性を有し、ｐ１１５〜１２に於て極めて安定で
ある。また、界面活性剤、プロテアーゼ、キレート剤等
の洗浄剤配合成分によってもほとんど阻害を受けない。

したがって、本酵素は洗浄剤組成物の配合成分として有
利に使用することができるものである。

また、本発明の菌株、バチルス　エスピーＫＳＭ−５３
９は中性で生育する菌株であるので、好アルカリ性１１
１１１と比べ容易にアルカリ耐性セルラーゼを工業的に
生産することができる。

（実施例〕 以下、実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明する。

実施例１ 栃木県芳賀郡市貝町の土壌を薬匙一杯（約０．５９）を
滅菌生理食塩水に懸濁し、８０℃で１０分間熱処理した
。この熱処理液の上清を適当に希釈して、分離用寒天培
地（培地１）に塗布した。次いで、これを３０℃にて３
日間培養し、集落を形成させた。集落の周囲にＣＭＣの
溶解に基づく透明帯を形成するものを選出し、ＣＭＣア
ーゼ生産菌を取得した。更に、取得菌を培地２の液体培
地に接種し、３０℃で３日間振盪培養した。培養後、遠
心分離した上清液についてＣＭＣアーゼ活性を、ｐ］１
３〜１３にて測定し、アルカリ耐性セルラーゼ生産菌を
スクリーニングした。

上述の方法により、本発明のバチルス　エスピー　ＫＳ
Ｍ−５３９株（ＦＥＲＭ　　Ｐ−９０１１）を取得する
ことが出来た。

培地１．　　ＣＭＣ２％ ポリペプトン　　　　　　　　０．５％醇母エキス　　
　　　　　　　０．０５％ＫＨ２ＰＯ４０，１％ Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２００，２５％ＭｇＳＯ４・７
Ｈ２００，０２％ 培地２．　　ＣＭｏ　　　　　　　　　１％ポリペプト
ン　　　　　　　　１％ 酵母エキス　　　　　　　　　０．５％ＫＨ２ＰＯａ　
　　　　　　　　Ｏ，１％Ｎａｚ　ＨＰＯａ・１２Ｈ２
００，２５％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，０２％ １）！１　６．８ 実施例２ 実施例１で得たバチルス　エスピー　ＫＳＭ−５３９を
実施例１の液体培地２に接種し、３０℃で３日間振盪培
養した。培養後、菌体を遠心分離して除き、粗酵素液を
得た。この粗酵素液１１に対して、ドライアイス−エタ
ノール中で３１のエタノールを加え、生じた沈澱を遠心
分離し更に凍結乾燥を行ない乾燥粉末としてセルラーゼ
に−５３９９９（比活性２６単位／！？；１）８９にお
ける測定値以下同じ）を得た。

実施例３ 液体培地２においてＣＭＣを１％蔗糖に、ポリペプトン
を７％Ｃ３Ｌ（コーン・スチープ・リカー）に代えた培
地を用い、実施例２に準じて３０℃で２日間振盪培養し
た。得られた培養液の遠心分離上清についてそのＣＭＣ
アーゼ活性を測定したところ４０単位／ｉであった。

【図面の簡単な説明】

第１図は、酵素反応ｐｕと相対活性の関係を示す図面で
ある。 第２図は、酵素処理ｐｌ＋と相対活性の関係を示す図面
である。 第３図は、酵素反応温度と相対活性の関係を示す図面で
ある。 第４図は、酵素処理温度と相対活性の関係を示す図面で
ある。 以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、次の酵素学的性質を有するアルカリ耐性のセルラー
   ゼＫ−５３９。 （１）作用 カルボキシメチルセルロース、セルロース、ろ紙、アビ
   セル等の繊維素によく作用し、これらを溶解せしめ、グ
   ルコース等の還元糖を生成する。 （２）基質特異性 カルボキシメチルセルロースの他にも、セルロース粉末
   、アビセル、濾紙及びｐ−ニトロフェニルセロビオシド
   に対する活性を有する。 （３）作用ｐＨ及び最適ｐＨ 作用ｐＨ範囲は、３〜１２．５である。最適ｐＨは、７
   であり、４〜１１の範囲に於いても至適ｐＨに於ける活
   性の５０％以上の相対活性を有する。 （４）ｐＨ安定性 ｐＨ５〜１２で極めて安定で失活せず、ｐＨ３．５〜１
   ２．５に於いても、約５０％以上の活性を維持する。 （５）最適温度 作用温度は、１５〜８５℃の広範囲にわたり、その至適
   温度は６０℃である。また、４５〜７５℃の範囲に於い
   ても、至適温度での活性の５０％以上を有している。 （６）分子量 約１．８万と約２．９万に分子量のピークを有する（セ
   ファデックスＧ−１００を用いたゲルろ過法による）。 （７）金属イオンの影響 Ｈｇ＾２＾＋で阻害され、Ｃａ＾２＾＋、Ｃｄ＾２＾＋
   及びＢａ＾２＾＋により活性化される。 （８）界面活性剤の影響 ＬＡＳ、ＡＳ、ＥＳ、ＡＯＳ、α−ＳＦＥ、ＳＡＳ、石
   鹸、ポリオキシエチレンセカンダリ−アルキルエーテル
   は、活性をほとんど阻害しない。 （９）プロテアーゼ耐性 プロテアーゼに対して耐性を有する。 （１０）キレート剤の影響 ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、トリポリリン酸ソーダ、ゼオライ
   ト、クエン酸は活性を阻害しない。 ２、バチルス属に属し、セルラーゼＫ−５３９生産性を
   有する微生物。