DE3751270T2 - Alkali-resistente Cellulasen und Mikroorganismen, fähig zu ihrer Herstellung. - Google Patents

Alkali-resistente Cellulasen und Mikroorganismen, fähig zu ihrer Herstellung.

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DE3751270T2
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Hajime Mori
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Description

    Hintergrund der Erfindung 1. Gebiet der Erfindung
  • Die Erfindung betrifft neue alkaliresistente Cellulasen und ebenfalls Mikroorganismen, die in der Lage sind, dieselben zu erzeugen.
    • 2. Beschreibung des Standes der Technik
  • Die Entwicklung von Cellulasen, die Cellulose zersetzende Enzyme sind, wurde für den hauptsächlichen Zweck ausgeführt, um in wirksamer Weise Biomasseressourcen, insbesondere Celluloseressourcen, auszunutzen. Eine Vielzahl von Stämmen wurde isoliert, wie Cellulase erzeugende Pilze und Bakterien, einschließlich beispielsweise nicht nur Schimmelpilzen der Gattung Aspergillus, Penicillium, Trichoderma, Fusarium, Humicola, Acremonium und dergleichen, sondern auch Bakterien der Gattung Pseudomonas, Cellulomonas, Ruminococcus, Bacillus und dergleichen und Actinomyceten der Gattung Streptomyces, Thermoactinomyces und dergleichen. Bislang sind jedoch Cellulasen für Biomassen häufig nicht im industriellen Maßstab verwendet worden.
  • Andererseits wurden Untersuchungen zur neuen industriellen Ausnutzbarkeit von Cellulasen als Bestandteile für Waschmittel für Kleidung ausgeführt, denen nun Aufmerksamkeit geschenkt wird (Japanische Patentveröffentlichung Nrn. 59- 49279, 60-23158 und 60-36240) . Die meisten durch Mikroorganismen erzeugten Cellulasen in der Natur werden als sogenannte neutrale oder saure Cellulasen klassifiziert, die eine optimale und stabile enzymatische Aktivität im neutralen bis sauren Bereich zeigen. Nur wenige Cellulasen sind sogenannte alkalische Cellulasen, die den Erfordernissen für die Formulierung in Waschmitteln für Textilien genügen oder die eine maximale Aktivität im alkalischen pH-Bereich zeigen können, und sind sogenannte alkaliresistente Cellulasen, die eine Alkaliresistenz aufweisen. Der Ausdruck "alkalische Cellulase", der hier verwendet wird, bedeutet eine Cellulase, deren optimaler pH-Bereich im alkalischen Bereich liegt und der Ausdruck "alkaliresistente Cellulase" bedeutet eine Cellulase, deren optimaler pH-Bereich zwar im neutralen bis sauren Bereich liegt, jedoch zufriedenstellende Aktivität im alkalischen Bereich, verglichen mit der Aktivität beim optimalen pH-Wert aufweist und stabil bleibt.
  • Der Ausdruck "neutral" bedeutet einen pH-Bereich von 6 bis 8 und der Ausdruck "alkalisch" bedeutet einen höheren pH-Bereich.
  • Zur Herstellung von alkalischen Cellulasen und alkaliresistenten Cellulasen, die in Waschmitteln für Bekleidung geeignet sind, wurden verschiedene Verfahren vorgeschlagen. Diese Verfahren schließen beispielsweise ein Verfahren zum Sammeln von Cellulase A durch Züchten alkalophiler Bazillen (Japanische Patentveröffentlichung Nr. 50-28515), ein Verfahren zur Erzeugung alkalischer Cellulase 301-A durch Züchten eines alkalophilen Bakteriums, zugehörig zur Gattung Cellulomonas (Japanische Patentanmeldung Offenlegungs-Nr. 58- 224686), ein Verfahren zur Erzeugung von Carboxymethylcellulase durch Züchten eines alkalophilen Bacillus Nr. 1139 (Fukumori, F., Kudo T. und Horikoshi, K., J. Gen. Microbiol., 131, 3339, (1985) und ein Verfahren zur Erzeugung einer alkalischen Cellulase unter Verwendung eines Stammes, zugehörig zur Gattung Streptomyces (Japanische Patentanmeldung Offenlegungs-Nr. 61-19483) ein. Diese Verfahren sind jedoch alle für industrielle Fermentationsverfahren ungeeignet.
  • In den letzten Jahren fanden wir, daß Bacillus sp. KSM-635 (FERM BP-1485), der ein alkalophiles Bakterium darstellt, wirksam alkalische Cellulase K erzeugt, die als Bestandteil für Textilwaschmittel geeignet ist und daß die geeignete Auswahl an Züchtungsbedingungen es ermöglicht, die Produktivität zu erhöhen und eine industrielle Fermentationsproduktion von alkalischer Cellulase auszuführen (siehe EP-A-0 271 004).
  • Die Züchtungsbedingungen von Bacillus sp. KSM-635 sind jedoch aus industrieller Sicht nicht immer vorteilhaft. Insbesondere sollte ein alkalophiler Stamm unter alkalischen pH-Bedingungen gezüchtet werden. Ein sogenanntes alkalisches Fermentationsverfahren unter Verwendung von alkalophilen Stämmen wurde jüngst entwickelt und vollständige Kenntnis über die physiologischen und biochemischen Eigenschaften dieser alkalophilen Mikroorganismen darum noch nicht erhalten. Diese Schwierigkeiten sind der Zubereitung von Medien und der Züchtungsart, die industrieller Produktion durch Fermentation genügen sollen, eigen.
  • Molekulares Klonen eines Cellulasegens von Bacillus subtilis und dessen Expression in Escherichia coli wurde von Y. Koide et al., (Agric. Biol. Chem. 50 (1), 233 bis 237 (1986)) beschrieben. Die in dieser Druckschrift beschriebene Cellulase wird bei einem pH von 10 in einem Ausmaß von etwa 60 % ihrer maximalen Aktivität inaktiviert.
    • Zusammenfassung der Erfindung
  • Um die vorstehend genannten Probleme zu lösen, führten die Autoren der vorliegenden Erfindung ausgedehnte Untersuchungen aus, um neutrale Bakterien zu erhalten, die in der Lage sind, entweder alkalische Cellulase mit einem optimalen pH in einem alkalischen Bereich oder alkaliresistente Cellulasen, die eine hohe Aktivität im alkalischen Bereich, verglichen mit der maximalen Aktivität bei einem optimalen pH- Wert, beibehalten, zu erhalten. Zu diesem Zweck untersuchten sie intensiv Stamme in der Natur, wobei sie sogenannte Genrekombination ausführten, bei der ein Stamm, der in einem natürlichen Bereich wächst, als Wirt verwendet wurde und ein entsprechendes Cellulasegen kloniert wurde. Im Ergebnis fanden sie, daß eine Reihe von Mikroorganismen, zugehörig zur Gattung Bacillus, alkaliresistente Cellulasen erzeugen kann, obwohl sie in neutralen Medien wachsen.
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine alkaliresistente Cellulase bereit, die von einem Mikroorganismus erzeugt wird, der zur Gattung Bacillus gehört und in neutralem Medium wächst, wobei die Cellulase nachstehende enzymatische Eigenschaften aufweist:
  • (1) weist einen optimalen pH-Bereich von 5 bis 7 auf,
  • (2) ist sehr stabil (wird nicht bei einem pH-Wert von 5 bis 10 mit einer Restaktivität von nicht weniger als 50 % der maximalen Aktivität, die in einem pH-Bereich von 4,5 bis 11 gezeigt wird, inaktiviert),
  • (3) die Aktivität wird durch die Gegenwart von Hg²+ inhibiert und
  • (4) die Aktivität wird kaum durch Proteinasen, Tenside und chelatbildende Mittel inhibiert.
    • Kurzbeschreibung der Zeichnungen
  • Figur 1 ist eine Graphik, die die Beziehung zwischen dem pH-Wert für die Enzymreaktion von alkaliresistenter Cellulase K-534 und der relativen Aktivität zeigt:
  • Figur 2 ist eine Graphik, die die Beziehung zwischen dem Behandlungs-pH-wert des vorstehenden Enzyms und der Restaktivität zeigt;
  • Figur 3 ist eine Graphik, die die Beziehung zwischen der Reaktionstemperatur des vorstehenden Enzyms und der relativen Aktivität zeigt;
  • Figur 4 ist eine Graphik, die die Beziehung zwischen der Behandlungstemperatur des vorstehenden Enzyms und der Restaktivität zeigt;
  • Figur 5 ist eine Graphik, die die Beziehung zwischen dem pH-Wert für die enzymatische Reaktion der alkaliresistenten Cellulase K-344 und der relativen Aktivität zeigt;
  • Figur 6 ist eine Graphik, die den Behandlungs-pH für K-344 und die Restaktivität zeigt;
  • Figur 7 ist eine Graphik, die die Reaktionstemperatur für K-344 und die relative Aktivität zeigt;
  • Figur 8 ist eine Graphik, die die Behandlungstemperatur für K-344 und die Restaktivität zeigt;
  • Figur 9 ist eine Graphik, die die Beziehung zwischen dem pH für die enzymatische Reaktion von alkaliresistenter Cellulase K-539 und der relativen Aktivität zeigt;
  • Figur 10 ist eine Graphik, die die Beziehung zwischen dem Behandlungs-pH für K-539 und der Restaktivität zeigt;
  • Figur 11 ist eine Graphik, die die Beziehung zwischen der Reaktionstemperatur für K-539 und der relativen Aktivität zeigt;
  • Figur 12 ist eine Graphik, die die Beziehung zwischen der Behandlungstemperatur für K-539 und der Restaktivität zeigt;
  • Figur 13 ist eine Graphik, die die Beziehung zwischen dem pH für die Enzymreaktion der alkaliresistenten Cellulase K-577 und der relativen Aktivität zeigt;
  • Figur 14 ist eine Graphik, die die Beziehung zwischen dem Behandlungs-pH für K-577 und der Restaktivität zeigt;
  • Figur 15 ist eine Graphik, die die Beziehung zwischen der Reaktionstemperatur für K-577 und der relativen Aktivität zeigt;
  • Figur 16 ist eine Graphik, die die Beziehung zwischen der Behandlungstemperatur für K-577 und der Restaktivität zeigt;
  • Figur 17 ist eine Graphik, die die Beziehung zwischen dem pH für die enzymatische Reaktion der alkalischen Cellulase K-588 und der relativen Aktivität zeigt;
  • Figur 18 ist eine Graphik, die die Beziehung zwischen dem Behandlungs-pH für K-588 und der Restaktivität zeigt;
  • Figur 19 ist eine Graphik, die die Beziehung zwischen der Reaktionstemperatur für K-588 und der relativen Aktivität zeigt;
  • Figur 20 ist eine Graphik, die die Beziehung zwischen der Behandlungstemperatur für K-588 und der Restaktivität zeigt;
  • Figur 21 ist eine Graphik, die die Beziehung zwischen dem pH für die Enzymreaktion von alkaliresistenter Cellulase K-597 und der relativen Aktivität zeigt;
  • Figur 22 ist eine Graphik, die die Beziehung zwischen dem Behandlungs-pH für K-597 und der Restaktivität zeigt;
  • Figur 23 ist eine Graphik, die die Beziehung zwischen der Reaktionstemperatur für K-597 und der relativen Aktivität zeigt;
  • Figur 24 ist eine Graphik, die die Beziehung zwischen der Behandlungstemperatur für K-597 und der Restaktivität zeigt.
    • Beschreibung der Erfindung im einzelnen und bevorzugte Ausführungsformen
  • Beispiele für Mikroorganismen, die in der Lage sind, die alkaliresistenten Cellulasen der Erfindung zu erzeugen, sind Stämme, isoliert von den Autoren der vorliegenden Erfindung aus Böden von Haga-gun und Nikko-shi in Tochigi-ken, Japan, und hinterlegt beim Fermentation Research Institute of Japan als Bacillus sp. KSM-534 (FERM BP-1508), Bacillus sp. KSM-344 (FERM BP-1506), Bacillus sp. KSM-539 (FERM BP-1509), Bacillus sp. KSM-577 (FERM BP-1510), Bacillus sp. KSM-588 (FERM BP-1513) und Bacillus sp. KSM-597 (FERM BP-1514).
  • Diese Stämme haben die nachstehenden mykologischen Eigenschaften. Es sollte angeführt werden, daß die Identifizierung der Stämme unter Verwendung der nachstehenden Medien ausgeführt wurde.
  • Medium 1: Fleischextrakt, 1,0; Bactopepton, 1,0; NaCl, 0,5; Bacto agar, 1,5 (pH 7,2) (alle durch Gew.-% ausgewiesen, hier und auch forthin).
  • Medium 2: Fleischextrakt, 1,0; Bacto pepton, 1,0; NaCl, 0,5 (pH 7,2)
  • Medium 3: Fleischextrakt, 1,0; Bacto pepton, 1,0; NaCl, 0,5; Gelatine, 1,0 (pH 7,2)
  • Medium 4: Bacto Lackmusmilch, 10,0
  • Medium 5: Bacto pepton, 1,0; KNO&sub3;, 0,1
  • Medium 6: Bacto pepton, 1,0; NaNO&sub3;, 0,1
  • Medium 7: Bacto pepton, 0,7; NaCl, 0,5; Glucose, 0,5 (pH 7,0)
  • Medium 8: Bacto pepton, 1,0
  • Medium 9: TSI agar (von Eiken Chem. Co., Ltd.); ausgewiesene Menge
  • Medium 10: Fleischextrakt, 1,0; Bacto pepton, 1,0; NaCl, 0,5; lösliche Stärke, 0,2; Agar, 1,5
  • Medium 11: NaNH&sub4;HPO&sub4; 4H&sub2;O, 0,15; KH&sub2;PO&sub4;, 0,1; MgSO&sub4; 7H&sub2;O, 0,02; Natriumcitrat, 0,25 (pH 6,8)
  • Medium 12: Christensen's Medium (Eiken Chem. Co., Ltd.) ; ausgewiesene Menge
  • Medium 13: Glucose, 1,0; KH&sub2;PO&sub4;, 0,1; MgSO&sub4; 7H&sub2;O, 0,05; KCl, 0,02; Stickstoffquellen, 0,1 (die Stickstoffquellen, die verwendet wurden, waren Natriumnitrat und Ammoniumsulfat). (pH 7,2)
  • Medium 14: King A Medium "Eiken" (Eiken Chem. Co., Ltd.); ausgewiesene Menge
  • Medium 15: King B Medium "Eiken" (Eiken Chem. Co., Ltd.) ausgewiesene Menge
  • Medium 16: Harnstoffmedium "Eiken" (Eiken Chem. Co., Ltd.); ausgewiesene Menge
  • Medium 17: Filterpapier für Cytochromoxidasetest (Nisshui Pharm. Co., Ltd.)
  • Medium 18: 3 %-ige Wasserstoffperoxidlösung in Wasser
  • Medium 19: OF Basalmedium (Difco Lab.); ausgewiesene Menge
  • Medium 20: (NH&sub4;)&sub2;HPO&sub4;, 0,1; KCl, 0,02; MgSO&sub4; 7H&sub2;O, 0,02; Hefeextrakt, 0,02; Bacto agar, 2,0; BCP (0,2 %-ige Lösung), 0,4
  • Medium 21: Bacto Sabouraud's Dextrose Agarmedium (Difco Lab.); ausgewiesene Menge
  • Medium 22: Fleischextrakt, 0,3; Bacto pepton, 0,5; Hefeextrakt, 1,0; Glycerin, 2,0
  • Medium 23: Phenylalaninmalonsäuresalzmedium (Nissui Pharm. Co., Ltd.) ; ausgewiesene Menge
  • Medium 24: Magermilch, 5,0; Bacto agar, 1,5
  • Medium 25: Fleischextrakt, 0,3; Bacto pepton, 0,5; L- Tyrosin, 0,5; Bacto agar, 1,5
  • Medium 26: Bacto pepton, 1,0; NaNO&sub3;, 0,1
  • Medium 27: Simon's Medium (Eiken Chem. Co., Ltd.); ausgewiesene Menge
  • (Mykologische Eigenschaften)
    • Bacillus sp. KSM-534: (a) Ergebnisse der mikroskopischen Beobachtung
  • Dies ist ein Bazillus mit einer Körperform von 0,4 bis 0,8 um x 1,5 bis 6,0 um und mit einem zylindrischen oder ellipsoiden Endosporium (0,6 bis 0,8 um x 1,0 bis 2,5 um) in der Mitte des Körpers. Der Bazillus hat Randgeißeln und ist beweglich. Die Gramfärbung ist positiv. Er ist nicht urikämisch.
    • (b) Wachstumszustand bei verschiedenen Medien
  • (1) Fleischbrühenagarkulturen (Medium 1)
  • Der Wachstumszustand ist schwach. Die Kolonien sind von runder Form mit glattem Rand. Der Farbton der Kolonien ist leicht gelb, halbdurchsichtig und glänzend.
  • (2) Fleischbrühenagarschrägkultur (Medium 1)
  • Das Wachstum ist schwach, beim Aussehen wie ein ausgebreitetes Gewebe, das glänzend ist, die Farbe ist schwach gelb und halbdurchsichtig.
  • (3) Fleischbrühenflüssigkultur (Medium 2)
  • Wächst auf und wird trüb.
  • (4) Fleischbrühengelatinestichkultur (Medium 3)
  • Wächst in der Oberflächenschicht auf, wobei Gelatine verflüssigt wird.
  • (5) Lackmusmilchkultur (Medium 4)
  • Verflüssigung der Milch wird beobachtet. Eine deutliche Änderung der Lackmusfarbe wird nicht beobachtet.
    • (c) Physiologische Eigenschaften
  • (1) Verminderung und Denitrifizierung der Reaktionen von Nitrat (Medium 5 und 6) sind beide negativ.
  • (2) MR-Test (Medium 7)
  • Es ist nicht klar, ob der Test negativ oder positiv verlaufen ist (pH 5,2).
  • (3) VP-Test (Medium 7)
  • Es ist nicht klar, ob der Test negativ oder positiv verlaufen ist (pH 5,2).
  • (4) Bildung von Indol (Medium 8) negativ
  • (5) Bildung von Schwefelwasserstoff (Medium 9) negativ
  • (6) Hydrolyse von Stärke (Medium 10) positiv
  • (7) Nutzung von Zitronensäure (Medium 11, 12)
  • positiv, sowohl in Koser's Medium als auch in Christensen's Medium
  • (8) Nutzung von anorganischen Stickstoffquellen (Medium 13)
  • Sowohl Nitrat als auch Ammoniumsalz werden genutzt.
  • (9) Bildung von Pigment (Medium 14, 15) negativ
  • (10) Urease (Medium 16) negativ
  • (11) Oxidase (Medium 17) positiv
  • (12) Catalase (Medium 18) positiv
  • (13) Temperatur- und pH-Bereiche zum Wachstum (Medium 2)
  • Der Temperaturbereich zum Wachstum beträgt 15 bis 50ºC und ein optimaler Temperaturbereich ist 25 bis 40ºC.
  • Der pH-Bereich für das Wachstum beträgt 5 bis 11 und ein optimaler pH-Bereich beträgt 6 bis 10.
  • (14) Verhalten gegenüber Sauerstoff: wahlweise anaerob.
  • (15) O-F-Test (Medium 19)
  • Wächst aerob oder anaerob mit Gaserzeugung auf.
  • (16) Nutzung von Zuckern (Medium 20) (+: wird genutzt; -: wird nicht genutzt)
  • 1. L-Arabinose ±
  • 2. D-Xylose -
  • 3. D-Glucose +
  • 4. D-Mannose -
  • 5. Fructose +
  • 6. D-Galactose +
  • 7. Maltose +
  • 8. Saccharose +
  • 9. Lactose +
  • 10. Trehalose -
  • 11. D-Sorbit +
  • 12. D-Mannit -
  • 13. Inosit +
  • 14. Glycerin +
  • 15. Stärke +
  • (17) pH in VP-Medium (Medium 7)
  • pH 5,2
  • (18) Wachstum in salzenthaltenden Medien, modifiziertes Medium 1) wächst bei 5 %; wächst bei 7 %, wächst nicht bei 10 %.
  • (19) Wachstum bei pH 5,7 (Medium 21) wächst.
  • (20) Bildung von Dihydroxyaceton (Medium 22) negativ
  • (21) Desaminierung von Phenylalanin (Medium 23) negativ
  • (22) Zersetzung von Casein (Medium 24) positiv
  • (23) Zersetzung von Tyrosin (Medium 25) negativ
    • Bacillus sp. KSM-344: (a) Ergebnisse der mikroskopischen Beobachtung
  • Dies ist ein Bazillus mit einer Körperform von 0,6 bis 0,8 um x 1,5 bis 6,5 um, der ein zylindrisches oder ellipsoides Endosporium (0,6 bis 1,2 um x 2,0 bis 4,0 um) im Zentrum des Körpers aufweist. Er hat keine Geißeln und ist beweglich. Die Gramfärbung ist positiv; nicht urikämisch.
    • (b) Wachstumsstadium auf verschiedenen Medien
  • (1) Fleischbrühenagarplattenkultur (Medium 1)
  • Der Wachstumszustand ist mäßig. Die Form der Kolonien ist kreisförmig oder unregelmäßig mit einer glatten oder rauhen Oberfläche und einem glatten oder wellenförmigen Rand. Der Farbton der Kolonien ist weiß und die Kolonien sind halbtransparent und der Glanz ist ziemlich matt.
  • (2) Fleischbrühenagarschrägkultur (Medium 1)
  • Das Wachstum ist mäßig und der Zustand ist eine gewebeähnlich ausgebreitete Form und ist glänzend, weiß in der Farbe und halbdurchsichtig.
  • (3) Fleischbrühenflüssigkultur (Medium 2)
  • Wächst. Obwohl kein Wachstum an der Oberfläche beobachtet wird, wird Wachsen auf der oberen Schicht beobachtet.
  • (4) Fleischbrühengelatinestichkultur (Medium 3)
  • Wächst im Oberflächenbereich. Die Verflüssigung der Gelatine wird beobachtet.
  • (5) Lackmusmilchkultur (Medium 4)
  • Die Verflüssigung der Milch wird beobachtet, jedoch unterliegt die Lackmusfarbe nicht einer deutlichen Änderung.
    • (c) Physiologische Eigenschaften
  • (1) Reduktion und Denitrifizierungsreaktionen von Nitraten (Medien 5, 6). Die Reduktion des Nitrats ist positiv und die Denitrifizierung ist negativ.
  • (2) MR-Test (Medium 7)
  • Es ist nicht klar, ob der Test negativ oder positiv verlaufen ist (ph 5,2).
  • (3) VP-Test (Medium 7)
  • Es ist nicht klar, ob der Test negativ oder positiv verläuft (pH 5,2).
  • (4) Bildung von Indol (Medium 8) negativ
  • (5) Bildung von Schwefelwasserstoff (Medium 9) negativ
  • (6) Hydrolyse von Stärke (Medium 10) positiv
  • (7) Nutzung von Zitronensäure (Medien 11, 12) positiv, sowohl in Koser's Medium als auch in Christensen s Medium
  • (8) Nutzung von anorganischen Stickstoffquellen (Medium 13)
  • Nutzung sowohl von Nitrat, als auch Ammoniumsalz.
  • (9) Bildung von Pigment (Medien 14, 15) negativ
  • (10) Urease (Medium 16) negativ
  • (11) Oxidase (Medium 17) positiv
  • (12) Catalase (Medium 18) positiv
  • (13) Temperatur- und pH-Bereiche zum Wachstum (Medium 2)
  • Der Temperaturbereich zum Wachstum beträgt 15 bis 50ºC und ein optimaler Temperaturbereich ist 25 bis 40ºC.
  • Der pH-Bereich für das Wachstum beträgt 5 bis 9 und ein optimaler pH liegt im Bereich von 6 bis 9.
  • (14) Verhalten gegenüber Sauerstoff: wahlweise anaerob.
  • (15) O-F-Test (Medium 19)
  • Wächst entweder aerob oder anaerob unter Gasentwicklung auf.
  • (16) Nutzung von Zuckern (Medium 20) (+: wird genutzt; -: wird nicht genutzt)
  • 1. L-Arabinose +
  • 2. D-Xylose +
  • 3. D-Glucose +
  • 4. D-Mannose +
  • 5. Fructose +
  • 6. D-Galactose +
  • 7. Maltose +
  • 8. Saccharose +
  • 9. Lactose
  • 10. Trehalose +
  • 11. D-Sorbit +
  • 12. D-Mannit +
  • 13. Inosit +
  • 14. Glycerin +
  • 15. Stärke +
  • (17) pH in VP-Medium (Medium 7) pH 5,2
  • (18) Wachstum in salzenthaltenden Medien, modifiziertes Medium 1) wächst bei 5 %; wächst bei 7 %, wächst bei 10 %.
  • (19) Wachstum bei pH 5,7 (Medium 21) wächst.
  • (20) Bildung von Dihydroxyaceton (Medium 22) negativ
  • (21) Desaminierung von Phenylalanin (Medium 23) negativ
  • (22) Zersetzung von Casein (Medium 24) positiv
  • (23) Zersetzung von Tyrosin (Medium 25) negativ
    • Bacillus sp. KSM-539: (a) Ergebnisse der mikroskopischen Beobachtung
  • Dies ist ein Bazillus mit einer Körperform von 0,4 bis 0,8 um x 1,5 bis 6,5 um, mit einem zylindrischen oder ellipsoiden Endosporium (0,6 bis 0,8 pm x 1,0 bis 2,5 um) in der Mitte des Körpers. Er hat Geißeln und ist beweglich. Gramfärbung ist positiv. Nicht urikämisch.
    • (b) Wachstumszustand in verschiedenen Medien
  • (1) Fleischbrühenagarkulturen (Medium 1)
  • Der Wachstumszustand ist mangelhaft. Die Form der Kolonien ist kreisförmig, mit glatter Fläche und glatten Rand. Der Farbton der Kolonien ist leicht gelb und die Kolonien sind halbdurchsichtig und glänzend.
  • (2) Fleischbrühenagarschrägkultur (Medium 1)
  • Das Wachstumszustand ist mangelhaft. Der Wachstumszustand ist in einer Gewebetuch ausgebreiteten Form und glänzend und ist leicht gelb und halbdurchlässig.
  • (3) Fleischbrühenflüssigkultur (Medium 2)
  • Schwaches Wachstum.
  • (4) Fleischbrühengelatinestichkultur (Medium 3)
  • Wächst im Oberflächenbereich. Verflüssigung von Gelatine ist feststellbar.
  • (5) Lackmusmilchkultur (Medium 4)
  • Die Verflüssigung der Milch wird beobachtet. Die Lackmusfarbe unterliegt keiner deutlichen Änderung.
    • (c) Physiologische Eigenschaften
  • (1) Reduktion und Denitrifizierungsreaktionen von Nitraten (Medien 5, 6). Beide negativ.
  • (2) MR-Test (Medium 7)
  • Es ist nicht klar, ob der Test negativ oder positiv verläuft (pH 5,2).
  • (3) VP-Test (Medium 7)
  • Es ist nicht klar, ob der Test negativ oder positiv verläuft (pH 5,2).
  • (4) Bildung von Indol (Medium 8) negativ
  • (5) Bildung von Schwefelwasserstoff (Medium 9) negativ
  • (6) Hydrolyse von Stärke (Medium 10) positiv
  • (7) Nutzung von Zitronensäure (Medien 11, 12)
  • sowohl in Koser's Medium als auch in Christensen's Medium positiv.
  • (8) Nutzung von anorganischen Stickstoffquellen (Medium 13)
  • Nutzung sowohl von Nitrat, als auch Ammoniumsalz.
  • (9) Bildung von Pigment (Medien 14, 15) negativ
  • (10) Urease (Medium 16) negativ
  • (11) Oxidase (Medium 17) positiv
  • (12) Catalase (Medium 18) positiv
  • (13) Temperatur- und pH-Bereiche zum Wachstum (Medium 2)
  • Der Temperaturbereich zum Wachstum beträgt 15 bis 50ºC und ein optimaler Temperaturbereich ist 25 bis 40ºC.
  • Der pH-Bereich für das Wachstum beträgt 5 bis 11 und ein optimaler pH-Bereich beträgt 6 bis 10.
  • (14) Verhalten gegenüber Sauerstoff: wahlweise anaerob.
  • (15) O-F-Test (Medium 19)
  • Wächst sowohl aerob, als auch anaerob.
  • (16) Nutzung von Zuckern (Medium 20) (+: wird genutzt; -: wird nicht genutzt)
  • 1. L-Arabinose +
  • 2. D-Xylose +
  • 3. D-Glucose +
  • 4. D-Mannose +
  • 5. Fructose +
  • 6. D-Galactose
  • 7. Maltose
  • 8. Saccharose +
  • 9. Lactose +
  • 10. Trehalose
  • 11. D-Sorbit +
  • 12. D-Mannit +
  • 13. Inosit +
  • 14. Glycerin +
  • 15. Stärke +
  • (17) pH in VP-Medium (Medium 7) pH 5,2
  • (18) Wachstum in salzenthaltenden Medien, modifiziertes Medium 1)
  • wächst bei 5 %;
  • wächst bei 7 %,
  • wächst nicht bei 10 %.
  • (19) Wachstum bei pH 5,7 (Medium 21) wächst.
  • (20) Bildung von Dihydroxyaceton (Medium 22) negativ
  • (21) Desaminierung von Phenylalanin (Medium 23) negativ.
  • (22) Zersetzung von Casein (Medium 24) positiv
  • (23) Zersetzung von Tyrosin (Medium 25) negativ.
    • Bacillus sp. KSM-577: (a) Ergebnisse der mikroskopischen Beobachtung
  • Dies ist ein Bazillus mit einer Körperform von 0,4 bis 0,8 um x 1,0 bis 2,0 um, mit zylindrischem oder ellipsoidem Endosporium (0,4 bis 0,8 um x 0,8 bis 1,2 um) in der Mitte des Körpers. Er hat Randgeißeln und ist beweglich. Die Gramfärbung ist positiv. Nicht urikämisch.
    • (b) Wachstumszustand in verschiedenen Medien
  • (1) Fleischbrühenagarplattenkultur (Medium 1)
  • Der Wachstumszustand ist schlecht. Die Form der Kolonien ist kreisförmig mit glatter Oberfläche und glattem Rand. Der Farbton der Kolonien ist leicht gelb, halbdurchsichtig und glänzend.
  • (2) Fleischbrühenagarschrägkultur (Medium 1)
  • Das Wachstum ist schlecht und der Wachstumszustand ist in einer Gewebstuch ausgebreiteten Form und glänzend, die Farbe ist leicht gelb und ist halbdurchlässig.
  • (3) Fleischbrühenflüssigkultur (Medium 2)
  • Wächst. Insbesondere Wachstum in der oberen Schicht wird beobachtet.
  • (4) Fleischbrühengelatinestichkultur (Medium 3)
  • Wächst in den Oberflächenbereichen, Verflüssigung von Gelatine wird beobachtet.
  • (5) Lackmusmilchkultur (Medium 4)
  • Die Verflüssigung der Milch wird beobachtet, jedoch unterliegt die Lackmusfarbe keiner deutlichen Änderung.
    • (c) Physiologische Eigenschaften
  • (1) Reduktion und Denitrifizierungsreaktionen von Nitraten (Medien 5, 6): beide negativ.
  • (2) MR-Test (Medium 7) Es ist nicht klar, ob der Test negativ oder positiv verläuft (pH 5,2).
  • (3) VP-Test (Medium 7)
  • Es ist nicht klar, ob der Test negativ oder positiv verläuft (pHh 5,2).
  • (4) Bildung von Indol (Medium 8) negativ
  • (5) Bildung von Schwefelwasserstoff (Medium 9) negativ.
  • (6) Hydrolyse von Stärke (Medium 10) positiv.
  • (7) Nutzung von Zitronensäure (Medien 11, 12) positiv, sowohl in Koser's Medium als auch in Christensen's Medium
  • (8) Nutzung von anorganischen Stickstoffquellen (Medium 13)
  • Sowohl Nitrat als auch Ammoniumsalz werden genutzt.
  • (9) Bildung von Pigment (Medien 14, 15) negativ.
  • (10) Urease (Medium 16) negativ.
  • (11) Oxidase (Medium 17) positiv.
  • (12) Catalase (Medium 18) positiv.
  • (13) Temperatur- und pH-Bereiche zum Wachstum (Medium 2)
  • Der Temperaturbereich zum Wachstum beträgt 15 bis 50ºC und ein optimaler Temperaturbereich ist 25 bis 40ºC.
  • Der pH-Bereich für das Wachstum beträgt 5 bis 11 und ein optimaler pH-Bereich beträgt 6 bis 10.
  • (14) Verhalten gegenüber Sauerstoff: wahlweise anaerob.
  • (15) O-F-Test (Medium 19)
  • Wächst sowohl aerob, als auch anaerob.
  • (16) Nutzung von Zuckern (Medium 20) (+: wird genutzt; -: wird nicht genutzt)
  • 1. L-Arabinose +
  • 2. D-Xylose +
  • 3. D-Glucose +
  • 4. D-Mannose -
  • 5. Fructose +
  • 6. D-Galactose
  • 7. Maltose -
  • 8. Saccharose +
  • 9. Lactose -
  • 10. Trehalose -
  • 11 .D-Sorbit +
  • 12. D-Mannit +
  • 13. Inosit -
  • 14. Glycerin +
  • 15. Stärke +
  • (17) pH in VP-Medium (Medium 7)
  • pH 5,2
  • (18) Wachstum in salzenthaltenden Medien, modifiziertes Medium 1)
  • wächst bei 5 %;
  • wächst bei 7 %,
  • wächst nicht bei 10 %.
  • (19) Wachstum bei pH 5,7 (Medium 21) wächst.
  • (20) Bildung von Dihydroxyaceton (Medium 22) negativ.
  • (21) Desaminierung von Phenylalanin (Medium 23) negativ.
  • (22) Zersetzung von Casein (Medium 24) positiv.
  • (23) Zersetzung von Tyrosin (Medium 25) negativ.
    • Bacillus sp. KSM-588: (a) Ergebnisse der mikroskopischen Beobachtung
  • Dies ist ein Bazillus mit einer Körperform von 0,8 bis 1,0 um x 1,0 bis 5,0 um, mit ovalem oder zylindrischem Endosporium (0,8 bis 1,0 um x 1,0 bis 1,5 um), am Ende der Mitte des Körpers. Er hat keine Randgeißeln und ist nicht beweglich. Gram's-Färbung ist positiv. Nicht urikämisch.
    • (b) Wachstumszustand in verschiedenen Medien
  • (1) Fleischbrühenagarplattenkultur (Medium 1)
  • Die Form der Kolonien ist unregelmäßig mit einer groben Oberfläche und mit blattähnlichem und wellenförmig haargeformtem Rand. Der Farbton der Kolonien ist milchig weiß bis weißlich gelb, trüb, und die Kolonien sind in Filmform.
  • (2) Fleischbrühenagarschrägkultur (Medium 1) Das Wachstum ist mäßig und der Wachstumszustand ist in Form eines ausgebreiteten Gewebes. Die Kolonien sind milchig weiß in der Farbe und trüb.
  • (3) Fleischbrühenflüssigkultur (Medium 2)
  • Wächst.
  • (4) Fleischbrühengelatinestichkultur (Medium 3)
  • Wächst in Oberflächenbereichen. Verflüssigung an Gelatine wird beobachtet.
  • (5) Lackmusmilchkultur (Medium 4)
  • Die Verflüssigung der Milch wird beobachtet, jedoch unterliegt die Lackmusfarbe Verfärbung in der Tiefe der Kultur.
    • (c) Physiologische Eigenschaften
  • (1) Reduktion und Denitrifizierungsreaktionen von Nitraten (Medien 5, 6) positiv hinsichtlich der Reduktion des Nitrats und negativ hinsichtlich der Denitrifizierung.
  • (2) MR-Test (Medium 7)
  • positiv.
  • (3) VP-Test (Medium 7)
  • positiv.
  • (4) Bildung von Indol (Medium 8)
  • negativ.
  • (5) Bildung von Schwefelwasserstoff (Medium 9)
  • negativ.
  • (6) Hydrolyse von Stärke (Medium 10)
  • positiv.
  • (7) Nutzung von Zitronensäure (Medien 11, 12)
  • positiv in Christensen's Medium und nicht klar, ob positiv oder negativ in Koser's Medium.
  • (8) Nutzung von anorganischen Stickstoffquellen (Medium 13)
  • Sowohl Nitrat, als auch Ammoniumsalz werden genutzt.
  • (9) Bildung von Pigment (Medien 14, 15)
  • Bildung eines wasserlöslichen Gelbpigments in King B Medium.
  • (10) Urease (Medium 16)
  • positiv.
  • (11) Oxidase (Medium 17)
  • positiv.
  • (12) Catalase (Medium 18)
  • positiv.
  • (13) Temperatur- und pH-Bereiche zum Wachstum (Medium 2)
  • Der Temperaturbereich zum Wachstum beträgt 10 bis 50ºC und ein optimaler Temperaturbereich ist 20 bis 40ºC.
  • Der pH-Bereich für das Wachstum beträgt 5 bis 9 und ein optimaler pH-Bereich liegt bei 6 bis 8.
  • (14) Verhalten gegenüber Sauerstoff:
  • aerob.
  • (15) O-F-Test (Medium 19)
  • Oxidation.
  • (16) Bildung einer Säure und Gas aus Zuckern (Medium 20) (+: Bildung, -: keine Bildung) Bildung Bildung von Säure von Gas Bildung von Säure Bildung von Gas 1. L-Arabinose 2. D-Xylose 3. D-Glucose 4. D-Mannose 5. Fructose 6. D-Galactose 7. Maltose 8. Saccharose 9. Lactose 10.Trehalose 11.D-Sorbit 12.D-Mannit 13. Inosit 14. Glycerin 15. Stärke
  • (17) pH in VP-Medium (Medium 7)
  • pH 5,4
  • (18) Wachstum in salzenthaltenden Medien, modifiziertes Medium 1)
  • wächst bei 5 %;
  • wächst bei 7 %,
  • wächst bei 10 %.
  • (19) Wachstum bei pH 5,7 (Medium 21)
  • wächst.
  • (20) Zersetzung von Casein (Medium 24) positiv.
    • Bacillus sp. KSM-597: (a) Ergebnisse der mikroskopischen Beobachtung
  • Dies ist ein Bazillus mit einer Körperform von 0,5 bis 0,8 um x 1,0 bis 2,0 um, mit ovalem Endosporium (0,5 bis 0,8 um x 1, 0 bis 1,2 um) in der Mitte des Körpers. Er hat Geißeln und ist beweglich. Gram's-Färbung ist positiv. Nicht urikamisch.
    • (b) Wachstumszustand in verschiedenen Medien
  • (1) Fleischbrühenagarplattenkultur (Medium 1)
  • Das Wachstumsstadium ist mäßig. Die Form der Kolonien ist kreisförmig mit glatter Oberfläche und einem glatten oder welligen Rand. Die Kolonien sind schwach gelb in der Farbe, halbtransparent und ziemlich matt im Glanz.
  • (2) Fleischbrühenagarschrägkultur (Medium 1)
  • Das Wachstum ist mäßig und der Wachstumszustand ist in einer Form eines ausgebreiteten Gewebes. Die Kolonien sind glänzend, milchig weiß in der Farbe und halbtransparent.
  • (3) Fleischbrühenflüssigkultur (Medium 2)
  • Wächst. Der Oberflächenwuchs wird beobachtet und das Wachstum der oberen Schicht wird ebenfalls beobachtet.
  • (4) Fleischbrühengelatinestichkultur (Medium 3)
  • Verflüssigung der Gelatine wird beobachtet.
  • (5) Lackmusmilchkultur (Medium 4)
  • Verflüssigung der Milch wird beobachtet, jedoch unterliegt das Lackmuspigment keiner deutlichen Änderung.
    • (c) Physiologische Eigenschaften
  • (1) Reduktion und Denitrifizierungsreaktionen von Nitraten (Medien 5, 6)
  • negativ hinsichtlich sowohl Reduktion von Nitrat, als auch Denitrifizierung.
  • (2) MR-Test (Medium 7)
  • positiv.
  • (3) VP-Test (Medium 7)
  • positiv.
  • (4) Bildung von Indol (Medium 8)
  • negativ.
  • (5) Bildung von Schwefelwasserstoff (Medium 9)
  • negativ.
  • (6) Hydrolyse von Stärke (Medium 10)
  • negativ.
  • (7) Nutzung von Zitronensäure (Medien 11, 12, 27)
  • negativ in sowohl Koser's, als auch Simon's Medien und positiv in Christensen's Medium.
  • (8) Nutzung von anorganischen Stickstoffquellen (Medium 13)
  • Nutzt weder Nitrat, noch Anmoniumsalz.
  • (9) Bildung von Pigment (Medien 14, 15)
  • Bildet ein gelbes Pigment in King B Medium.
  • (10) Urease (Medium 16)
  • negativ.
  • (11) Oxidase (Medium 17)
  • es ist nicht klar, ob negativ oder positiv.
  • (12) Catalase (Medium 18)
  • positiv.
  • (13) Temperatur- und pH-Bereiche zum Wachstum (Medium 2)
  • Der Temperaturbereich zum Wachstum beträgt 10 bis 50ºC und ein optimaler Temperaturbereich beträgt 20 bis 40ºC.
  • Der pH-Bereich für das Wachstum ist 5 bis 10.
  • (14) Verhalten gegenüber Sauerstoff:
  • aerob.
  • (15) O-F-Test (Medium 19)
  • Wachstum nur aerob.
  • (16) Nutzung von Zuckern (Medium20) (+: wird genutzt; -: wird nicht genutzt)
  • 1. L-Arabinose +
  • 2. D-Xylose +
  • 3. D-Glucose +
  • 4. D-Mannose +
  • 5. Fructose +
  • 6. D-Galactose +
  • 7. Maltose +
  • 8. Saccharose +
  • 9. Lactose -
  • 10. Trehalose +
  • 11. D-Sorbit -
  • 12. D-Mannit +
  • 13. Inosit +
  • 14. Glycerin +
  • 15. Stärke -
  • (17) pH in VP-Medium (Medium 7)
  • pH 5,0
  • (18) Wachstum in salzenthaltenden Medien, (modifiziertes Medium 1)
  • wächst bei 5 %;
  • wächst bei 7 %,
  • wächst bei 10 %.
  • (19) Wachstum bei pH 5,7 (Medium 21)
  • wächst.
  • (20) Desaminierung von Phenylalanin (Medium 23)
  • negativ.
  • (21) Zersetzung von Casein (Medium 24)
  • positiv.
  • Diese Stämme werden als sporenbildende Mikroorganismen, gehörig zu der Gattung Bacillus, angesehen. Die vorstehend genannten mykologischen Eigenschaften werden in Bezug auf Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8. Ausgabe und "The Genus Bacillus", in Agriculture Handbook Nr. 427, verfaßt von Ruth E. Gordon, Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture, Washington D.C. (1973) , verglichen. Im Ergebnis wurde gefunden, daß alle erfindungsgemäßen Stämme als Mikroorganismen, gehörig zur Gattung Bacillus, angesehen werden. Die erfindungsgemäßen Stämme sind scheinbar von sogenannten alkalophilen Mikroorganismen verschieden, die kürzlich von Horikoshi und Akiba ("Alkalophilic Microorganism", Japan Scientific Society Press (Tokyo), 1982) mitgeteilt wurden. Dies ist darauf zurückzuführen, daß alkalophile Mikroorganismen in alkalischen Medien mit einem pH von nicht weniger als 8 wachsen, jedoch in einem neutralen oder geringen pH-Bereich nicht wachsen, wohingegen erfindungsgemäße Stämme in der Lage sind, in einem schwach sauren bis alkalischen Bereich aufzuwachsen (pH 5 bis 11).
  • Der Vergleich zwischen den vorliegenden Stämmen und anderen bekannten Stämmen, zugehörig zur Gattung Bacillus, zeigt, daß die Arten, die am meisten analog zu den Stämmen von KSM-534, KSM-344, KSM-539 und KSM-577 sind, Bacillus licheniformis sein können. Der Vergleich zwischen den Stämmen der vorliegenden Erfindung und bekannten Stämmen, zugehörig zu Bacillus licheniformis, zeigt jedoch, daß der KSM-534- Stamm von jenen bekannten Stämmen hinsichtlich der Nutzung von Mannit und Xylose und dem Reduktionsvermögen von Nitraten verschieden ist und die KSM-539- und KSM-577-Stämme sind hinsichtlich des Reduktionsvermögens von Nitraten verschieden. Die vorstehend genannten, bekannten Stämme, zugehörig zu Bacillus licheniformis, können außerdem zumindest keine alkaliresistenten Cellulasen erzeugen und somit sind die erfindungsgemäßen Stämme als neue Stämme anzusehen.
  • Die Spezies, die am meisten analog zu Bacillus sp. KSM-588 ist, kann Bacillus megaterium oder Bacillus cereus sein. Der Vergleich zwischen bekannten Stämmen, zugehörig zu Bacillus megaterium und dem Stamm der Erfindung, zeigt einen Unterschied beim MR- und VP-Test. Außerdem zeigt ein Vergleich zwischen dem KSM-588-Stamm und Stämmen, zugehörig zu Bacillus cereus, daß es Unterschiede im anaeroben Wuchs gibt und in der Nutzung von Zuckern. Außerdem können die Stämme, zugehörig zu Bacillus megaterium und Bacillus cereus, zumindest keine alkaliresistente Cellulase erzeugen. Somit wird der vorliegende Stamm auch als neuer Stamm angesehen.
  • Die Spezies, die am meisten analog zum Bacillus sp. KSM-597-Stamm ist, kann Bacillus pumilus sein. Der Vergleich zwischen den bekannten Stämmen, zugehörig zu Bacillus pumilus, und dem vorliegenden Stamm zeigt daß die bekannten Stämme zumindest nicht alkaliresistente Cellulasen erzeugen können. Somit wird KSM-597 als neuer Stamm angesehen.
  • Zur Gewinnung von alkaliresistenten Cellulasen der Erfindung unter Verwendung dieser Stämme wird der Stamm in Medien inoculiert und in üblicher Weise gezüchtet. Das Medium sollte vorzugsweise geeignete Mengen an Kohlenstoff- und Stickstoffquellen, die zu nutzen sind, aufweisen. Diese Kohlenstoff- und Stickstoffquellen sind nicht kritisch. Beispiele von Stickstoffquellen schließen anorganische Verbindungen, wie Ammoniumnitrat, Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumnitrat und dergleichen, Maisglutenmehl, Sojabohnenmehl, Maisquellwasser, Casaminosäure, Hefeextrakt, Pharmamedia, Sardinenmehl, Fleischextrakt, Pepton, Hypro, Ajipower, Maissojabohnenmehl, Kaffeegrund, Baumwollsamenölkuchen, Kultivator, Amiflex, Ajipron, Zest, Ajix und dergleichen ein. Die Kohlenstoffquellen sind beispielsweise Pflanzenfasern, wie Spreu, Weizenglutenbrot, Filterpapier, übliche Papiere, Sägespäne und dergleichen, Abfalltheriac, Invertzucker, CMC, Avicel, Cellulosebaumwolle, Xylan, Pectin und dergleichen. Außerdem schließen nutzbare Kohlenstoffquellen beispielsweise Arabinose, Xylose, Glucose, Fructose, Galactose, Maltose, Saccharose, Lactose, Sorbit, Inosit, Glycerin, lösliche Stärke und dergleichen ein und nutzbare organische Säuren sind beispielsweise Essigsäure, Zitronensäure und dergleichen. Daneben können Phosphorsäure und anorganische Salze, wie Mg²+, Ca²+, Mn²+, Zn²+, Co²+, Na+, K+ und dergleichen und anorganische und organische Spurennährstoffquellen geeigneterweise, falls erforderlich, zugegeben werden.
  • Eine vorgesehene Cellulase kann aus dem so erhaltenen Kulturprodukt gewonnen werden und gemäß üblichen Verfahren zum Sammeln und Reinigen von Enzymen gereinigt werden. Insbesondere können die Zellen aus der Kulturbrühe oder der Lösung durch übliche Festflüssigtrenntechniken, wie Zentrifugaltrennung, Filtrieren und dergleichen, entfernt werden, wodurch eine rohe Enzymlösung erhalten wird. Diese rohe Enzymlösung kann selbst verwendet werden oder kann durch Aussalzen, Fällen, Ultrafiltration oder dergleichen unter Bereitstellung eines Rohenzyms getrennt werden. Das rohe Enzym wird anschließend durch Kristallisieren durch ein bekanntes Verfahren unter Bereitstellung eines gereinigten Enzyms gereinigt.
  • Typische alkaliresistente Cellulasen, die in dieser Weise erhältlich sind, sind beispielsweise jene mit Namen Cellulase K-534, Cellulase K-344, Cellulase K-539, Cellulase K-577, Cellulase K-588 und Cellulase K-597. Die vorliegende Erfindung wird weiterhin mit Hinweis auf diese Cellulasen erläutert. Es wird angemerkt, daß die Enzymaktivität gemäß nachstehenden Verfahren unter Verwendung der nachstehenden Pufferlösungen gemessen wird.
  • pH 3 bis 8: McIlvaine-Pufferlösung
  • pH 8 bis 11: Glycinnatriumhydroxidpufferlösung
  • pH 12 bis 13: Kaliumchloridnatriumhydroxidpufferlösung
  • Enzymatische Aktivitätsmessung:
  • (1) CMCase-Aktivität
  • 0,1 ml einer Enzymlösung wurden zu 0,9 ml einer Grundlösung, umfassend 10 mg CMC (A-01L von Sanyo Kokusaku Pulp Co., Ltd.) und 100 uMol jeder der Pufferlösungen (McIlvaine, Phosphorsäure, Glycin-NAOH und dergleichen) zugegeben, gefolgt von Umsetzung bei 30ºC für 20 Minuten. Nach Ablauf der Reaktion wurde der erhaltene reduzierende Zucker quantitativ gemäß dem 3, 5-Dinitrosalicylsäure (DNS)-Verfahren bestimmt. Insbesondere wurden 1,0 ml des DNS-Reagenz zu 1,0 ml der Reaktionslösung gegeben und für 5 Minuten bei 100ºC zur Farbentwicklung erwärmt. Nach dem Kühlen wurden 4,0 ml desionisierten Wassers zur Verdünnung zugegeben. Die verdünnte Lösung wurde Colorimetrie unter Verwendung einer Wellenlänge von 535 nm unterzogen. Die Enzymstärke wurde in einer Einheit ausgedrückt, die eine Menge an Enzym darstellt, ausreichend zur Herstellung eines reduzierten Zuckers, entsprechend 1 uMol Glucose unter den vorstehenden Bedingungen für 1 Minute.
  • (2) Zersetzungsaktivität von PNPC
  • Eine geeignete Menge an Enzym wurde auf 1,0 ml einer Reaktionslösung, enthaltend 0,1 uMol PNPC (Sigma Co., Ltd.) und 100 uMol Phosphatpufferlösung (pH 7,0) bei 30ºC einwirken lassen, wozu 0,3 ml 1M Na&sub2;CO&sub3; und 1,7 ml desionisiertes Wasser nacheinander gegeben wurden, gefolgt von Colorimetrie des freigesetzten p-Nitrophenols bei 400 nm. Die Enzymstärke wurde ausgedrückt als eine Einheit, nämlich eine Menge Enzym, ausreichend, um 1 uMol p-Nitrophenol unter den vorstehenden Bedingungen für 1 Minute freizusetzen.
  • (3) Zersetzungsaktivitäten von Avicel, Cellulosepulver und Filterpapier
  • Eine geeignete Menge eines Enzyms wurde zu 2,0 ml einer Reaktionslösung, enthaltend 20 mg Avicel (Merck Inc.) und 200 uMol Phosphatpufferlösung (pH 7,0) gegeben, gefolgt von Schütteln zur Umsetzung bei 30ºC bei 250 U/min. Nach Ablauf der Reaktion wurde die Lösung gekühlt und mit einer Zentrifuge getrennt (5ºC, 3000 U/min, 20 Minuten) und 1,0 ml der erhaltenen überstehenden Flüssigkeit wurde quantitativer Bestimmung an reduzierenden Zuckern gemäß dem 3,5-Dinitrosalicylsäure (DNS)-Verfahren unterzogen. Das vorstehende Verfahren wurde für die Zersetzungsaktivität bei Cellulosepulver unter Verwendung von Cellulosepulver (Toyo Filter Paper Co., Ltd.) und für eine Zersetzungsaktivität für Filterpapier unter Verwendung von Filterpapier (Filterpapier zur Prüfung der Cellulaseaktivität, Toyo Nr. 51-spezifisch) wiederholt. Die Enzymstärke wurde als eine Einheit ausgedrückt, nämlich die Menge Enzym, die ausreicht, um reduzierenden Zucker, entsprechend 1 uMol Glucose, unter den vorstehenden Bedingungen für 1 Minute zu erzeugen.
  • (4) Cellobiaseaktivität
  • Eine geeignete Menge an Enzym wurde auf 1,0 ml einer Reaktionslösung, enthaltend 10 mg Cellobiose (Kanto Chem. Co., Ltd.) und 100 uMol Phosphatpufferlösung (pH 7,0) für eine geeignete Zeit einwirken lassen und dann bei 100ºC für 2 Minuten behandelt, wodurch das Enzym inaktiviert wurde. Anschließend wurde die Menge an erhaltener Glucose durch das Mutarotase-GOD-Verfahren gemessen (Glucose-C-Test, Wako Junyaku Ind. Co., Ltd.). Die Enzymstärke wurde durch eine Einheit ausgedrückt nämlich die Menge an Enzym, die ausreicht, um 2 uMol Glucose unter den vorstehend genannten Bedingungen für 1 Minute zu erzeugen.
  • (Enzymatische Eigenschaften)
    • Cellulase K-534:
  • (1) Wirkung
  • Wirkt gut auf Cellulosematerialien, wie Cellulose, Filterpapier, Avicel, CMC und dergleichen und ruft bei ihnen Auflösung hervor, wodurch reduzierende Zucker, wie Glucose, erzeugt werden.
  • (2) Substratspezifität
  • Dieses Enzym hat nicht nur Aktivität auf CMC, sondern auch auf Cellulosepulver, Avicel, Filterpapier und PNPC.
  • (3) Arbeits-pH und optimaler pH
  • Die Arbeits-pH-bereiche variieren breit von 3 bis 12,5 und der optimale pH-Bereich beträgt etwa 6,5. In einem Bereich von 4,5 bis 10,5 ist die relative Aktivität nicht geringer als 50 % der Aktivität bei dem optimalen pH. Folglich wird angenommen, daß dieses Enzym eine ausreichende Aktivität in dem breitesten Arbeits-pH-bereich vom Sauren bis zum Alkalischen unter den bislang untersuchten Cellulasen aufweist (Figur 1).
  • (4) pH-Stabilität
  • Die Restaktivität wurde nach Halten des Enzyms bei verschiedenen pH-Werten bei 30ºC für 1 h zur Bestimmung der pH-Stabilität gemessen. Im Ergebnis wurde gefunden, daß das Enzym sehr stabil war und bei pH 5 bis 11 nicht inaktiviert wurde. Bei einem pH-Wert von 4,5 bis 12,5 wurde eine Aktivität von etwa 50 % oder darüber aufrechterhalten. Das vorliegende Enzym ist somit ausreichend stabil in einem stark alkalischen Bereich (Figur 2).
  • (5) optimale Temperatur
  • Die Arbeitstemperatur war in einem breiten Bereich von 15 bis 85ºC und die optimale Temperatur fand man bei etwa 70ºC. Bei einem Temperaturbereich von 45 bis 75ºC war die Aktivität 50 % oder höher der Aktivität der optimalen Temperatur (Figur 3).
  • (6) Temperaturstabilität
  • Nach Behandlung bei einem optimalen pH für 30 Minuten bei verschiedenen Temperaturen wurde die Restaktivität gemessen. Im Ergebnis wurde gefunden, daß sie stabil war bei 40ºC und die Restaktivität von etwa 50 % bei 65ºC gehalten wurde (Figur 4).
  • (7) Molekulargewicht
  • Das Molekulargewicht des vorliegenden Enzyms wurde gemäß Gelfiltration unter Verwendung von Sephadex G-100 gemessen; mit dem Ergebnis, daß die Hauptpeaks bei etwa 15000 bis etwa 30000 beobachtet wurden.
  • (8) Einfluß von Metallionen
  • Das vorliegende Enzym wurde der Bestimmung des Einflusses verschiedener Metallionen unterzogen (Al³+, Fe³+, Ba²+, Ca²+, Cd²+, Co²+, Cr²+, Cu²+, Fe²+, Hg²+, Mn²+, Mo²+, Ni²+, Pb²+, Zn²+ Li+, K+ und Na+), indem man die Ionen zur Zeit der Aktivität mit vorliegen ließ, (wobei die Konzentration an Metallionen 1 mM betrug mit Ausnahme der Konzentration von K&spplus; und Na&spplus;, die 50 mM betrug). Im Ergebnis wurde gefunden, daß die Aktivität durch Hg²&spplus; inhibiert wurde, jedoch durch Ba²+ verstärkt wurde.
  • (9) Einflüsse von Tensiden
  • Einflüsse verschiedener Tenside (beispielsweise LAS, AS, ES, AOS, α-SFE, SAS, Seife und Polyoxyethylensekundäralkylether) auf die Enzymaktivität wurden ermittelt. Das vorliegende Enzym wurde mit 0,05 % Lösung von jedem Tensid bei 30ºC für 15 Minuten behandelt und Aktivitätsmessung unterzogen. Im Ergebnis war die Aktivität nicht durch eines der Tenside inhibiert. Zusätzlich war die Inhibierung der Aktivität nicht beobachtet worden, wenn Natriumdodecylsulfat verwendet wurde, das ein potentielles Detergenz ist.
  • (10) Proteinaseresistenz
  • Proteinasen für Waschmittel, beispielsweise API-21 (Showa Denko Co., Ltd.), Maxatase (Gist Co., Ltd.) und Alkalase (Novo Co., Ltd.) wurden zur Meßzeit der Aktivität mit vorliegen lassen (0,1 mg/ml) zur Bestimmung ihres Einflusses. Es wurde gefunden, daß das Enzym eine starke Beständigkeit gegenüber diesen Proteinasen aufwies.
  • (11) Einfluß von chelatbildenden Mitteln
  • Chelatbildende Mittel, wie EDTA, EGTA, Zitronensäure, Zeolith und STPP wurden für die Zeit der Messung der Aktivität mit vorliegen lassen, mit dem Ergebnis, daß wenig Inhibierung festgestellt wurde.
    • Cellulase K-344:
  • (1) Wirkung
  • Wirkt gut auf Cellulosematerialien, wie Cellulose, Filterpapier, Avicel, CMC und dergleichen und verursacht bei ihnen Auflösen, wodurch reduzierende Zucker, wie Glucose, erzeugt werden.
  • (2) Substratspezifität
  • Dieses Enzym hat nicht nur Aktivität auf CMC, sondern auch auf Cellulosepulver, Avicel, Filterpapier und PNPC.
  • (3) Arbeits-pH und optimaler pH
  • Die Arbeits-pH-bereiche variieren breit von 3 bis 12,5 und der optimale pH-Wert ist 6. In einem Bereich von 4,5 bis 11 ist die relative Aktivität nicht geringer als 50 % der Aktivität beim optimalen pH. Folglich wird angenommen, daß dieses Enzym den breitesten Arbeits-pH-bereich auf der alkalischen Seite unter Cellulasen aufweist, die bislang untersucht worden sind (Figur 5).
  • (4) pH-Stabilität
  • Die Restaktivität wurde nach Belassen des Enzyms bei verschiedenen pH-Werten bei 30ºC für 1 h zur Bestimmung der pH-Stabilität gemessen. Im Ergebnis wurde gefunden, daß das Enzym sehr stabil war und bei pH 5 bis 10 nicht inaktiviert wurde. Bei einem pH-Wert von 4,5 bis 12 wurde eine Aktivität von etwa 50 % oder darüber aufrechterhalten. Somit ist das vorliegende Enzym ausreichend stabil in einem stark alkalischen Bereich (Figur 6).
  • (5) optimale Temperatur
  • Die Arbeitstemperatur lag in einem breiten Bereich von 15 bis 80ºC und die optimale Temperatur fand man bei etwa 70ºC. Bei einem Temperaturbereich von 45 bis 75ºC war die Aktivität 50 % oder höher als die Aktivität der optimalen Temperatur (Figur 7).
  • (6) Temperaturstabilität
  • Nach Behandlung bei einem optimalen pH-Wert für 30 Minuten bei verschiedenen Temperaturen wurde die Restaktivität gemessen. Im Ergebnis wurde gefunden, daß sie bei 30ºC stabil war und die Restaktivität von etwa 50 % auch bei 55ºC erhalten wurde (Figur 8).
  • (7) Molekulargewicht
  • Das Molekulargewicht des vorliegenden Enzyms wurde gemäß Gelfiltration unter Verwendung von Sephadex G-100 gemessen; mit dem Ergebnis, daß ein primärer Peak bei etwa 16000 beobachtet wurde.
  • (8) Einfluß von Metallionen
  • Das vorliegende Enzym wurde der Bestimmung des Einflusses verschiedener Metallionen unterzogen (Al³+, Fe³+, Ba²+, Ca²+, Cd²+, Co²+, Cr²+, Cu²+, Fe²+, Hg²+, Mn²+, Mo²+, Ni²+, Pb²+, Zn²+ Li+, K+ und Na+), durch Belassen der Ionen zur Zeit der Messung der Aktivität, (bei der die Konzentration der betreffenden Metallionen 1 mM betrug, mit der Abweichung, daß die Konzentration von K&spplus; und Na&spplus; 50 mM betrug).
  • Im Ergebnis wurde gefunden, daß die Aktivität durch Hg²+ und Pb²+ inhibiert wurde, jedoch durch Co²+ mehr verstärkt wurde.
  • (9) Einflüsse von Tensiden
  • Einflüsse verschiedener Tenside (beispielsweise LAS, AS, ES, AOS, α-SFE, SAS, Seife und Polyoxyethylensekundäralkylether) auf die Enzymaktivität wurden ermittelt. Das vorliegende Enzym wurde mit einer 0,05 %-igen Lösung jedes Tensids bei 30ºC für 15 Minuten behandelt und Aktivitätsmessung unterzogen. Im Ergebnis wurde gefunden, daß die Aktivität mit keinem der Tenside inhibiert wurde. Außerdem wurde die Inhibierung der Aktivität nicht beobachtet, wenn Natriumdodecylsulfat verwendet wurde, das ein potentielles Detergenz darstellt.
  • (10) Proteinasebeständigkeit
  • Proteinase für Waschmittel, beispielsweise API-21 (Showa Denko Co., Ltd.), Maxatase (Gist Co., Ltd.) und Alkalase (Novo Co., Ltd.) wurde zur Meßzeit der Aktivität mit zugegeben (0,1 mg/ml) zur Bestimmung ihrer Einflüsse. Es wurde gefunden, daß das Enzym eine starke Beständigkeit gegenüber diesen Proteinasen aufwies.
  • (11) Einfluß von chelatbildenden Mitteln
  • Chelatbildende Mittel, wie EDTA, EGTA, Zitronensäure, Zeolith und Natriumtripolyphosphat, wurden für die Zeit der Messung der Aktivität mit vorliegen lassen; mit dem Ergebnis, daß wenig Hemmung festgestellt wurde.
    • Cellulase K-539:
  • (1) Wirkung
  • Wirkt gut auf Cellulosematerialien, wie Cellulose, Filterpapier, Avicel, CMC und dergleichen und ruft bei ihnen Auflösung hervor, wodurch reduzierende Zucker, wie Glucose, entstehen.
  • (2) Substratspezifität
  • Dieses Enzym hat nicht nur Aktivität auf CMC, sondern auch auf Cellulosepulver, Avicel, Filterpapier und PNPC.
  • (3) Arbeits-pH und optimaler pH
  • Der Arbeits-pH bewegt sich in breitem Maße von 3 bis 12,5 und das pH-Optimum beträgt 7. Im Bereich von 4 bis 11 ist die relative Aktivität nicht geringer als 50 % der Aktivität bei dem optimalen pH. Folglich wird angenommen, daß dieses Enzym den breitesten Arbeits-pH-bereich im alkalischen Bereich unter Cellulasen, die bislang untersucht wurden, aufweist (Figur 9).
  • (4) pH-Stabilität
  • Die Restaktivität wurde nach Halten des Enzyms bei verschiedenen pH-Werten bei 30ºC für 1 h zur Bestimmung der pH-Stabilität gemessen. Im Ergebnis wurde gefunden, daß das Enzym sehr stabil war und nicht bei einem pH-Wert von 5 bis 12 inaktiviert wurde. Bei einem pH-Wert von 3,5 bis 12,5 wurde eine Aktivität von etwa 50 % oder darüber aufrecht erhalten. Das vorliegende Enzym ist somit ausreichend stabil in einem stark alkalischen Bereich (Figur 10).
  • (5) optimale Temperatur
  • Die Arbeitstemperatur war in einem breiten Bereich von 15 bis 85ºC und die optimale Temperatur fand man bei etwa 60ºC. Bei einem Temperaturbereich von 45 bis 75ºC war die Aktivität 50 % oder höher der Aktivität der optimalen Temperatur (Figur 11).
  • (6) Temperaturstabilität
  • Nach Behandlung bei einem optimalen pH für 30 Minuten bei verschiedenen Temperaturen wurde die Restaktivität gemessen. Im Ergebnis wurde gefunden, daß sie stabil war bei 50ºC und eine Restaktivität von etwa 50 % bei 60ºC erhalten wurde (Figur 12).
  • (7) Molekulargewicht
  • Das Molekulargewicht des vorliegenden Enzyms wurde gemäß Gelfiltrationsverfahren unter Verwendung von Sephadex G-100 gemessen; mit dem Ergebnis, daß Hauptpeaks bei etwa 18000 bis etwa 29000 beobachtet wurden.
  • (8) Einfluß von Metallionen
  • Das vorliegende Enzym wurde zur Bestimmung des Einflusses von verschiedenen Metallionen untersucht (Al³+, Fe³+, Ba²+, Ca²+, Cd²+, Co²+, Cr²+, Cu²+, Fe²+, Hg²+, Mn²+, Mo²+, Ni²+, Pb²+, Zn²+ Li+, K+ und Na+), durch Belassen der Ionen für eine Meßzeit der Aktivität, (wobei die Konzentration an betreffenden Metallionen 1 mM betrug, mit der Abweichung, daß die Konzentration von K&spplus; oder Na&spplus; 50 mM betrug).
  • Im Ergebnis wurde gefunden, daß die Aktivität durch Hg²+ inhibiert wurde, jedoch mehr verstärkt wurde durch Ca²+, Cd²+ und Ba²+.
  • (9) Einflüsse von Tensiden
  • Einflüsse verschiedener Tenside (beispielsweise LAS, AS, ES, AOS, α-SFE, SAS, Seife und Polyoxyethylensekundäralkylether) auf die Enzymaktivität wurden ermittelt. Das vorliegende Enzym wurde mit 0,05 %-iger Lösung eines Tensids bei 30ºC für 15 Minuten behandelt und Aktivitätsmessung unterzogen. Im Ergebnis war die Aktivität kaum durch eines der Tenside inhibiert. Zusätzlich wurde die Inhibierung der Aktivität auch nicht festgestellt unter Verwendung von Natriumdodecylsulfat, das ein potentielles Detergenz ist.
  • (10) Proteinasebeständigkeit
  • Proteinase für Waschmittel, wie beispielsweise API-21 (Showa Denko Co., Ltd.), Maxatase (Gist Co., Ltd.) und Alkalase (Novo Co., Ltd.) wurde für die Meßzeit der Aktivität (0,1 mg/ml) zur Bestimmung ihres Einflusses mit vorliegen lassen. Es wurde gefunden, daß das Enzym eine starke Beständigkeit gegenüber diesen Proteinasen aufwies.
  • (11) Einflüsse von chelatbildenden Mitteln
  • Chelatbildende Mittel, wie EDTA, EGTA, Zitronensäure, Zeolith und Natriumtripolyphosphat, wurden für eine Zeit der Messung der Aktivität mit vorliegen lassen, mit dem Ergebnis, daß wenig Inhibierung festgestellt wurde.
    • Cellulase K-577:
  • (1) Wirkung
  • Wirkt gut auf Cellulosematerialien, wie Cellulosepulver, Filterpapier, Avicel, CMC und dergleichen und ruft bei ihnen Auflösung hervor, wodurch reduzierende Zucker, wie Glucose, entstehen.
  • (2) Substratspezifität
  • Dieses Enzym hat nicht nur Aktivität auf CMC, sondern auch auf Cellulosepulver, Avicel und Filterpapier.
  • (3) Arbeits-pH und optimaler pH
  • Der Arbeits-pH bewegt sich recht breit von 3 bis 12 und das Optimum ist 7. Im Bereich von 4,5 bis 10,5 ist die relative Aktivität nicht geringer als 50 % der Aktivität beim optimalen pH-Bereich. Folglich wird angenommen, daß dieses Enzym eine ausreichende Aktivität in dem breitesten Arbeits- pH-bereich im alkalischen Bereich unter den bislang untersuchten Cellulasen aufweist (Figur 13).
  • (4) pH-Stabilität
  • Die Restaktivität wurde nach Halten des Enzyms bei verschiedenen pH-Werten bei 30ºC für 1 h zur Bestimmung der pH-Stabilität gemessen. Im Ergebnis wurde gefunden, daß das Enzym sehr stabil war und nicht bei einem pH von 5 bis 12 inaktiviert wurde. Bei einem pH von 4,5 bis 12,5 wurde eine Aktivität von etwa 50 % oder darüber gehalten. Das vorliegende Enzym ist somit ausreichend stabil in einem stark alkalischen Bereich (Figur 14).
  • (5) optimale Temperatur
  • Die Arbeitstemperatur lag in einen breiten Bereich von 15 bis 75ºC und die optimale Temperatur fand man bei 60ºC. Bei einem Temperaturbereich von 40 bis 65ºC war die Aktivität 50 % oder höher der Aktivität der optimalen Temperatur (Figur 15).
  • (6) Temperaturstabilität
  • Nach Behandlung bei einem optimalen pH-Wert für 30 Minuten bei verschiedenen Temperaturen wurde die Restaktivität gemessen. Im Ergebnis wurde gefunden, daß sie bei 50ºC stabil war und die Restaktivität von etwa 50 % bei 55ºC erhalten wurde (Figur 16).
  • (7) Molekulargewicht
  • Das Molekulargewicht des vorliegenden Enzyms wurde gemäß Gelfiltrationsverfahren unter Verwendung von Sephadex G-100 gemessen; mit dem Ergebnis, daß Hauptpeaks bei etwa 17000 bzw. etwa 30000 beobachtet wurden.
  • (8) Einflüsse von Metallionen
  • Das vorliegende Enzym wurde der Bestimmung des Einflusses verschiedener Metallionen untersucht (Al³+, Fe³+, Ba²+, Ca²+, Cd²+, Co²+&sub1; Cr²+, Cu²+, Fe²+, Hg²+, Mn²+, Mo²+, Ni²+, Pb²+, Zn²+ Li+, K+ und Na+) wobei man die Ionen für die Meßzeit der Aktivität mit vorliegen ließ, (wobei die Konzentration der betreffenden Metallionen 1 mM betrug; mit der Abweichung, daß die Konzentration von K&spplus; oder Na&spplus; 50 mM betrug).
  • Im Ergebnis wurde gefunden, daß die Aktivität durch Hg²+ inhibiert wurde und mehr verstärkt wurde durch Ca²+, Cd²+, Ba²+ und Co²+.
  • (9) Einflüsse von Tensiden
  • Einflüsse verschiedener Tenside (beispielsweise LAS, AS, ES AOS, α-SFE, SAS, Seife und Polyoxyethylensekundäralkylether) auf die Enzymaktivität wurden ermittelt. Das vorliegende Enzym wurde mit 0,05 %-iger Lösung von jedem Tensid bei 30ºC für 15 Minuten behandelt und Aktivitätsmessung unterzogen. Im Ergebnis wurde gefunden, daß die Aktivität kaum durch eines der Tenside inhibiert wurde. Zusätzlich wurde Inhibierung der Aktivität nicht festgestellt, wenn Natriumdodecylsulfat verwendet wurde, das ein potentielles Detergenz darstellt.
  • (10) Proteinasebeständigkeit
  • Proteinasen für Detergenzien, beispielsweise API-21 (Showa Denko Co., Ltd.), Maxatase (Gist Co., Ltd.) und Alkalase (Novo Co., Ltd.) wurden zur Meßzeit der Aktivität (0,1 mg/ml) zur Bestimmung ihres Einflusses mit vorliegen lassen. Es wurde gefunden, daß das Enzym eine hohe Beständigkeit gegenüber diesen Proteinasen hatte.
  • (11) Einflüsse von chelatbildenden Mitteln
  • Chelatbildende Mittel, wie EDTA, EGTA, Zitronensäure, Zeolith und Natriumtripolyphosphat, wurden für die Zeit der Messung der Aktivität mit vorliegen lassen, mit dem Ergebnis, daß wenig Inhibierung festgestellt wurde.
    • Cellulase K-588:
  • (1) Wirkung
  • Wirkt gut auf Cellulosematerialien, wie CMC und Filterpapier, und ruft bei ihnen Auflösung hervor, wodurch reduzierende Zucker, wie Glucose, entstehen.
  • (2) Substratspezifität
  • Dieses Enzym hatte nicht nur Aktivität auf CMC, sondern auch Aktivität auf Phosphorsäure gequollene Cellulose, Filterpapier und PNPC.
  • (3) Arbeits-pH und optimaler pH
  • Die Arbeits-pH-bereiche bewegen sich in breitem Maße von 3 bis 13 und der optimale pH-Wert beträgt 7. In einem Bereich von 4,5 bis 10,5 ist die relative Aktivität nicht geringer als 50 % der Aktivität bei dem optimalen pH. Folglich wird angenommen, daß dieses Enzym den breitesten Arbeits-pH- bereich in dem alkalischen Bereich unter den Cellulasen aufweist, die bis jetzt untersucht wurden (Figur 17).
  • (4) pH-Stabilität
  • Die Restaktivität wurde nach Halten des Enzyms bei verschiedenen pH-Werten bei 30ºC für 1 h zur Bestimmung der pH-Stabilität untersucht. Im Ergebnis wurde gefunden, daß das Enzym sehr stabil war und nicht bei einem pH von 5 bis 11,5 inaktiviert wurde. Bei einem pH-Wert von 4,5 bis 12,5 wurde eine Aktivität von etwa 50 % oder darüber festgestellt. Somit ist das vorliegende Enzym zufriedenstellend stabil in einem hohen alkalischen Bereich (Figur 18).
  • (5) optimale Temperatur
  • Die Arbeitstemperatur lag im breiten Bereich von 15 bis 80ºC und die optimale Temperatur fand man bei 60ºC. Bei einem Temperaturbereich von 45 bis 65ºC war die Aktivität 50 % oder höher der Aktivität der optimalen Temperatur (Figur 19).
  • (6) Temperaturstabilität
  • Nach Behandlung bei dem optimalen pH für 30 Minuten bei verschiedenen Temperaturen wurde die Restaktivität gemessen. Im Ergebnis wurde gefunden, daß sie bei 40ºC stabil war und die Restaktivität von etwa 50 % bei 55ºC erhalten wurde (Figur 20).
  • (7) Molekulargewicht
  • Das Molekulargewicht des vorliegenden Enzyms wurde gemäß Gelfiltration unter Verwendung von Bio-Gel P-150 (Bio- Rad Laboratories Co. Ltd.) gemessen; mit dem Ergebnis, daß die Hauptpeaks bei etwa 27000 beziehungsweise etwa 30000 beobachtet wurden.
  • (8) Einflüsse von Metallionen
  • Das vorliegende Enzym wurde der Bestimmung des Einflusses verschiedener Metallionen unterzogen (Al³+, Fe³+, Ba²+, Ca²+, Cd²+, Co²+, Cu²+, Fe²+, Hg²+, Mg²+, Mn²+, Ni²+, Pb²+, Zn²+, K+ und Na+), indem man die Ionen zur Zeit der Aktivität mit vorliegen ließ (wobei die Konzentration an den betreffenden Metallionen 1 mM betrug, mit Ausnahme der Konzentration von K+ oder Na&spplus;, die 50 mM betrug).
  • Im Ergebnis wurde gefunden, daß die Aktivität durch Hg²+ inhibiert wurde und durch Fe²+ und Mn²+ verstärkt wurde.
  • (9) Einflüsse von Tensiden
  • Einflüsse verschiedener Tenside (beispielsweise LAS, AS, ES, AOS, α-SFE, SAS, Seife und Polyoxyethylensekundäralkylether) auf die Enzymaktivität wurden ermittelt. Das vorliegende Enzym wurde Messung der Aktivität in 0,05 % Tensid unterzogen. Im Ergebnis wurde kein signifikanter Einfluß der Tenside festgestellt. Außerdem wurde keine Inhibierung der Aktivität durch Natriumdodecylsulfat, das ein potentielles Detergenz darstellt, festgestellt.
  • (10) Proteinasebeständigkeit
  • Proteinasen für Waschmittel, beispielsweise API-21 (Showa Denko Co., Ltd.), Maxatase (Gist Co., Ltd.) und Alkalase (Novo Co., Ltd.) wurden für die Meßzeit der Aktivität mit vorliegen lassen (0,1 mg/ml) zur Bestimmung ihres Einflusses. Es wurde gefunden, daß das Enzym eine starke Beständigkeit zu diesen Proteinasen aufwies.
  • (11) Einflüsse von chelatbildenden Mitteln
  • Chelatbildende Mittel, wie EDTA, EGTA, Zitronensäure, Zeolith und Natriumtripolyphosphat, wurden für die Zeit der Messung der Aktivität mit vorliegen lassen, mit dem Ergebnis, daß keine Inhibierung festgestellt wurde.
    • Cellulase K-597:
  • Zur Messung der Aktivität des vorliegenden Enzyms wurden die folgenden Verfahren anstelle der Verfahren (3) und (4), die vorstehend beschrieben wurden, verwendet.
  • (3-B) Zersetzungsaktivität für Avicel, Cellulosepulver, in Phosphorsäure gequollene Cellulose, in Alkali gequollene Cellulose und Filterpapier.
  • Eine geeignete Menge einer Enzymlösung wurde zu 2,0 ml einer Reaktionslösung, enthaltend 20 mg Avicel (Merck Inc.) und 200 uMol Phosphatpufferlösung (pH 7,0), gefolgt von Schütteln bei 30ºC bei 250 U/min, gegeben. Nach Ablauf der Reaktion wurde die Reaktionslösung gekühlt und Zentrifugenbehandlung zur Trennung (5ºC, 3000 U/min, 20 Minuten) unterzogen und 1 ml des erhaltenen Überstands wurde quantitativer Bestimmung hinsichtlich reduzierender Zucker durch das 3,5- Dinitrosalicylsäure (DNS)-Verfahren unterzogen. Das vorstehende Verfahren wurde unter Verwendung von Cellulosepulver (Toyo Filter Paper Co., Ltd.) wiederholt für die Zersetzungsaktivität von Cellulosepulver, Cellulose behandelt durch das Verfahren von Tomita et al. (Tomita et al, J. Ferment. Technol. , 52, 235, 1974) für die Aktivitäten von in Phosphorsäure gequollener Cellulose und in Alkali gequollener Cellulose und Filterpapier (Filterpapier zur Bestimmung der Cellulaseaktivität, Toyo Nr. 51-spec.) für die Filterpapierzersetzungsaktivität. Die Enzymstärke wurde wie folgt ausgedrückt: Die Menge an Enzym, die ausreichend ist, um reduzierenden Zucker, entsprechend 1 uMol Glucose, unter den vorstehenden Bedingungen für 1 min, zu erzeugen, wurde als 1 Einheit festgelegt.
  • (4-B) Cellobiaseaktivität
  • Eine geeignete Menge einer Enzymlösung wurde zu einer Reaktionslösung, enthaltend 10 mg Cellobiose (Kanto Chem. Co., Ltd.) und 50 uMol Phosphatpufferlösung (pH 7,0) bei 30ºC für eine geeignete Zeit mit vorliegen lassen, gefolgt von Behandlung bei 100ºC für 5 min., um das Enzym zu desaktivieren. Anschließend wurde eine Menge an hergestellter Glucose gemäß dem Mutarotase-GOD-Verfahren (Glucose-C-Test, Wako Junyaku Ind. Co., Ltd.) gemessen. Die Enzymstärke wurde wie nachstehend ausgedrückt: Eine Menge an Enzym, ausreichend zur Herstellung von 2 uMol Glucose unter den vorstehenden Bedingungen für 1 min, zu erzeugen, wurde als 1 Einheit festgelegt.
  • (1) Wirkung
  • Wirkt gut auf Cellulosematerialien, wie Cellulose, Filterpapier, Avicel, CMC und dergleichen und ruft bei ihnen Auflösung hervor, wodurch reduzierende Zucker, wie Glucose, entstehen.
  • (2) Substratspezifität
  • Dieses Enzym hat nicht nur Aktivität auf CMC, sondern auch auf Cellulosepulver, Avicel, Filterpapier und PNPC.
  • (3) Arbeits-pH und optimaler pH
  • Der Arbeits-pH bewegt sich in breitem Maße von 3 bis 13 und das Optimum im pH liegt bei 7. In einem Bereich von 4,5 bis 11,5 ist die relative Aktivität nicht geringer als 50 % der Aktivität des optimalen pH. Folglich wird angenommen, daß dieses Enzym den breitesten Arbeits-pH-bereich in dem alkalischen Bereich unter Cellulasen aufweist, die bislang untersucht wurden (Figur 21).
  • (4) pH-Stabilität
  • Die Restaktivität wurde nach Halten des Enzyms bei verschiedenen pH-Werten bei 30ºC für 1 h zur Bestimmung der pH-Stabilität gemessen. Im Ergebnis wurde gefunden, daß das Enzym sehr stabil war und nicht bei einem pH von 5 bis 11,5 inaktiviert wurde. Bei einem pH-Wert von 4,5 bis 12,5 wurde eine Aktivität von etwa 50 % oder darüber aufrechterhalten. Das vorliegende Enzym ist somit genügend stabil für einen stark alkalischen Bereich (Figur 22).
  • (5) optimale Temperatur
  • Die Arbeitstemperatur war in einem breiten Bereich von 15 bis 80ºC und die optimale Temperatur fand man bei 60ºC. Bei einem Temperaturbereich von 45 bis 75ºC war die Aktivität 50 % oder höher der Aktivität der optimalen Temperatur (Figur 23). Die Messung wurde bei pH 6 bewirkt.
  • (6) Temperaturstabilität
  • Nach Behandlung bei einem pH von 7 für 30 Minuten bei verschiedenen Temperaturen wurde die Restaktivität bei einem pH von 6 gemessen. Im Ergebnis wurde gefunden, daß sie bei 50ºC stabil war und die Restaktivität von etwa 50 % bei 55ºC erhalten wurde (Figur 24).
  • (7) Molekulargewicht
  • Das Molekulargewicht des vorliegenden Enzyms wurde gemäß Gelfiltrationsverfahren unter Verwendung von Bio-Gel P- 150 (Bio-Rad Laboratories Co., Ltd.) gemessen; mit dem Ergebnis, daß ein Hauptpeak bei etwa 40000 beobachtet wurde.
  • (8) Einfluß von Metallionen
  • Das vorliegende Enzym wurde der Bestimmung des Einflusses verschiedener Metallionen unterzogen (Al³+, Fe³+, Ba²+, Ca²+, Cd²+, Co²+, Cu²+, Fe²+, Hg²+, Mn²+, Mg²+, Ni²+, Pb²+, Zn²+, K+ und Na+), indem man die Ionen für die Meßzeit der Aktivität mit vorliegen ließ, (wobei die Konzentration an entsprechenden Metallionen 1 mM betrug mit Ausnahme der Konzentration von K&spplus; oder Na&spplus;, die 50 mM betrug).
  • Im Ergebnis wurde gefunden, daß die Aktivität durch Hg²+ inhibiert und durch Co²+ verstärkt wurde.
  • (9) Einflüsse von Tensiden
  • Einflüsse verschiedener Tenside (beispielsweise LAS, AS, ES, AOS, α-SFE, SAS, Seife und Polyoxyethylensekundäralkylether) auf die Enzymaktivität wurden ermittelt. Das vorliegende Enzym wurde der Messung der Aktivität in 0,05 % Tensidlösung unterzogen. Im Ergebnis wurde kein signifikanter Einfluß des Tensids festgestellt.
  • Außerdem wurde wenig Inhibierung der Aktivität festgestellt, wenn Natriumdodecylsulfat verwendet wurde, das ein potentielles Detergenz ist.
  • (10) Proteinasebeständigkeit
  • Proteinasen für Waschmittel, beispielsweise API-21 (Showa Denko Co., Ltd.), Maxatase (Gist Co., Ltd.) und Alkalase (Novo Co., Ltd.) wurden für die Meßzeit der Aktivität zur Bestimmung ihres Einflusses mit vorliegen lassen (0,1 mg/ml). Es wurde gefunden, daß das Enzym eine starke Beständigkeit zu diesen Proteinasen aufweist.
  • (11) Einfluß von chelatbildenden Mitteln
  • Chelatbildende Mittel, wie EDTA, EGTA, Zitronensäure, Zeolith und Natriumtripolyphosphat, wurden für die Zeit der Messung der Aktivität mit vorliegen lassen, mit dem Ergebnis, daß wenig Inhibierung festgestellt wurde.
  • Die erfindungsgemäßen Cellulasen haben einen optimalen pH bei einem neutralen Bereich und haben eine hohe relative Aktivität in einem alkalischen Bereich und sind stabil. Beispielsweise hat Cellulase K-534 einen optimalen pH von 6,5, ist jedoch sehr stabil über einen pH-Bereich von 5 bis 11. Obwohl Cellulase K-344 einen optimalen pH von 6 aufweist, hat sie eine relative Aktivität von nicht weniger als 60 % bei einem pH von 10 auf Grundlage der Aktivität bei einem optimalen pH und ist sehr stabil in dem pH von 5 bis 10. Cellulase K-539 hat einen optimalen pH von 7, hat jedoch eine relative Aktivität bei einem pH von 10 von nicht weniger als 80 % der Aktivität bei dem optimalen pH und eine relative Aktivität bei einem pH von 11, von nicht weniger als 60 %. Sie ist sehr stabil bei einem pH-Bereich von 5 bis 12. In ähnlicher Weise hat Cellulase K-577 ein pH-Optimum von 7, ist jedoch sehr stabil bei dem pH-Bereich von 5 bis 12. Außerdem hat Cellulase K-588 einen optimalen pH von 7, hat jedoch eine relative Aktivität bei einem pH von 9, von nicht weniger als 70 % der Aktivität bei dem optimalen pH und eine relative Aktivität bei pH 10, von nicht weniger als 50 % der Aktivität bei dem optimalen pH. Sie ist sehr stabil über einen breiten pH-Bereich von 5 bis 11,5. Cellulase K-597 hat einen optimalen pH von 7, hat jedoch eine relative Aktivität bei einem hohen alkalischen pH-Wert von 11,5 von nicht weniger als 60 % der Aktivität bei dem optimalen pH und ist sehr stabil in einem pH-Bereich von 5 bis 11,5.
  • Alle Cellulasen erleiden wenig Inhibierung durch Waschmittelbestandteile, wie Tenside, Proteinasen und chelatbildende Mittel. Folglich können die erfindungsgemäßen Enzyme zweckmäßigerweise als Bestandteile für Waschmittel verwendet werden.
  • Außerdem sind die erfindungsgemäßen Stämme Bacillus sp. KSM-534, KSM-344, KSM-539, KSM-577, KSM-588 und KSM-597 unter neutralen Bedingungen variabel und können industriell entsprechende Alkali resistente Cellulasen leichter erzeugen als alkalophile Bazillen.
  • Die vorliegende Erfindung wird im einzelnen durch die nachstehenden Beispiele beschrieben. Beispiel 1 Ein Löffel voll (etwa 0,5 g) Boden, erhalten von Ichigai-machi, Haga-gun, Tochigi-ken, Japan, wurde in sterilisierter physiologischer Kochsalzlösung suspendiert und thermisch auf 80ºC für 10 Minuten behandelt. Die Überstandsflüssigkeit der thermisch behandelten Lösung wurde geeigneterweise verdünnt und auf Agarmedium für die Isolierung (Medium 1) angewendet, gefolgt von Züchten bei 30ºC für 3 Tage unter Bildung von Kolonien. Kolonien, umringt mit einer transparenten Zone, wurden auf der Basis der Auflösung von CMC ausgewählt und die CMCase produzierenden Bazillen gesammelt. Diese gesammelten Mikroorganismen wurden in ein flüssiges Medium, wie Medium 2, inoculiert und einer Schüttelkultur bei 30ºC für 3 Tage unterzogen. Nach Ablauf der Züchtung wurde ein durch Zentrifugenbehandlung abgetrennter Überstand als Flüssigkeit erhalten und Messung der CMCase-Aktivität bei einem pH-Bereich von 3 bis 13 und ebenfalls Screening hinsichtlich Alkali resistenter Cellulase erzeugender Mikroorganismen unterzogen.
  • Durch vorstehendes Verfahren konnten Bacillus sp. KSM-534-Stamm (FERM BP-1508) , Bacillus sp. KSM-344-Stamm (FERM BP-1506), Bacillus sp. KSM-539 (FERM BP-1509) und Bacillus sp. KSM-577 (FERM BP-1510) erhalten werden.
    • Medium 1
  • CMC 2 %
  • Polypepton 0,5 %
  • Hefeextrakt 0,05 %
  • KH&sub2;PO&sub4; 0,1 %
  • Na&sub2;HPO&sub4; 12H&sub2;O 0,25 %
  • MgSO&sub4; 7H&sub2;O 0,02 %
  • Agar 0,75 %
  • pH 6,8
    • Medium 2
  • CMC 1 %
  • Polypepton 1 %
  • Hefeextrakt 0,5 %
  • KH&sub2;PO&sub4; 0,1 %
  • Na&sub2;HPO&sub4; 12H&sub2;O 0,25 %
  • MgSO&sub4; 7H&sub2;O 0,02 %
  • pH 6,8
    • Beispiel 2
  • Bacillus sp. KSM-534-Stamm, erhalten im Beispiel 1, wurde in ein flüssiges Medium 2 von Beispiel 1 inoculiert, gefolgt von Schüttelkultur bei 30ºC für 3 Tage. Nach Ablauf der Züchtung wurden die Bacilluszellen durch Zentrifugenabtrennung entfernt unter Bereitstellung einer rohen Enzymlösung. 3 l Ethanol wurden zu 1 l der rohen Enzymlösung in Trockeneis-Ethanol gegeben und der erhaltene Niederschlag wurde durch Zentrifugenbehandlung entfernt, gefolgt von Gefriertrocknen unter Bereitstellung von 10 g Cellulase K-534 (spezifische Aktivität 3 Einheiten/g, bestimmt bei pH 9, auch nachstehend) als Trockenpulver.
    • Beispiel 3
  • Das allgemeine Verfahren von Beispiel 2 wurde wiederholt, mit der Abweichung, daß in dem flüssigen Medium 2 CMC durch 1 % Saccharose ersetzt wurde und Polypepton durch 7 % Maisquellwasser ersetzt wurde, und die Schüttelkultur wurde bei 30ºC für 2 Tage bewirkt. Die Überstandsflüssigkeit, gewonnen durch Zentrifugenabtrennung aus der erhaltenen Kulturlösung, wurde Messung hinsichtlich CMCase-Aktivität unterzogen, mit dem Ergebnis, daß die Aktivität 50 Einheiten/l betrug.
    • Beispiel 4
  • Bacillus sp. KSM-344-Stamm, erhalten in Beispiel 1, wurde gezüchtet und in gleicher Weise wie in Beispiel 2 gereinigt, wodurch ein trockenes Pulver erhalten wurde: 10,5 g von Cellulase K-344 (spezifische Aktivität 6 Einheiten/g bei pH 9).
    • Beispiel 5
  • Das allgemeine Verfahren von Beispiel 2 wurde wiederholt, mit der Abweichung, daß in dem flüssigen Medium 2 CMC durch 1 % Saccharose ersetzt wurde und Polypepton durch 7 % Maisquellwasser ersetzt wurde und daß Bacillus sp. KSM-344 für eine Schüttelkultur bei 30ºC für 2 Tage verwendet wurde. Die Überstandsflüssigkeit, erhalten durch Zentrifugenabtrennung aus der erhaltenen Kulturlösung, wurde Messung hinsichtlich CMCase-Aktivität unterzogen, mit dem Ergebnis, daß die Aktivität 2900 Einheiten/l betrug.
    • Beispiel 6
  • Bacillus sp. KSM-539, erhalten in Beispiel 1, wurde gezüchtet und in gleicher Weise wie in Beispiel 2 gereinigt, wodurch ein trockenes Pulver erhalten wurde: 9 g Cellulase K- 539 (spezifische Aktivität 26 Einheiten/g bei einem pH von 9). Beispiel 7 Das allgemeine Verfahren von Beispiel 2 wurde wiederholt, mit der Abweichung, daß in dem flüssigen Medium 2 CMC durch 1 % Saccharose ersetzt wurde und Polypepton durch 7 % Maisquellwasser ersetzt wurde und daß Bacillus sp. KSM-539 zur Schüttelkultur bei 30ºC für 2 Tage verwendet wurde. Die Überstandsflüssigkeit, erhalten durch Zentrifugenabtrennung aus der Kulturlösung, wurde Messung hinsichtlich CMCase-Aktivität unterzogen, mit dem Ergebnis, daß die Aktivität 40 Einheiten/l betrug.
    • Beispiel 8
  • Bacillus sp. KSM-577, erhalten in Beispiel 1, wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 2 gezüchtet und gereinigt, wodurch ein trockenes Pulver erhalten wurde: 9 g von Cellulase K-577 (spezifische Aktivität 22 Einheiten/g bei pH 9).
    • Beispiel 9
  • Das allgemeine Verfahren von Beispiel 2 wurde wiederholt, mit der Abweichung, daß in dem flüssigen Medium 2 CMC durch 1 % Saccharose ersetzt wurde und Polypepton durch 7 % Maisquellwasser ersetzt wurde und daß Bacillus sp. KSM-577 zur Schüttelkultur bei 30ºC für 2 Tage verwendet wurde. Die Überstandsflüssigkeit, erhalten durch Zentrifugenabtrennung aus der erhaltenen Kulturlösung, wurde Messung hinsichtlich CMCase-Aktivität unterzogen, mit dem Ergebnis, daß die Aktivität 40 Einheiten/l betrug. Beispiel 10 Ein Löffel voll (0,5 g) Boden, erhalten bei Nikkoshi, Tochigi-ken, Japan, wurde genommen und in sterilisierter physiologischer Kochsalzlösung suspendiert, gefolgt von Wiederholen des Verfahrens von Beispiel 1, wodurch ein KSM-588- Stamm (FERM BP-1513) und KSM-597-Stamm (FERM BP-1514) der Erfindung erhalten wurde.
    • Beispiel 11
  • Bacillus sp. KSM-588, erhalten in Beispiel 10, wurde gezüchtet und in gleicher Weise wie in Beispiel 2 gereinigt, wodurch ein trockenes Pulver erhalten wurde: 8 g von Cellulase K-588 (spezifische Aktivität 5 Einheiten/g bei einem pH von 9).
    • Beispiel 12
  • Das allgemeine Verfahren von Beispiel 2 wurde wiederholt, mit der Abweichung, daß in dem flüssigen Medium 2 CMC durch 1 % Saccharose ersetzt wurde und Polypepton durch 7 % Maisquellwasser ersetzt wurde und daß Bacillus sp. KSM-588 durch Schüttelkultur bei 30ºC für 2 Tage verwendet wurde. Die Überstandsflüssigkeit, erhalten durch Zentrifugenabtrennung aus der erhaltenen Kulturlösung, wurde Messung hinsichtlich CMCase-Aktivität unterzogen, mit dem Ergebnis, daß die Aktivität 160 Einheiten/l betrug.
    • Beispiel 13
  • Bacillus sp. KSM-597-Stamm, erhalten in Beispiel 10, wurde gezüchtet und in gleicher Weise wie in Beispiel 2 gereinigt, wodurch ein trockenes Pulver erhalten wurde: 10 g Cellulase K-597 (spezifische Aktivität 8 Einheiten/g bei pH 9).
    • Beispiel 14
  • Das allgemeine Verfahren von Beispiel 2 wurde wiederholt, mit der Abweichung, daß in dem flüssigen Medium 2 CMC durch 1 % Saccharose ersetzt wurde und Polypepton durch 7 % Maisquellwasser ersetzt wurde und daß Bacillus sp. KSM-597 zur Schüttelkultur bei 30ºC für 3 Tage verwendet wurde. Die Überstandsflüssigkeit, erhalten durch Zentrifugenabtrennung aus der erhaltenen Kulturlösung, wurde Messung hinsichtlich CMCase-Aktivität unterzogen, mit dem Ergebnis, daß die Aktivität 300 Einheiten/l betrug.

Claims (14)

1. Alkaliresistente Cellulase, hergestellt durch einen Mikroorganismus, der zur Gattung Bacillus gehört und in einem neutralen Medium wächst, wobei die Cellulase die nachstehenden enzymatischen Eigenschaften aufweist:
(1) einen breiten optimalen pH-Bereich von 5 bis 7,
(2) sehr stabil, (nicht inaktiviert bei einem pH-Wert von 5 bis 10, mit einer Restaktivität bei einem pH-Wert von 4, 5 bis 11, von nicht weniger als 50 % der maximalen Aktivität),
(3) ihre Aktivität wird durch Anwesenheit von Hg²+ gehemmt und
(4) die Aktivität wird im wesentlichen nicht gehemmt durch Proteinasen, Tenside und chelatbildende Mittel.
2. Alkaliresistente Cellulase nach Anspruch 1, wobei die Cellulase die nachstehenden enzymatischen Eigenschaften aufweist und K-534 genannt wird.
(1) Wirkung
Wirkt gut auf Cellulosematerialien, einschließlich Carboxymethylcellulose (CMC), Cellulose, Filterpapier und Avicel und ruft bei ihnen Auflösen hervor, wobei sich reduzierende Zucker, wie Glucose, bilden.
(2) Substratspezifität
Weist nicht nur Aktivität auf CMC auf, sondern auch auf Cellulosepulver, Avicel, Filterpapier und p-Nitrophenylcellobiosid (PNPC).
(3) Arbeits-pH und optimaler pH
Der Arbeits-pH-bereich beträgt 3 bis 12,5 und der optimale pH beträgt etwa 6,5 mit einer relativen Aktivität von nicht weniger als 50 % der Aktivität bei einem optimalen pH, der im Bereich von 4,5 bis 10,5 gezeigt wird.
(4) pH-Stabilität
Sehr stabil und nicht inaktiviert bei pH von 5 bis 11, mit einer Aktivität von nicht weniger als etwa 50 %, aufrecht gehalten bei einem pH-Wert von 4,5 bis 12,5.
(5) Optimale Temperatur
Die Arbeitstemperatur liegt im breiten Bereich von 15 bis 85ºC und die optimale Temperatur beträgt etwa 70ºC. Im Bereich von 45 bis 75ºC ist die Aktivität nicht weniger als 50 % der Aktivität bei der optimalen Temperatur.
(6) Molekulargewicht
Peaks für das Molekulargewicht betragen etwa 15000 und etwa 30000 (bestimmt durch Gelfiltration unter Verwendung von Sephadex G-100).
(7) Einfluß von Metallionen
Aktiviert durch Ba²+ und inhibiert durch Hg²+.
(8) Einflüsse von Tensiden
LAS, AS, ES, AOS, α-SFE, SAS, Seifen und Polyoxyethylensekundäralkylether inhibieren die Aktivität.
(9) Proteinasebeständigkeit
Beständig gegen Proteinasen
(10) Einflüsse von chelatbildenden Mitteln
EDTA, EGTA, STPP, Zeolith und Zitronensäure inhibieren die Aktivität nicht.
3. Alkaliresistente Cellulase nach Anspruch 1, wobei die alkalische Cellulase die nachstehenden enzymatischen Eigenschaften aufweist und K-344 genannt wird.
(1) Wirkung
Wirkt gut auf Cellulosematerialien, einschließlich CMC, Cellulose, Filterpapier und Avicel und ruft bei ihnen Auflösen hervor, wobei reduzierende Zucker, wie Glucose, gebildet werden.
(2) Substratspezifität
Weist nicht nur Aktivität auf CMC auf, sondern auch auf Cellulosepulver, Avicel, Filterpapier und PNPC.
(3) Arbeits-pH und optimaler pH Der Arbeits-pH-bereich beträgt 3 bis 12,5 und der optimale pH-Bereich ist 6 mit einer relativen Aktivität von nicht weniger als 50 % der Aktivität bei einem optimalen pH, der im Bereich von 4,5 bis 11 gezeigt wird.
(4) pH-Stabilität
Sehr stabil und nicht inaktiviert bei einem pH von 5 bis 10, mit einer Aktivität von nicht weniger als etwa 50 %, aufrecht gehalten bei einem pH-Wert von 4,5 bis 12.
(5) Optimale Temperatur Die Arbeitstemperatur liegt im breiten Bereich von 15 bis 80ºC und die optimale Temperatur beträgt 70ºC. Im Bereich von 40 bis 75ºC ist die Aktivität nicht weniger als 50 % der Aktivität bei der optimalen Temperatur.
(6) Molekulargewicht
Ein Peak für das Molekulargewicht erscheint bei etwa 16000, (bestimmt durch Gelfiltrationsverfahren unter Verwendung von Sephadex G-100).
(7) Einflüsse von Metallionen
Inhibiert durch Hg²+ und Pb²+ und aktiviert durch Co²+.
(8) Einflüsse von Tensiden
LAS, AS, ES, AOS, α-SFE, SAS, Seifen und Polyoxyethylensekundäralkylether inhibieren die Aktivität kaum.
(9) Proteinasebeständigkeit
Beständig gegen Proteinasen
(10) Einflüsse von chelatbildenden Mitteln
EDTA, EGTA, Natriumtripolyphosphat, Zeolith und Zitronensäure inhibieren die Aktivität nicht.
4. Alkaliresistente Cellulase nach Anspruch 1, wobei die alkalische Cellulase die nachstehenden enzymatischen Eigenschaften aufweist und K-539 genannt wird.
(1) Wirkung
Wirkt gut auf Cellulosematerialien, einschließlich CMC, Cellulose, Filterpapier und Avicel und ruft bei ihnen Auflösen hervor, wobei reduzierende Zucker, wie Glucose, gebildet werden.
(2) Substratspezifität
Weist nicht nur Aktivität auf CMC auf, sondern auch auf Cellulosepulver, Avicel, Filterpapier und PNPC.
(3) Arbeits-pH und optimaler pH
Der Arbeits-pH-bereich beträgt 3 bis 12,5 und der optimale pH beträgt 7, mit einer relativen Aktivität von nicht weniger als 50 % der Aktivität bei einem optimalen pH, der im Bereich von 4 bis 11 gezeigt wird.
(4) pH-Stabilität
Sehr stabil und nicht inaktiviert bei einem pH von 5 bis 12, mit einer Aktivität von nicht weniger als etwa 50 %, aufrecht gehalten bei einem pH-Wert von 3,5 bis 12,5.
(5) Optimale Temperatur
Die Arbeitstemperatur liegt im breiten Bereich von 15 bis 85ºC und die optimale Temperatur beträgt 60ºC. Im Bereich von 45 bis 75ºC ist die Aktivität nicht weniger als 50 % der Aktivität der optimalen Temperatur.
(6) Molekulargewicht
Die Peaks des Molekulargewichts erscheinen bei etwa 18000 bzw. etwa 29000, (bestimmt durch Gelfiltration unter Verwendung von Sephadex G-100).
(7) Einflüsse von Metallionen
Inhibiert durch Hg²+ und aktiviert durch Ca²+, Cd²+ und Ba²+.
(8) Einflüsse von Tensiden
LAS, AS, ES, AOS, α-SFE, SAS, Seifen und Polyoxyethylensekundäralkylether inhibieren die Aktivität kaum.
(9) Proteinasebeständigkeit
Beständig gegen Proteinasen
(10) Einfluß von chelatbildenden Mitteln
EDTA, EGTA, Natriumtripolyphosphat, Zeolith und Zitronensäure inhibieren die Aktivität nicht.
5. Alkalische Cellulase nach Anspruch 1, wobei die Cellulase die nachstehenden enzymatischen Eigenschaften aufweist und K-577 genannt wird.
(1) Wirkung Wirkt gut auf Cellulosematerialien, einschließlich CMC, Cellulose, Filterpapier und Avicel und bewirkt bei ihnen Auflösen, wobei reduzierende Zucker, wie Glucose, gebildet werden.
(2) Substratspezifität
Weist nicht nur Aktivität auf CMC auf, sondern auch auf Cellulosepulver, Avicel und Filterpapier.
(3) Arbeits-pH und optimaler pH
Der Arbeits-pH-bereich beträgt 3 bis 12 und der optimale pH-Bereich beträgt 7, mit einer relativen Aktivität von nicht weniger als 50 % der Aktivität bei einem optimalen pH- Bereich, gezeigt im Bereich von 4,5 bis 10,5.
(4) pH-Stabilität
Sehr stabil und nicht inaktiviert bei einem pH von 5 bis 12, mit einer Aktivität von nicht weniger als etwa 50 %, gehalten bei einem pH-Wert von 4,5 bis 12,5.
(5) Optimale Temperatur
Die Arbeitstemperatur liegt im breiten Bereich von 15 bis 75ºC und die optimale Temperatur beträgt 60ºC. Im Bereich von 40 bis 65ºC ist die Aktivität nicht weniger als 50 % der Aktivität bei der optimalen Temperatur.
(6) Molekulargewicht
Die Peaks für das Molekulargewicht erscheinen bei etwa 17000 und etwa 30000, (bestimmt durch Gelfiltration unter Verwendung von Sephadex G-100).
(7) Einflüsse von Metallionen
Inhibiert durch Hg²+ und aktiviert durch Ba²+, Ca²+, Cd²+ und Co²+.
(8) Einflüsse von Tensiden
LAS, AS, ES, AOS, α-SFE, SAS, Seifen und Polyoxyethylensekundäralkylether inhibieren die Aktivität kaum.
(9) Proteinasebeständigkeit
Beständig gegen Proteinasen.
(10) Einflüsse von chelatbildenden Mitteln
EDTA, EGTA, Natriumtripolyphosphat, Zeolith und Zitronensäure inhibieren die Aktivität nicht.
6. Alkaliresistente Cellulase nach Anspruch 1, wobei die alkaliresistente Cellulase die nachstehenden enzymatischen Eigenschaften aufweist und K-588 genannt wird.
(1) Wirkung
Wirkt gut auf Cellulosematerialien, einschließlich CMC und Filterpapier und ruft bei ihnen Auflösung hervor, wodurch reduzierende Zucker, wie Glucose, gebildet werden.
(2) Substratspezifität
Weist nicht nur Aktivität auf CMC auf, sondern auch Aktivität auf Phosphorsäure gequollene Cellulose, Filterpapier und PNPC.
(3) Arbeits-pH und optimaler pH
Der Arbeits-pH-bereich beträgt 3 bis 13 und der optimale pH-Bereich ist 7 mit einer relativen Aktivität von nicht weniger als 50 %, bei einem optimalen pH, gezeigt im Bereich von 4,5 bis 10,5.
(4) pH-Stabilität
Sehr stabil und nicht inaktiviert bei einem pH von 5 bis 11,5 mit einer Aktivität von nicht weniger als etwa 50 %, gehalten bei einem pH-Wert von 4,5 bis 12,5.
(5) Optimale Temperatur
Die Arbeitstemperatur liegt im breiten Bereich von 15 bis 80ºC und die optimale Temperatur beträgt 60ºC. Im Bereich von 45 bis 65ºC ist die Aktivität nicht weniger als 50 % der Aktivität bei der optimalen Temperatur.
(6) Molekulargewicht
Peaks für das Molekulargewicht erscheinen bei etwa 27000 beziehungsweise etwa 30000, (bestimmt durch Gelfiltration unter Verwendung von Biogel P-150).
(7) Einflüsse von Metallionen
Wird durch Hg²+ inhibiert.
(8) Einflüsse von Tensiden
LAS, AS, ES, AOS, α-SFE, SAS und Seife und Polyoxyethylensekundäralkylether inhibieren die Aktivität kaum.
(9) Proteinasebeständigkeit
Beständig gegen Proteinasen.
(10) Einflüsse von chelatbildenden Mitteln
EDTA, EGTA, Natriumtripolyphosphat, Zeolith und Zitronensäure inhibieren die Aktivität nicht.
7. Alkaliresistente Cellulase nach Anspruch 1, wobei die alkaliresistente Cellulase enzymatische Eigenschaften aufweist und K-597 genannt wird.
(1) Wirkung
Wirkt gut auf Cellulosematerialien, einschließlich CMC, Cellulose, Filterpapier und Avicel und ruft bei ihnen Auflösen hervor, wodurch sich reduzierende Zucker, wie Glucose, bilden.
(2) Substratspezifität
Weist nicht nur Aktivität auf CMC auf, sondern auch auf Phosphorsäure gequollene Cellulose, Cellulosepulver, Avicel, Filterpapier und PNPC.
(3) Arbeits-pH und optimaler pH
Der Arbeits-pH-bereich beträgt 3 bis 13 und der optimale pH beträgt 7, mit einer relativen Aktivität von nicht weniger als 50 % der Aktivität bei dem optimalen pH, der im Bereich von 4,5 bis 11,5 gezeigt wird.
(4) pH-Stabilität
Sehr stabil und nicht inaktiviert bei einem pH von 5 bis 11,5 mit einer Aktivität von nicht weniger als etwa 50 %, gehalten bei einem pH-Wert von 4,5 bis 12,5.
(5) Arbeitstemperatur und optimale Temperatur
Die Arbeitstemperatur liegt im Bereich von 15 bis 80ºC und die optimale Temperatur beträgt 60ºC. Im Bereich von 45 bis 75ºC ist die Aktivität nicht geringer als 50 % der Aktivität bei optimaler Temperatur.
(6) Molekulargewicht
Ein Peak für das Molekulargewicht erscheint bei etwa 40000, (bestimmt durch Gelfiltration unter Verwendung von Bio-Gel P-150).
(7) Einflüsse von Metallionen
Wird durch Hg²+ inhibiert und durch Co²+ aktiviert.
(8) Einflüsse von Tensiden
LAS, AS, ES, AOS, α-SFE, SAS, Seifen und Polyoxyethylensekundäralkylether inhibieren die Aktivität kaum.
(9) Proteinasebeständigkeit
Beständig gegen Proteinasen.
(10) Einflüsse von chelatbildenden Mitteln EDTA, EGTA, Natriumtripolyphosphat, Zeolith und Zitronensäure inhibieren die Aktivität nicht.
8. Mikroorganismus, befähigt zur Erzeugung einer alkaliresistenten Cellulase, der in einem neutralen Medium wächst, und gehörig zur Gattung Bacillus, wobei die hergestellte alkaliresistente Cellulase die nachstehenden enzymatischen Eigenschaften aufweist:
(1) arbeitet in einem breiten pH-Bereich von 5 bis 7,
(2) sehr stabil (nicht inaktiviert bei einem pH von 5 bis 10 mit einer Restaktivität, bei einem pH von 4,5 bis 11 von nicht weniger als 50 % der maximalen Aktivität),
(3) die Aktivität wird durch die Anwesenheit von Hg²+ inhibiert und
(4) die Aktivität wird in wesentlichen nicht durch Proteinasen, Tenside und chelatbildende Mittel inhibiert.
9. Mikroorganismus nach Anspruch 9, wobei der Mikroorganismus Bacillus sp. KSM-534 genannt wird und als FERM BP- 1508 hinterlegt ist.
10. Mikroorganismus nach Anspruch 9, wobei der Mikroorganismus Bacillus sp. KSM-344 genannt wird und als FERM BP-1506 hinterlegt ist.
11. Mikroorganismus nach Anspruch 9, wobei der Mikroorganismus Bacillus sp. KSM-539 genannt wird und als FERM BP- 1509 hinterlegt ist.
12. Mikroorganismus nach Anspruch 9, wobei der Mikroorganismus Bacillus sp. KSM-577 genannt wird und als FERM BP-1510 hinterlegt ist.
13. Mikroorganismus nach Anspruch 9, wobei der Mikroorganismus Bacillus sp. KSM-588 genannt wird und als FERM BP- 1513 hinterlegt ist.
14. Mikroorganismus nach Anspruch 9, wobei der Mikroorganismus Bacillus sp. KSM-597 genannt wird und als FERM BP- 1514 hinterlegt ist.
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