DE3789940T2 - Alkalische Cellulasen und Mikroorganismen, fähig zu ihrer Herstellung. - Google Patents
Alkalische Cellulasen und Mikroorganismen, fähig zu ihrer Herstellung.Info
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- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2405—Glucanases
- C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
- C12N9/2437—Cellulases (3.2.1.4; 3.2.1.74; 3.2.1.91; 3.2.1.150)
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
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- C12Y302/01004—Cellulase (3.2.1.4), i.e. endo-1,4-beta-glucanase
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Description
- Die Erfindung betrifft neue alkalische Cellulasen und auch Mikroorganismen, welche in der Lage sind, diese herzustellen, zur Gattung Bacillus gehören und in einem neutralen Medium aufwachsen.
- Die Entwicklung von Cellulasen, wobei es sich um Cellulosezersetzende Enzyme handelt, erfolgte zum Zwecke der wirksamen Nutzung von Biomassen-Reserven und insbesondere Cellulose-Reserven. Als Cellulase erzeugende Pilze oder Bakterien hat man verschiedene Stämme isoliert, und zwar nicht nur Schimmelpilze der Gattungen Aspergillus, Penicillium, Trichoderma, Fusarium, Humicola, Acremonium und dergl., sondern auch Bakterien der Gattungen Pseudomonas, Cellulomonas, Ruminococcus, Bacillus und dergl. und Actinomyceten der Gattungen Streptomyces, Thermoactinomyces und dergl. Derzeit werden jedoch Cellulasen für Biomassen in industriellem Maßstab nicht häufig genutzt.
- Andererseits ist die neue industrielle Nützlichkeit von Cellulasen als Bestandteil von Waschmitteln für Wäsche untersucht worden, was jetzt Beachtung gefunden hat (japanische Patentpublikationen Nr. 59-49279, 60-23158 und 60-36240). Die meisten der von Mikroorganismen in den natürlichen Gebieten erzeugten Cellulasen werden als sogenannte neutrale oder saure Cellulasen klassifiziert, die in einem neutralen bis sauren Bereich ihre optimale und stabile enzymatischen Aktivität zeigen. Nur wenige Cellulasen sind sogenannte alkalische Cellulasen, welche die Erfordernisse für die Formulierung in Waschmittelzusammensetzungen für Wäsche erfüllen oder eine maximale Aktivität in einem alkalischen pH-Bereich zeigen können, und sogenannte alkaliresistente Cellulasen, welche eine Alkaliresistenz zeigen. Der Ausdruck "alkalische Cellulase", wie er hier verwendet wird, soll sich auf solche beziehen, deren optimaler pH in einem alkalischen Bereich liegt und der Ausdruck "alkaliresistente Cellulase" soll sich auf solche beziehen, deren optimaler pH in einem neutralen oder sauren Bereich liegt, die jedoch in einem alkalischen Bereich eine zufriedenstellende Aktivität im Vergleich mit einer Aktivität bei einem optimalen pH aufweist und in einem alkalischen Bereich stabil bleibt. Der Ausdruck "neutral" bedeutet einen pH-Bereich von 6 bis 8 und der Ausdruck "alkalisch" bedeutet einen höheren pH-Bereich.
- Für die Herstellung von alkalischen Cellulasen und alkaliresistenten Cellulasen, die in Waschmitteln für Wäsche verwendbar sind, wurden lediglich einige Verfahren vorgeschlagen. Diese Verfahren umfassen beispielsweise eine Methode, bei der Cellulase A gesammelt wird durch Kultivierung von alkalophilen Bacillen der Gattung Bacillus (japanische Patentpublikation Nr. 50-28515), eine Methode, bei der alkalische Cellulase 301- A erzeugt wird durch Kultivierung von alkalophilen Bakterien der Gattung Cellulomonas (japanische Patentanmeldung Offenlegung Nr. 58-224686), eine Methode, bei der Carboxymethylcellulase hergestellt wird durch Kultivierung von alkalophilen Bacillus Nr. 1139 (Fukumori, F., Kudo T. und Horikoshi, K., J. Gen. Microbiol., 131, 3339, (1985)), und eine Methode, bei der eine alkalische Cellulase erzeugt wird durch die Verwendung von einem Stamm der Gattung Streptomyces (japanische Patentanmeldung Offenlegung Nr. 61-19483). Diese Methoden sind jedoch sämtlich für die industrielle Fermentationsproduktion ungeeignet.
- In jüngsten Jahren wurde von uns festgestellt, daß Bacillus sp. KSM-635 (FERM P-8872), wobei es sich um eines der alkalophilen Bakterien handelt, in wirksamer Weise alkalische Cellulase K erzeugen kann, welche als Bestandteil von Waschmitteln für Wäsche (Bekleidung und Stoffe) geeignet ist, und daß eine geeignete Auswahl der Kultivierungsbedingungen es ermöglicht, die Produktivität zu steigern und eine industrielle Fermentationserzeugung der alkalischen Cellulase durchzuführen.
- Die Kultivierungsbedingungen des Bacillus sp. KSM-635 sind jedoch unter industriellen Gesichtspunkten nicht immer vorteilhaft. Genauer gesagt sollte eine alkalophiler Stamm kultiviert werden unter Einhaltung alkalischer pH-Bedingungen während der Kultivierung. Ein sogenanntes alkalisches Fermentationsverfahren unter Verwendung von alkalophilen Stämmen wurde gerade begonnen und man hat noch keine vollständige Kenntnis der physiologischen und biochemischen Eigenschaften dieser alkalophilen Mikroorganismen erlangt. Die Herstellung von Medien und die Art und Weise der Kultivierung, mit der eine industrielle Erzeugung durch Fermentierung zu bewirken ist, bereitet somit Schwierigkeiten.
- Darüberhinaus handelt es sich bei den wahren alkalischen Cellulasen in den oben beschriebenen Dokumenten, welche einen optimalen pH in einem alkalischen Bereich haben, um Enzyme, welche durch Bacillus N1-Stamm, N2-Stamm und N3-Stamm erzeugt werden (japanische Patentpublikation Nr. 50-28515) und die optimale pHs von 8 bis 9, 9 bzw. 8 bis 9 aufweisen. Ferner handelt es sich um ein Enzym, das von Bacillus Nr. 1139 erzeugt wird und einen optimalen pH von 9 aufweist, und um alkalische Cellulase K, die von Bacillus KSM-635 erzeugt wird und einen optimalen pH von 10 aufweist (japanische Patentanmeldung Nr. 61-257776). Es besteht somit ein Bedarf für alkalische Cellulase, welche einen optimalen pH in einem alkalischen Bereich aufweist und in geeigneter Weise in Waschmittelzusammensetzungen formuliert werden kann und einen breiten Arbeits-pH- Bereich aufweist.
- Ausgehend von diesem Sachverhalt haben die Erfinder umfangreiche Untersuchungen durchgeführt mit dem Ziel, alkalische Cellulasen zu erhalten, welche einen optimalen pH in einem alkalischen Bereich aufweisen und in geeigneter Weise in Waschmittelformulierungen formuliert werden können und einen breiten Arbeits-pH-Bereich aufweisen.
- Um die Probleme des Standes der Technik zu lösen, können die alkalischen Cellulasen aus Stämmen erzeugt werden, die unter Verwendung der Gen-Rekombinant-Technik erzeugt wurden, wobei die Stämme, welche in einem neutralen Bereich aufwachsen, als Wirtszellen eingesetzt werden und die entsprechenden Cellulase- Gene geklont werden. In diesem Zusammenhang bestand jedoch eine Erwartung, eine alkalische Cellulase mit einem optimalen pH im alkalischen Bereich in effektiverer Weise zu erzeugen, indem man neutrale Mikroorganismen einsetzt, die in der Natur vorkommen. Die Erfinder haben folglich versucht, derartige alkalische Cellulasen aus Mikroorganismen zu erzeugen, die in der Natur vorkommen und haben dabei festgestellt, daß aus einer Serie von Mikroorganismen der Gattung Bacillus, die in neutralen Medien wachsen die angestrebten alkalischen Cellulasen leicht erzeugt werden können.
- Alkalische Cellulasen gemäß der Erfindung sind wie in Anspruch 1 bis 6 definiert und haben typischerweise die folgenden enzymatischen Eigenschaften:
- (1) Sie haben einen breiten optimalen pH-Bereich von 8 bis 10 mit einer maximalen Aktivität bei einem pH von etwa 10;
- (2) die Aktivität wird durch die Anwesenheit von Hg²&spplus; inhibiert;
- (3) Die Aktivität wird kaum inhibiert mit Proteinasen, oberflächenaktiven Mitteln und Chelatisiermitteln; und
- (4) sie haben die CMCase-Aktivität (Cx-Aktivität) als eine Hauptaktivität mit zusätzlicher Filterpapier-Disintegrier-Aktivität und Avicelase-Aktivität (C&sub1;-Aktivität).
- In den beigefügten Zeichnungen zeigt:
- Fig. 1 eine graphische Darstellung der Beziehung zwischen einem pH für die Enzymreaktion von alkalischer Cellulase K-580 und einer -relativen Aktivität;
- Fig. 2 ist eine graphische Darstellung, welche die Beziehung zwischen einem Behandlungs-pH für das obige Enzym und einer Restaktivität zeigt;
- Fig. 3 ist eine graphische Darstellung, welche die Beziehung zwischen einer Reaktionstemperatur für das obige Enzym und einer relativen Aktivität zeigt;
- Fig. 4 ist eine graphische Darstellung, welche die Aktivitäten bei 15ºC und 20ºC zeigt, wenn die Aktivität des obigen Enzyms bei 30ºC als 100 angenommen wird.
- Fig. 5 ist eine graphische Darstellung, welche die Beziehung zwischen einer Behandlungstemperatur für das obige Enzym und einer Restaktivität zeigt.
- Fig. 6 ist eine graphische Darstellung, welche die Beziehung zwischen einem pH für die Enzymreaktion von alkalischer Cellulase K-425 und einer relativen Aktivität zeigt;
- Fig. 7 ist eine graphische Darstellung, welche einen Behandlungs-pH für K-425 und eine Restaktivität zeigt;
- Fig. 8 ist eine graphische Darstellung, welche eine Reaktionstemperatur für K-425 und eine relative Aktivität zeigt;
- Fig. 9 ist eine graphische Darstellung, welche eine Behandlungstemperatur für K-425 oder eine Restaktivität zeigt;
- Fig. 10 ist eine graphische Darstellung, welche die Beziehung zwischen einem pH für die Enzymreaktion von alkalischer Cellulase K-521 und einer relativen Aktiviät zeigt;
- Fig. 11 ist eine graphische Darstellung der Beziehung zwischen einem Behandlungs-pH für K-521 und einer Restaktivtät;
- Fig. 12 ist eine graphische Darstellung der Beziehung zwischen einer Reaktionstemperatur für K-521 und einer relativen Aktivität;
- Fig. 13 ist eine graphische Darstellung der Beziehung zwischen einer Behandlungstemperatur für K-521 und einer Restaktivität.
- Fig. 14 ist eine graphische Darstellung der Beziehung zwischen einem pH für die Enzymreaktion von alkalischer Cellulase K-522 und einer relativen Aktivität;
- Fig. 15 ist eine graphische Darstellung der Beziehung zwischen einem Behandlungs-pH für K-522 und einer Restaktivität;
- Fig. 16 ist eine graphische Darstellung der Beziehung zwischen einer Reaktionstemperatur für K-522 und einer relativen Aktivität;
- Fig. 17 ist eine graphische Darstellung der Beziehung zwischen einer Behandlungstemperatur für K-522 und einer Restaktivität;
- Fig. 18 ist eine graphische Darstellung der Beziehung zwischen einem pH für die Enzymreaktion von alkalischer Cellulase E-II und einer relativen Aktivität;
- Fig. 19 ist eine graphische Darstellung der Beziehung zwischen einem Behandlungs-pH für E-II und einer Restaktivität;
- Fig. 20 ist eine graphische Darstellung der Beziehung zwischen einer Reaktionstemperatur für E-II und einer relativen Aktivität;
- Fig. 21 ist eine graphische Darstellung der Beziehung zwischen einer einer Behandlungstemperatur für E-II und einer Restaktivität;
- Fig. 22 ist eine Ionenaustauschchromatogramm, das in der dritten Reinigungsstufe erhalten wurde;
- Fig. 23 ist eine Karte, welche die Ergebnisse der SDS/Polyacrylamidgel-Elektrophorese von alkalischen Cellulasen E-II und E-III zeigt;
- Fig. 24 ist ein UV-Absorptionsspektrum von alkalischer Cellulase E-II;
- Fig. 25 ist eine graphische Darstellung der Beziehung zwischen einem pH für die Enzymreaktion von alkalischer Cellulase E-III und einer relativen Aktivität;
- Fig. 26 ist eine graphische Darstellung der Beziehung zwischen einem Behandlungs-pH für E-III und einer Restaktivität;
- Fig. 27 ist eine graphische Darstellung der Beziehung zwischen einer Reaktionstemperatur von E-III und einer relativen Aktivität;
- Fig. 28 ist eine graphische Darstellung der Beziehung zwischen einer Behandlungstemperatur für E-III und einer Restaktivität;
- Fig. 29 ist ein UV-Absorptionsspektrum von alkalischer Cellulase E-III.
- Beispiele der Mikroorganismen mit der Fähigkeit zur Erzeugung der alkalischen Cellulasen der vorliegenden Erfindung umfassend Stämme, die aus dem Boden von Haga-gun und Nikko-shi in Tochigi, Japan isoliert wurden.
- Diese Stämme haben die folgenden mykologischen Eigenschaften. Es sei darauf hingewiesen, daß die Klassifizierung der Stämme unter Verwendung der folgenden Medien in Nummern 1 bis 25 (wobei die Werte Gew.% bedeuten) durchgeführt wurden.
- Medium 1: Fleischextrakt, 1,0; Bacto peptone®, 1,0; NaCl, 0,5; Bacto Agar® , 1,5 (pH 7,2).
- Medium 2: Fleischextrakt, 1,0; Bacto peptone®, 1,0; NaCl, 0,5 (pH 7,2).
- Medium 3: Fleischextrakt, 1,0; Bacto peptone®, 1,0; NaCl, 0,5; Gelatine, 1,0 (pH 7,2).
- Medium 4: Bacto litmus milk®, 10,0.
- Medium 5: Bacto peptone®, 1,0; KNO&sub3;, 0,1.
- Medium 6: Bacto peptone®, 1,0; NaNO&sub3;, 0,1.
- Medium 7: Bacto peptone®, 0,7; NaCl, 0,5; Glucose, 0,5 (pH 7,0).
- Medium 8: Bacto peptone®, 1,0.
- Medium 9: TSI Agar (von Eiken Chem. Co. Ltd., Japan), angegebene Menge.
- Medium 10: Fleischextrakt, 1,0 Bacto peptone®, 1,0; NaCl, 0,5; lösliche Stärke, 0,2; Agar, 1,5.
- Medium 11: NaNH&sub4;HPO&sub4;·4H&sub2;O, 0,15; KH&sub2;PO&sub4;, 0,1; MgSO&sub4;·7H&sub2;O, 0,02; Natriumcitrat, 0,25 (pH 6,8).
- Medium 12: Christensen's Medium (Eiken Chem. Co., Ltd., Japan) angegebene Menge.
- Medium 13: Glucose, 1,0; KH&sub2;PO&sub4;, 0,1; MgSO&sub4;·7H&sub2;O, 0,05; KCl, 0,02; Stickstoffquellen, 0,1 (pH 7,2). Die verwendeten Stickstoffquellen sind Natriumnitrat und Amoniumsulfat.
- Medium 14: King A Medium® "Eiken" (Eiken Chem. Co., Ltd., Japan), angegebene Menge.
- Medium 15: King B Medium® "Eiken" (Eiken Chem. Co., Ltd., Japan), angegebene Menge.
- Medium 16: Harnstoffmedium "Eiken" (Eiken Chem. Co., Ltd., Japan) angegebene Menge.
- Medium 17: Filterpapier für Cytochrom-Qxidasetest (Nisshui Pharm Co., Ltd., Japan).
- Medium 18 : 3% Wasserstoffperoxid wäßrige Lösung.
- Medium 19: OF Basalmedium (Difco Lab.), angegebene Menge.
- Medium 20: (NH&sub4;)&sub2;HPO&sub4;, 0,1; KCl, 0,02; MgSO&sub4;·7H&sub2;O, 0,02; Hefeextrakt, 0,02; Bacto Agar®, 2,0; BCP (0,2%ige Lösung), 0,4.
- Medium 21: Bacto® Sabouraud's Dextrose Agar medium (Difco Lab.), angegebene Menge.
- Medium 22: Fleischextrakt, 0,3 Bacto Pepton, 0,5; Hefeextrakt, 1,0; Glycerin, 2,0.
- Medium 23: Phenylalaninmalonsäuresalz-Medium (Nisshui Pharm. Co., Ltd., Japan), angegebene Menge.
- Medium 24: Magermilch, 5,0; Bacto Agar, 1,5.
- Medium 25: Fleischextrakt, 0,3; Bacto Pepton, 0,5; L-Tyrosin, 0,5; Bacto Agar, 1,5.
- Bacillus sp. KSM-580:
- (a) Bacillus sp. KSM-580 hat eine Körpergröße von 0,4 bis 0,8 um·1,5 bis 5,0 um und hat ein zylindrisches oder elliptisches Endosporum (0,4 bis 0,8 um·0,8 bis 1,2 um) am Ende des Körpers. Das Bacillus hat marginale Flagellaten und ist mobil. Die Gram-Färbung ist positiv. Nicht säurefest.
- (b) Wachstum in verschiedenen Medien:
- Der Wuchszustand ist schwach. Die Gestalt der Kolonien hat eine runde oder unregelmäßige Form mit einer glatten Oberfläche und mit einem glatten oder blattartigen Rand. Der Farbton der Kolonien ist hellgelb, semitransparent und glänzend.
- Schwaches Wachstum mit einer ausbreitenden Form und glänzender, hellgelber Farbe und semitransparent.
- Wachstum. Insbesondere die oberen Schichten werden trüb.
- Wachstum an der Oberflächenschicht wobei die Gelatine verflüssigt wird.
- Die Verflüssigung der Milch wird festgestellt. Das Lackmus ändert seine Farbe nicht.
- (c) Physiologische Eigenschaften:
- (1) Die Reduktion und Denitrifizierungsreaktionen von Nitrat (Medium 5 und 6) sind beide negativ.
- (2) MR-Test (Medium 7).
- Es ist nicht eindeutig, ob der Test negativ oder positiv ist (pH 5,2).
- (3) VP-Test (Medium 7).
- Es ist nicht eindeutig, ob der Test negativ oder positiv ist (pH 5,2).
- (4) Bildung von Indol (Medium 8).
- Negativ.
- (5) Bildung von Wasserstoffsulfid (Medium 9).
- Negativ.
- (6) Hydrolyse von Stärke (Medium 10).
- Positiv.
- (7) Nutzung von Zitronensäure (Medien 11, 12).
- Negativ in einem Koser's Medium positiv in einem Christensen Medium.
- (8) Nutzung von anorganischen Stickstoffquellen (Medium 13).
- Positiv hinsichtlich Nitrat und Ammoniumsalz.
- (9) Bildung von Pigment (Medien 14, 15).
- Negativ.
- (10) Urease (Medium 16).
- Negativ.
- (11) Oxidase (Medium 17).
- Positiv.
- (12) Catalse (Medium 18).
- Positiv.
- (13) Temperatur und pH-Bereiche fürs Wachstum (Medium 2).
- Der Temperaturbereich für das Wachstum beträgt 15 bis 50ºC und ein optimaler Temperaturbereich ist 25 bis 40ºC. Der pH-Bereich für das Wachstum beträgt 5 bis 11 und ein optimaler pH-Bereich ist 6 bis 10.
- (14) Verhalten gegenüber Sauerstoff.
- Fakultativ anaerobisch.
- (15) O-F Test (Medium 19).
- Obwohl Wachstum stattfindet, ist das Wachstum sowohl aerobisch oder anaerobisch gering.
- (16) Nutzung von Zuckern (+: Nutzung, -: keine Nutzung).
- 1. L-Arabinose +
- 2. D-Xylose +
- 3. D-Glucose +
- 4. D-Mannose +
- 4. Fructose +
- 6. D-Galactose +
- 7. Maltose +
- 8. Sucrose +
- 9. Lactose +
- 10. Trehalose -
- 11. D-Sorbitol +
- 12. D-Mannitol +
- 13. Inositol +
- 14. Glycerin +
- 15. Stärke +
- (17) pH in VP-Medium (Medium 7).
- pH 5.2.
- (18) Wachstum in einem salzhaltigen Medium (modifiziertes Medium 1).
- Wachstum bei 5%.
- Wachstum bei 7%.
- Kein Wachstum bei 10%.
- (19) Wachstum bei pH 5,7 (Medium 21).
- Wachstum.
- (20) Bildung von Dihydroxyaceton (Medium 22).
- Negativ.
- (22) Deaminierung von Phenylalanin (Medium 23).
- Negativ.
- (22) Zersetzung von Casein (Medium 24).
- Positiv.
- (23) Zersetzung von Tyrosin (Medium 25).
- Negativ.
- Bacillus sp. KSM-425:
- Bacillus sp. KSM-425 hat eine Körpergröße von 0,4 bis 0,8 um· 1,5 bis 4,0, um bildet ein elliptisches Endosporum (0,8 bis 1,2 um·1,2 bis 1,5 um) an einem Ende des Körpers. Es hat ein marginales Flagellat und ist mobil. Die Gram-Färbung ist unbestimmt. Nicht säurefest.
- Der Wuchszustand ist gering. Die Gestalt der Kolonien ist kreisförmig mit einer glatten Oberfläche und einem glatten Rand. Der Farbton der Kolonien ist weiß und die Kolonien sind semitransparent und glänzend.
- Das Wachstum ist schlecht und sein Zustand ist der eines ausgebreiteten Tuchs und glänzend mit weißer Farbe und semitransparent.
- Wächst und wird trüb.
- Wächst, jedoch in einem schlechten Zustand. Die Verflüssigung von Gelatine wird nicht festgestellt.
- Die Koagulation und Verflüssigung der Milch wird nicht festgestellt. Beim Lackmus tritt keinerlei Farbänderung ein.
- Beides negativ.
- Es ist nicht klar, ob der Test negativ oder positiv ist (pH 5,2).
- Negativ (pH 5,2).
- Negativ.
- Negativ.
- Positiv.
- Negativ sowohl in einem Koser's Medium als auch in Christensen's Medium.
- Negativ hinsichtlich Nitrat und Ammoniumsalz.
- Negativ.
- Negativ.
- Positiv.
- Positiv.
- Der Temperaturbereich für das Wachstum beträgt 15 bis 37 C und ein optimaler Temperaturbereich ist 25 bis 30ºC. Der pH-Bereich für das Wachstum ist 5 bis 10 und ein optimaler pH-Bereich ist 6 bis 9.
- Fakultativ anaerobisch.
- Obwohl Wachstum stattfindet, ist das Wachstum schlecht und zwar sowohl aerobisch als auch anaerobisch.
- 1. L-Arabinose +
- 2. D-Xylose +
- 3. D-Glucose +
- 4. D-Mannose +
- 4. Fructose +
- 6. D-Galactose +
- 7. Maltose +
- 8. Sucrose +
- 9. Lactose +
- 10. Trehalose +
- 11. D-Sorbitol +
- 12. D-Mannitol +
- 13. Inositol -14. Glycerin +
- 15. Stärke +
- pH 5.2.
- Kein Wachstum bei 5%.
- Kein Wachstum bei 7%.
- Kein Wachstum bei 10%.
- Kein Wachstum.
- Es ist nicht klar, ob die Bildung negativ oder positiv ist.
- Negativ.
- Negativ.
- Negativ.
- Bacillus sp. KSM-521:
- (a) Ergebnisse der mikroskopischen Beobachtung:
- Bacillus sp. KSM-521 hat eine Körpergröße von 0,6 bis 0,8 um · 1,0 bis 2,0 um und bildet ein zylindrisches oder elliptisches Endosporum (0,4 bis 0,8 um · 1,0 bis 2,0 um) im Zentrum des Körpers. Es hat Flagellaten und ist mobil. Die Gram-Färbung ist positiv. Nicht säurefest.
- (b) Wachstum in verschiedenen Medien:
- Der Wuchszustand ist gut. Die Gestalt der Kolonien ist kreisförmig mit einer glatten Oberfläche und mit einem glatten Rand oder blattartigen Form. Der Farbton der Kolonien ist hellgelb, semitransparent und glänzend.
- Wachstum. Der Wuchszustand ist mit einer ausbreitenden Form und glänzender, hellgelber Farbe und semitransparent.
- Wachstum, wird jedoch trüb.
- Wachstum in den Oberflächenbereichen. Die Gelatine verflüssigt sich nicht.
- Die Verflüssigung der Milch wird festgestellt. Das Lackmus ändert seine Farbe nicht
- (c) Physiologische Eigenschaften:
- Beide negativ.
- Positiv.
- Positiv.
- Negativ.
- Negativ.
- Negativ.
- Positiv in in Christensen Medium; es ist nicht klar, ob in Koser's Medium positiv oder negativ.
- Negativ hinsichtlich Nitrat und Amoniumsalz.
- Positiv.
- Negativ.
- Es ist nicht klar, ob positiv oder negativ.
- Positiv.
- Der Temperaturbereich für das Wachstum beträgt 10 bis 50ºC und ein optimaler Temperaturbereich ist 20 bis 40ºC. Der pH-Bereich für das Wachstum beträgt 5 bis 10 und ein optimaler pH-Bereich ist 6 bis 10.
- Aerobisch.
- Oxidation. (16) Bildung einer Säure oder eines Gases aus Zuckern (Medium 20 (+: bildet sich; -: wird nicht gebildet) Säurebildung Gasbildung L-Arabinose D-Xylose D-Glucose D-Mannose Fructose D-Galactose Maltose Sucrose Lactose Trehalose D-Sorbitol D-Mannitol Inositol Glycerin Stärke
- pH 5.0.
- Wachstum bei 5%, bei 7% und bei 10% NaCl.
- Wachstum.
- Negativ.
- Negativ.
- Positiv.
- Negativ.
- Bacillus sp. KSM-522:
- (a) Ergebnisse der mikroskopischen Untersuchung:
- Bacillus sp. KSM-522 hat eine Körpergröße von 0,5 bin 0,8 um · 1,0 bis 2,0 um und bildet ein ovales oder ein zylindrisches Endosporum (0,5 bis 0,8 um · 1,0 bis 1,2 um) am Ende des Zentrums des Körpers. Das Bacillus hat marginale Flagellaten und ist mobil. Die Gram-Färbung ist positiv. Nicht säurefest.
- (b) Wachstum in verschiedenen Medien:
- Der Wuchszustand ist gut. Die Gestalt der Kolonien ist kreisförmig mit einer groben Oberfläche und mit einem glatten oder welligen Rand. Der Farbton der Kolonien ist hellgelb und die Kolonien sind semitransparent und glänzend.
- Wachstum mit einer ausbreitenden Form und glänzend, mit milchig-weißer oder hellgelber Farbe und semitransparent.
- Wachstum und wird trüb.
- Wachstum in den Oberflächenbereichen. Verflüssigung der Gelatine wird festgestellt.
- Die Verflüssigung der Milch wird festgestellt. Das Lackmus ändert jedoch seine Farbe nicht.
- (c) Physiologische Eigenschaften:
- Beide negativ.
- Positiv.
- Positiv.
- Negativ.
- Negativ.
- Negativ.
- Positiv in Christensen Medium, es ist jedoch nicht klar, ob in Koser's Medium positiv oder negativ.
- Negativ hinsichtlich Nitrat und Ammoniumsalz.
- Ein wasserlösliches Pigment wird in dem King B Medium gebildet.
- Negativ
- Es ist nicht klar, ob negativ oder positiv.
- Positiv.
- Der Temperaturbereich für das Wachstum beträgt 10 bis 50ºC und ein optimaler Temperaturbereich ist 20 bis 40ºC. Der pH-Bereich für das Wachstum beträgt 5 bis 10 und ein optimaler pH-Bereich ist 6 bis 10.
- Aerobisch.
- Oxidation. (16) Bildung einer Säure oder eines Gases aus Zuckern (Medium 20 (+: bildet sich; -: wird nicht gebildet) Säurebildung Gasbildung L-Arabinose D-Xylose D-Glucose D-Mannose Fructose D-Galactose Maltose Sucrose Lactose Trehalose D-Sorbitol D-Mannitol Inositol Glycerin Stärke
- pH 5,0 bis 5,2 (siebter Tag).
- Wachstum bei 5%, bei 7% bei 10% NaCl.
- Wachstum.
- Positiv.
- Die obigen mykologischen Eigenschaften werden verglichen unter Bezugnahme auf Bergey's Mannual of Determinative Bacteriology, 8th edition und "The Genus Bacillus", in Agriculture Handbook Nr. 427, geschrieben von Ruth E. Gordon, Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture, Washington D.C. (1973). Dabei wird als Ergebnis festgestellt, daß alle Stämme der Erfindung als Mikroorganismen angesehen werden, die zur Gattung Bacillus gehören. Die Stämme der Erfindung sind offenbar verschieden von sogenannten alkalophilen Mikroorganismen, über welche kürzlich von Horikoshi und Akiba berichtet wurde ("Alkalophilic Microorganism", Japan Scientific Society Press (Tokyo), 1982). Das liegt daran, daß die alkalophilen Mikroorganismen in einem alkalischen Medium mit einem pH nicht weniger als 8 wachsen und in einem neutralen oder niedrigen pH-Bereich nicht wachsen können. Demgegenüber können die Stämme der Erfindung in einem schwach sauren bis alkalischen Bereich (pH 5 bis 10) wachsen. Die Stämme der Erfindung können somit als gewöhnliche Mikroorganismen der Gattung Bacillus angesehen werde, welche unter neutralen Bedingungen wachsen.
- Ein genauere Untersuchung der Stämme der Erfindung zeigt, daß die Spezies, die dem Stamm von Bacillus sp. KSM-580 am meisten analog ist, Bacillus licheniformis sein könnte. Der Vergleich zwischen dem erfindungsgemäßen Stamm und bekannten Stämmen, die zu Bacillus licheniformis gehören, zeigt jedoch, daß der KSM-580 Stamm sich von den bekannten Stämmen im Hinblick auf die Reduzierbarkeit von Nitraten unterscheidet. Darüber hinaus können die obigen bekannten Stämme zumindest alkalische Cellulasen nicht erzeugen und der Stamm der vorliegenden Erfindung wird somit als ein neuer Stamm angesehen.
- Die Spezies, die dem Bacillus sp. KSM-425 am meisten analog ist, könnte Bacillus circulans sein. Der Vergleich zwischen bekannten Stämmen, die den Circulanital angehören, und dem Stamm der Erfindung zeigt einen Unterschied bei der Fähigkeit der Hydrolyse von Gelatine. Darüber hinaus produzieren die bekannten Stämme keine alkalischen Cellulasen. Der KSM-425 wird daher als ein neuer Stamm angesehen.
- Die Spezies, die den Bacillus sp. KSM-521 und KSM-522 Stämmen am meisten analog ist, könnte Bacillus pumilus sein. Bekannte Stämme, die zu Bacillus pumilus gehören, erzeugen jedoch zumindest keine alkalische Cellulasen. KSM-521 und KSM-522 werden daher als neue Stämme angesehen.
- Die Erfinder haben diese Stämme bei Fermentation Research Institut of Japan wie folgt hinterlegt.
- Bacillus sp. KSM-580 als FERM BP-1511
- Bacillus sp. KSM-425 als FERM BP-1505
- Bacillus sp. KSM-521 als FERM BP-1507
- Bacillus sp. KSM-522 als FERM BP-1512
- Um alkalische Cellulasen der Erfindung unter Nutzung dieser Stämme zu erhalten, wird der Stamm in einem Medium okkuliert und auf gewöhnliche Weise kultiviert. Das Medium sollte vorzugsweise zweckentsprechende Mengen an Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthalten, die genutzt werden können. Diese Kohlenstoff- und Stickstoffquellen sind nicht kritisch. Beispiele für die Stickstoffquellen umfassen Maisglutenmehl, Sojabohnenmehl, Maisquellwasser, Casaminosäure, Hefeextrakt, Pharmamedia, Fischmehl, Fleischextrakt, Pepton, Hypro, Ajipower, Maissojabohnenmehl, Kaffeesatz, Baumwollsaatöl-Kuchen, Cultivator, Amiflex, Ajipron, Zest, Ajix und dergl. Die Kohlenstoffquelle umfaßt beispielsweise Pflanzenfasern, wie Kaff, Weizenglutenbrot, Filterpapier, gewöhnliche Papiere, Sägestaub und dergl., Abfallstoffe, Invertzucker, CMC, Avicel, Cellulosebaumwolle, Xylan, Pectin und dergl . . Darüberhinhaus umfassen die nutzbaren Kohlenstoffquellen beispielsweise Arabinose, Xylose, Glucose, Mannose, Fructose, Maltose, Sucrose, Lactose, Trehalose, Mannit, Sorbit, Inositol, Glycerin, lösliche Stärke und dergl., und nutzbare organische Säuren umfassen beispielsweise Zitronensäure, Essigsäure und dergl . . Außerdem können Phosphorsäure und anorganische Salze wie beispielsweise solche von Mg²&spplus;, Ca²&spplus;, Mn²&spplus;, Zn²&spplus;, Co²&spplus;, Na&spplus;, K&spplus; und dergl. und anorganische und organische Spurennährstoffquellen in zweck-entsprechender Weise zugesetzt werden.
- Eine angestrebte alkalische Cellulase kann aus dem so erhaltenen Kulturprodukt isoliert und gereinigt werden gemäß gewöhnlichen Techniken der Sammlung und Reinigung von Enzymen. Genauer gesagt, können die Pilzkörper aus einer Kulturbrühe oder Lösung entfernt werden durch gewöhnliche Fest-Flüssig-Trennungstechniken, wie beispielsweise Zentrifugieren, Filtrieren und dergl., wobei man eine rohe Enzymlösung erhält. Diese rohe Enzymlösung kann so, wie sie ist, verwendet werden oder kann durch Aussalzen, Fällung, Ultrafiltration oder dergl. aufgetrennt werden, um ein rohes Enzym zu erhalten. Das rohe Enzym wird anschließend durch Kristallisation mittels beliebiger bekannter Methoden gereinigt, um ein gereinigtes Enzym zu erhalten.
- Unter den so erhaltenen alkalischen Cellulasen kann die alkalische Cellulase K-522 weiter aufgetrennt werden in neue alkalische Cellulasen E-II und E-III. Für die Herstellung der alkalischen Cellulasen E-II und E-III wird die alkalische Cellulase K-522 fraktioniert gereinigt durch eine geeignete Kombination einer Hydroxyapatit-Chromatographie, einer Ionenaustausch-Chromatographie unter Verwendung von DEAE-Sephadex® (Pharmacia Inc.), DEAE-Cellullose oder dergl., und einer Molekularsieb-Gelchromatographie unter Verwendung von Sephadex® , Biogel® (Bio-Rad Laboratories Inc.) und dergl . .
- Die so erhaltenen alkalischen Cellulasen der vorliegenden Erfindung haben die folgenden enzymatischen Eigenschaften. Es sei darauf hingewiesen, daß die enzymatische Aktivität gemessen wird gemäß der folgenden Verfahrensweise unter Verwendung der folgenden Pufferlösungen.
- pH 3 bis 8 : McIlvaine Pufferlösung
- pH 8 bis 11 : Glycin-Natriumhydroxid-Pufferlösung
- pH 12 bis 13: Kaliumchlorid-Natriumhydroxid-Pufferlösung
- Messung der enzymatischen Aktivität:
- 0,1 ml einer Enzymlösung wird zu 0,9 ml einer Basenlösung gegeben, welche 10 mg CMC (A-OIL von Sanyo Kokusaku Pulp Co., Ltd., Japan) und 100 uMol der jeweiligen Pufferlösungen enthält (McIlvaine, Phosphorsäure, Glycin-NaOH und dergl.), gefolgt von einer Reaktion bei 30 C während 20 min. Nach Beendigung der Reaktion werden (die resultierenden) reduzierenden Zucker quantitativ bestimmt gemäß der 3,5-Dinitrosalicylsäure- (DNS)-Methode. Genauer gesagt werden 1,0 ml des DNS-Reagens zu 1,0 ml der Reaktionslösung gegeben und für die Farbentwicklung 5 min bei 100ºC erhitzt. Nach dem Abkühlen werden 4,0 ml entsalztes Wasser zur Verdünnung zugegeben. Die verdünnte Lösung wird der Colorimetrie unterzogen, wobei eine Wellenlänge von 535 nm verwendet wird. Die Enzymstärke wird ausgedrückt als eine Einheit, wobei es sich um eine Menge des Enzyms handelt, die ausreicht, um unter den obigen Bedingungen einen reduzierenden Zucker zu erzeugen, der 1 uMol Glucose entspricht.
- Eine geeignete Menge an CMCase wird bei 30ºC auf 1,0 ml einer Reaktionslösung einwirken lassen, welche 0,1 uMol PNPC (Sigma Co., Ltd.) und 100 uMol einer Phosphatpufferlösung (pH 7,0) enthält. Dazu werden 0,3 ml 1M Na&sub2;CO&sub3; und 1,7 ml entsalztes Wasser aufeinander folgend zugesetzt, woraufhin das resultierende, frei gesetzte p-Nitrophenol bei 400 nm der Colorimetrie unterworfen wird. Die Enzymstärke wird ausgedrückt als eine Einheit, wobei es sich um eine Menge des Enzyms handelt, die unter den obigen Reaktionsbedingungen während 1 Minute ausreicht zur Freisetzung von 1 uMol p-Nitrophenol.
- Eine geeignete Menge einer Enzymlösung wird zu 2,0 ml einer Reaktionslösung gegeben, welche 20 mg Avicel (Merck Inc.) und 200 uMol einer Phosphatpufferlösung (pH 7,0) enthält, gefolgt von Schütteln zur Umsetzung bei 30ºC mit 250 UpM. Nach Beendigung der Reaktion wird die Lösung gekühlt und zentrifugiert (5ºC, 3000 UpM, 20 min) und 1,0 ml der resultierenden überstehenden Flüssigkeit wird einer quantitativen Bestimmung von reduzierendem Zucker gemäß der 3,5-Dinitrosalicylsäure- (DNS)-Methode unterzogen. Die obige Verfahrensweise wird wiederholt zur Bestimmung einer Cellulosepulverzersetzungsaktivität unter Verwendung von Cellulosepulver (Toyo Filter Paper Co., Ltd.) und zur Bestimmung einer Filterpapierzersetzungsaktivität unter Verwendung eines Filterpapiers (Filterpapier zur Untersuchung der Celluloseaktivität, Toyo Nr. 51-specific). Die Enzymstärke wird ausgedrückt als eine Einheit, wobei es sich um eine Menge des Enzyms handelt, die unter den obigen Bedingungen während 1 min ausreicht zur Erzeugung von reduzierendem Zucker, entsprechend 1 uMol Glucose.
- Eine geeignete Menge von CMCase wird eine zweckentsprechende Zeit auf eine 1,0 ml-Reaktionslösung einwirken lassen, die 10 mg Cellobiose (Kanto Chem. Co., Ltd.) und 100 uMol einer Phosphatpufferlösung (pH 7,0) enthält. Anschließend erfolgt eine Behandlung während 2 min bei 100ºC, wobei das Enzym inaktiviert wird. Anschließend wird die Menge der resultierenden Glucose gemessen mit der Mutarotase-GOD-Methode (Glucose C- Test, Wako Junyaku Ind. Co., Ltd.). Die Enzymstärke wird ausgesdrückt als eine Einheit, wobei es sich um eine Menge des Enzyms handelt, die unter den obigen Bedingungen während 1 min ausreicht zur Erzeugung von 2 uMol Glucose.
- Alkalische Cellulase K-580:
- Wirkt gut auf cellulosische Materialien, wie beispielsweise CMC, Cellulose, Filterpapier, Avicel® und dergl. und verursacht ihre Auflösung, wobei reduzierende Zucker, wie beispielsweise Glucose, gebildet werden.
- Dieses Enzym zeigt Aktivität nicht nur bei CMC, sondern auch bei Cellulosepulver, Avicel® und Filterpapier.
- Der Arbeits-pH reicht sehr breit von 3 bis 12,5 und der optimale pH liegt im breiten Bereich von 7 bis 10. In einem Bereich von 4,5 bis 10,5 beträgt die relative Aktivität nicht weniger als 50% der Aktivität, die in dem optimalen pH-Bereich vorliegt. Folglich wird von diesem Enzym angenommen, daß es eine zufriedenstellende Aktivität auf der äußerst alkalischen Seite unter den bekannten alkalischen Cellulasen, die bisher untersucht worden sind, zeigt (Fig. 1).
- Die Restaktivität wird gemessen, nachdem man das Enzym bei verschiedenen pH's bei 30ºC während 1 Stunde gehalten hat, um die pH-Stabilität zu bestimmen. Als Ergebnis findet man, daß das Enzym äußerst stabil ist und bei einem pH von 4,5 bis 12 nicht inaktiviert wird. In einem pH-Bereich von 3,5 bis 12,5 wird eine Aktivität von etwa 50% oder darüber aufrechterhalten. Das vorliegende Enzym ist somit in einem alkalischen Bereich zufriedenstellend stabil (Fig. 2).
- Die Arbeitstemperatur liegt in einem breiten Bereich von 15 bis 80ºC und die optimale Temperatur findet man bei 65ºC. In einem Temperaturbereich von 50 bis 75ºC ist die Aktivität 50% oder höher, bezogen auf die Aktivität bei der optimalen Temperatur (Fig. 3). Bei 15ºC ist die Aktivität nicht weniger als 40% der Aktivität bei 30ºC (Fig. 4).
- Nach Behandlung bei dem optimalen pH während 30 min bei unterschiedlichen Temperaturen wird die Restaktivität gemessen. Als Ergebnis stellt man fest, daß es bei 55ºC stabil ist und bei 65ºC eine Restaktivität von etwa 50% erhalten wird (Fig. 5).
- Das Molekulargewicht des vorliegenden Enzyms wird gemäß der Gelfiltrationsmethode unter Verwendung von Sephadex®G-100 bestimmt mit dem Ergebnis, daß es etwa 18 000 und 50 000 beträgt.
- Das vorliegende Enzym wird einer Bestimmung des Einflusses von verschiedenen Metallionen unterworfen (Al³&spplus;, Fe³&spplus;, Ca²&spplus;, Cd²&spplus;, Co²&spplus; , Cr²&spplus; , Cu²&spplus;, Fe²&spplus; , Hg²&spplus; , Mn²&spplus; , Mo²&spplus; , Ni²&spplus;+ , Pb²&spplus; , Zn²&spplus; Li&spplus;, K&spplus; und Na&spplus;), indem man den Ionen gestattet, während der Zeit der Messung der Aktivität zu coexistieren (dabei beträgt die Konzentration von K&spplus; oder Na&spplus; 50 mM und die Konzentration der anderen Ionen beträgt 1 mM). Als Ergebnis wird festgestellt, daß die Aktivität mit Hg²&spplus; inhibiert wird, jedoch mit Ba²&spplus;, Ca²&spplus;, Co²&spplus; und Cd²&spplus; weiter gesteigert wird.
- Der Einfluß verschiedener oberflächenaktiver Mittel (z. B. LAS, AS, ES, AOS, alpha-SFE, SAS, Seife und Polyoxyethylen-sekundärer Alkylether) auf die Enzymaktivität wird bestimmt. Das vorliegende Enzym wird mit einer 0,05%igen Lösung des jeweiligen oberflächenaktiven Mittels bei 30ºC während 15 min behandelt und einer Messung der Aktivität unterworfen. Als Ergebnis stellt man fest, daß keinerlei Inhibierung der Aktivität durch irgendein oberflächenaktives Mittel stattfindet. Darüber hinaus wird die Inhibierung der Aktivität nicht festgestellt, wenn man Natriumdodecylsulfat verwendet, was ein potentielles Waschmittel ist.
- Proteinasen für Waschmittel, wie beispielsweise API-21® (Showa Denko Co., Ltd.), Maxatase® (Gist Co., Ltd.) und Alkalase® (Novo Co., Ltd.), läßt man zum Zeitpunkt der Messung der Aktivität coexistieren (0,1 mg/ml), um ihren Einfluß zu bestimmen. Man stellt fest, daß das Enzym eine hohe Resistenz gegen diese Proteinasen aufweist.
- Chelatisiermittel, wie beispielsweise EDTA, EGTA, Natriumtripolyphosphat, Zeolith und Zitronensäure, läßt man zu Zeitpunkt der Messung der Aktivität coexistieren, mit dem Ergebnis, daß keine Inhibierung erkannt wird.
- Alkalische Cellulase K-425:
- Wirkt gut auf cellulosische Materialien, wie beispielsweise CMC, Cellulose, Filterpapier, Avicel® und dergl., und verursacht ihre Auflösung, wobei reduzierende Zucker, wie beispielsweise Glucose, gebildet werden.
- Dieses Enzym zeigt Aktivität nicht nur bei CMC, sondern auch bei Cellulosepulver, Avicel® , Filterpapier, PNPC und Cellobiose.
- Der Arbeits-pH reicht sehr breit von 3,5 bis 12,5 und der optimale pH liegt im breiten Bereich von 8 bis 10. In einem Bereich von 5,5 bis 10,5 beträgt die relative Aktivität nicht weniger als 50% der Aktivität, die in dem optimalen pH- Bereich vorliegt. Folglich wird von diesem Enzym angenommen, daß es eine zufriedenstellende Aktivität auf der äußerst alkalischen Seite unter den bekannten alkalischen Cellulasen, die bisher untersucht worden sind, zeigt (Fig. 6).
- Die Restaktivität wird gemessen, nachdem man das Enzym bei verschiedenen pH's bei 30ºC während 1 Stunde gehalten hat, um die pH-Stabilität zu bestimmen. Als Ergebnis findet man, daß das Enzym äußerst stabil ist und bei einem pH von 5 bis 11 nicht inaktiviert wird. In einem pH-Bereich von 3 bis 12 wird eine Aktivität von etwa 50% oder darüber aufrechterhalten. Das vorliegende Enzym ist somit in einem hochalkalischen Bereich zufriedenstellend stabil (Fig. 7).
- Die Arbeitstemperatur liegt in einem breiten Bereich von 15 bis 75ºC und die optimale Temperatur findet man bei 50ºC. In einem Temperaturbereich von 35 bis 55ºC ist die Aktivität 50 % oder höher, bezogen auf die Aktivität bei der optimalen Temperatur (Fig. 8).
- Nach Behandlung bei dem optimalen pH während 30 min bei unterschiedlichen Temperaturen wird die Restaktivität gemessen. Als Ergebnis stellt man fest, daß es bei 30ºC stabil ist und bei 50ºC eine Restaktivität von etwa 50% erhalten wird (Fig. 9).
- Das Molekulargewicht des vorliegenden Enzyms wird gemäß der Gelfiltrationsmethode unter Verwendung von Sephadex® G-100 bestimmt mit dem Ergebnis, daß es etwa 35 000 beträgt.
- Das vorliegende Enzym wird einer Bestimmung des Einflusses von verschiedenen Metallionen unterworfen (Al³&spplus;, Fe³&spplus;, Ca²&spplus;, Cd²&spplus;, Co²&spplus;, Cr²&spplus;, Cu²&spplus;, Fe²&spplus;, Hg²&spplus;, Mn²&spplus;, Mo²&spplus;, Ni²&spplus; , Pb²&spplus;, Zn²&spplus; Li&spplus;, K&spplus; und Na&spplus;), indem man den Ionen gestattet, während der Zeit der Messung der Aktivität zu coexistieren (dabei beträgt die Konzentration von K&spplus; oder Na&spplus; 50 mM und die Konzentration der anderen Ionen beträgt 1 mM). Als Ergebnis wird festgestellt, daß die Aktivität mit Hg²&spplus; und Ba²&spplus; inhibiert wird, jedoch mit Co²&spplus; weiter gesteigert wird.
- Der Einfluß verschiedener oberflächenaktiver Mittel (z. B. LAS, AS, ES, AOS, alpha-SFE, SAS, Seife und Polyoxyethylen-sekundärer Alkylether) auf die Enzymaktivität wird bestimmt. Das vorliegende Enzym wird mit einer 0,05%igen Lösung des jeweiligen oberflächenaktiven Mittels bei 30ºC während 15 min behandelt und einer Messung der Aktivität unterworfen. Als Ergebnis stellt man fest, daß keinerlei Inhibierung der Aktivität durch irgendein oberflächenaktives Mittel stattfindet. Darüber hinaus wird die Inhibierung der Aktivität nicht festgestellt, wenn man Natriumdodecylsulfat verwendet, was ein potentielles Waschmittel ist.
- Proteinasen für Waschmittel, wie beispielsweise API-21® (Showa Denko Co., Ltd.), Maxatase® (Gist Co., Ltd.) und Alkalase® (Novo Co., Ltd.), läßt man zum Zeitpunkt der Messung der Aktivität coexistieren (0,1 mg/ml), um ihren Einfluß zu bestimmen. Man stellt fest, daß das Enzym eine hohe Resistenz gegen diese Proteinasen aufweist.
- Chelatisiermittel, wie beispielsweise EDTA, EGTA, Natriumtripolyphosphat, Zeolith und Zitronensäure, läßt man zu Zeitpunkt der Messung der Aktivität coexistieren, mit dem Ergebnis, daß keine Inhibierung erkannt wird.
- Alkalische Cellulase K-521:
- Wirkt gut auf cellulosische Materialien, wie beispielsweise CMC, Cellulose, Filterpapier, Avicel® und dergl., und verursacht ihre Auflösung, wobei reduzierende Zucker, wie beispielsweise Glucose, gebildet werden.
- Dieses Enzym zeigt Aktivität nicht nur bei CMC, sondern auch bei Cellulosepulver, Avicel®, Filterpapier, p-Nitrophenylcellobioside und Cellobiose.
- Der Arbeits-pH reicht sehr breit von 3 bis 12,5 und der optimale pH liegt im breiten Bereich von 7 bis 10. In einem Bereich von 4,5 bis 10,5 beträgt die relative Aktivität nicht weniger als 50% der Aktivität, die in dem optimalen pH- Bereich vorliegt. Folglich wird von diesem Enzym angenommen, daß es eine zufriedenstellende Aktivität auf der äußerst alkalischen Seite unter den bekannten alkalischen Cellulasen, die bisher untersucht worden sind, zeigt (Fig. 10).
- Die Restaktivität wird gemessen, nachdem man das Enzym bei verschiedenen pH's bei 30ºC während 1 Stunde gehalten hat, um die pH-Stabilität zu bestimmen. Als Ergebnis findet man, daß das Enzym sehr stabil ist und bei einem pH von 5 bis 12 nicht inaktiviert wird. In einem pH-Bereich von 4,5 bis 12,5 wird eine Aktivität von etwa 50% oder darüber aufrechterhalten. Das vorliegende Enzym ist somit in einem hochalkalischen Bereich zufriedenstellend stabil (Fig. 11).
- Die Arbeitstemperatur liegt in einem breiten Bereich von 15 bis 80ºC und die optimale Temperatur findet man bei 60ºC. In einem Temperaturbereich von 45 bis 65ºC ist die Aktivität 50 % oder höher, bezogen auf die Aktivität bei der optimalen Temperatur (Fig. 12).
- Nach Behandlung bei dem optimalen pH während 30 min bei unterschiedlichen Temperaturen wird die Restaktivität gemessen. Als Ergebnis stellt man fest, daß es bei 40 C stabil ist und bei 55ºC eine Restaktivität von etwa 50% erhalten wird (Fig. 13).
- Das Molekulargewicht des vorliegenden Enzyms wird gemäß der Gelfiltrationsmethode unter Verwendung von Sephadex® G-100 bestimmt mit dem Ergebnis, daß es etwa 31 000 beträgt.
- Das vorliegende Enzym wird einer Bestimmung des Einflusses von verschiedenen Metallionen unterworfen (Al³&spplus;, Fe³&spplus;, Ca²&spplus;, Cd²&spplus;, Co²&spplus; , Cr²&spplus;, Cu²&spplus;, Fe²&spplus;, Hg²&spplus;, Mn²&spplus;, Mo²&spplus;, Ni²&spplus;, Pb²&spplus;, Zn²&spplus; Li&spplus;, K&spplus; und Na&spplus;), indem man den Ionen gestattet, während der Zeit der Messung der Aktivität zu coexistieren (dabei beträgt die Konzentration von K&spplus; oder Na&spplus; 50 mM und die Konzentration der anderen Ionen beträgt 1 mM). Als Ergebnis wird festgestellt, daß die Aktivität mit Hg²&spplus; und Ba²&spplus; inhibiert wird, jedoch mit Ca²&spplus; weiter gesteigert wird.
- Der Einfluß verschiedener oberflächenaktiver Mittel (z. B. LAS, AS, ES, AOS, alpha-SFE, SAS, Seife und Polyoxyethylen-sekundärer Alkylether) auf die Enzymaktivität wird bestimmt. Das vorliegende Enzym wird mit einer 0,05%igen Lösung des jeweiligen oberflächenaktiven Mittels bei 30ºC während 15 min behandelt und einer Messung der Aktivität unterworfen. Als Ergebnis stellt man fest, daß kaum eine Inhibierung der Aktivität durch irgendein oberflächenaktives Mittel stattfindet. Darüber hinaus wird die Inhibierung der Aktivität nicht festgestellt, wenn man Natriumdodecylsulfat verwendet, was ein potentielles Waschmittel ist.
- Proteinasen für Waschmittel, wie beispielsweise API-21® (Showa Denko Co., Ltd.), Maxatase® (Gist Co., Ltd.) und Alkalase® (Novo Co., Ltd.), läßt man zum Zeitpunkt der Messung der Aktivität coexistieren (0,1 mg/ml), um ihren Einfluß zu bestimmen. Man stellt fest, daß das Enzym eine hohe Resistenz gegen diese Proteinasen aufweist.
- Chelatisiermittel, wie beispielsweise EDTA, EGTA, Natriumtripolyphosphat, Zeolith und Zitronensäure, läßt man zu Zeitpunkt der Messung der Aktivität coexistieren, mit dem Ergebnis, daß keine Inhibierung erkannt wird.
- Alkalische Cellulase K-522:
- Wirkt gut auf cellulosische Materialien, wie beispielsweise CMC, Cellulose, Filterpapier, Avicel® und dergl., und verursacht ihre Auflösung, wobei reduzierende Zucker, wie beispielsweise Glucose, gebildet werden.
- Dieses Enzym zeigt Aktivität nicht nur bei CMC, sondern auch bei Cellulosepulver, mit Phosphorsäure gequollener Cellulose, mit Alkali gequollener Cellulose, Avicel® , Filterpapier und PNPC.
- Der Arbeits-pH reicht sehr breit von 3 bis 12,5 und der optimale pH liegt im breiten Bereich von 7 bis 10. In einem Bereich von 4,5 bis 10,5 beträgt die relative Aktivität nicht weniger als 50% der Aktivität, die in dem optimalen pH- Bereich vorliegt. Folglich wird von diesem Enzym angenommen, daß es eine zufriedenstellende Aktivität auf der äußerst alkalischen Seite unter den bekannten alkalischen Cellulasen, die bisher untersucht worden sind, zeigt (Fig. 14).
- Die Restaktivität wird gemessen, nachdem man das Enzym bei verschiedenen pH's bei 30ºC während 1 Stunde gehalten hat, um die pH-Stabilität zu bestimmen. Als Ergebnis findet man, daß das Enzym sehr stabil ist und bei einem pH von 5 bis 12 nicht inaktiviert wird. In einem pH-Bereich von 4,5 bis 12,5 wird eine Aktivität von etwa 50% oder darüber aufrechterhalten. Das vorliegende Enzym ist somit in einem hochalkalischen Bereich zufriedenstellend stabil (Fig. 15).
- Die Arbeitstemperatur liegt in einem breiten Bereich von 15 bis 80ºC und die optimale Temperatur findet man bei 60ºC. In einem Temperaturbereich von 45 bis 65ºC ist die Aktivität 50 % oder höher, bezogen auf die Aktivität bei der optimalen Temperatur (Fig. 16).
- Nach Behandlung bei dem optimalen pH während 30 min bei unterschiedlichen Temperaturen wird die Restaktivität gemessen. Als Ergebnis stellt man fest, daß es bei 40ºC stabil ist und bei 55ºC eine Restaktivität von etwa 50% erhalten wird (Fig. 17).
- Das Molekulargewicht des vorliegenden Enzyms wird gemäß der Gelfiltrationsmethode unter Verwendung von Bio-Gel®P-150 (Bio-Rad Laboratories Co., Ltd.) bestimmt mit dem Ergebnis, daß es etwa 35 000 beträgt.
- Das vorliegende Enzym wird einer Bestimmung des Einflusses von verschiedenen Metallionen unterworfen (Al³&spplus;, Fe³&spplus;, Ca²&spplus;, Cd²&spplus;, Co²&spplus;, Cr²&spplus;, Cu²&spplus;, Fe²&spplus;, Hg²&spplus;, Mn²&spplus;, Mo²&spplus;, Ni²&spplus;, Pb²&spplus;, Zn²&spplus;, Li&spplus;, K&spplus; und Na&spplus;), indem man den Ionen gestattet, während der Zeit der Messung der Aktivität zu coexistieren (dabei beträgt die Konzentration von K&spplus; oder Na&spplus; 50 mM und die Konzentration der anderen Ionen beträgt 1 mM). Als Ergebnis wird festgestellt, daß die Aktivität mit Hg²&spplus; inhibiert wird.
- Der Einfluß verschiedener oberflächenaktiver Mittel (z. B. LAS, AS, ES, AOS, alpha-SFE, SAS, Seife und Polyoxyethylen-sekundärer Alkylether) auf die Enzymaktivität wird bestimmt. Das vorliegende Enzym wird mit einer 0,05%igen Lösung des jeweiligen oberflächenaktiven Mittels bei 30ºC während 15 min behandelt und einer Messung der Aktivität unterworfen. Als Ergebnis stellt man fest, daß kaum eine Inhibierung der Aktivität durch irgendein oberflächenaktives Mittel stattfindet. Darüber hinaus wird die Inhibierung der Aktivität nicht festgestellt, wenn man Natriumdodecylsulfat verwendet, was ein potentielles Waschmittel ist.
- Proteinasen für Waschmittel, wie beispielsweise API-21® (Showa Denko Co., Ltd.), Maxatase® (Gist Co., Ltd.) und Alkalase® (Novo Co., Ltd.), läßt man zum Zeitpunkt der Messung der Aktivität coexistieren (0,1 mg/ml), um ihren Einfluß zu bestimmen. Man stellt fest, daß das Enzym eine hohe Resistenz gegen diese Proteinasen aufweist.
- Chelatisiermittel, wie beispielsweise EDTA, EGTA, Natriumtripolyphosphat, Zeolith und Zitronensäure, läßt man zu Zeitpunkt der Messung der Aktivität coexistieren, mit dem Ergebnis, daß keine Inhibierung erkannt wird.
- Alkalische Cellulase E-II:
- Wirkt gut auf cellulosische Materialien, wie beispielsweise CMC und mit Phosphorsäure gequollene Cellulose, und verursacht ihre Auflösung, wobei reduzierende Zucker, wie beispielsweise Glucose, gebildet werden.
- Dieses Enzym zeigt eine Hauptaktivität nicht nur bei CMC, sondern auch eine Aktivität bei Cellulose, die mit etwa 4%iger Phosphorsäure gequollen ist. Darüber hinaus hat es eine geringfügige Zersetzungsaktivität bei Xylan, Inulin und Lichenan, jedoch wenig Aktivität bei Cellulosepulver, Avicel® Filterpapier, PNPC und Cellobiose.
- Der Arbeits-pH reicht sehr breit von 4 bis 12,5 und der optimale pH liegt im breiten Bereich von 7 bis 10. In einem Bereich von 5,5 bis 11 beträgt die relative Aktivität nicht weniger als 50% der Aktivität, die in dem optimalen pH-Bereich vorliegt. Folglich wird von diesem Enzym angenommen, daß es eine zufriedenstellende Aktivität auf der äußerst alkalischen Seite unter den bekannten alkalischen Cellulasen, die bisher untersucht worden sind, zeigt (Fig. 18).
- Die Restaktivität wird gemessen, nachdem man das Enzym bei verschiedenen pH's bei 0ºC während 24 Stunden gehalten hat, um die pH-Stabilität zu bestimmen. Als Ergebnis findet man, daß das Enzym sehr stabil ist und bei einem pH von 6 bis 11 nicht inaktiviert wird. In einem pH-Bereich von 5,5 bis 11,5 wird eine Aktivität von etwa 50% oder darüber aufrechterhalten. Das vorliegende Enzym ist somit in einem hochalkalischen Bereich zufriedenstellend stabil (Fig. 19).
- Die Arbeitstemperatur liegt in einem breiten Bereich von 10 bis 80ºC und die optimale Temperatur findet man bei 50ºC. In einem Temperaturbereich von 30 bis 65ºC ist die Aktivität 50 % oder höher, bezogen auf die Aktivität bei der optimalen Temperatur (Fig. 20).
- Nach Behandlung bei einem pH von 7 während 30 min bei unterschiedlichen Temperaturen wird die Restaktivität gemessen. Als Ergebnis stellt man fest, daß es bei 50ºC stabil ist und bei 55ºC eine Restaktivität von etwa 50% erhalten wird (Fig. 21).
- Das Molekulargewicht des vorliegenden Enzyms wird gemäß der Gelfiltrationsmethode unter Verwendung von Bio-Gel®P-100 (Bio-Rad Laboratories Co., Ltd.) bestimmt mit dem Ergebnis, daß es etwa 61 000 beträgt (Fig. 23).
- Das vorliegende Enzym wird einer Bestimmung des Einflusses von verschiedenen Metallionen unterworfen (Al³&spplus;, Fe³&spplus;, Ca²&spplus;, Cd²&spplus;, Co²&spplus;, Cr²&spplus;, Cu²&spplus;, Fe²&spplus;, Hg²&spplus;, Mn²&spplus;, Mo²&spplus;, Ni²&spplus;, Pb²&spplus;, Zn²&spplus;, Li&spplus;, K&spplus; und Na&spplus;), indem man den Ionen gestattet, während der Zeit der Messung der Aktivität zu coexistieren (dabei beträgt die Konzentration von K&spplus; oder Na&spplus; 50 mM und die Konzentration der anderen Ionen beträgt 1 mM). Als Ergebnis wird festgestellt, daß die Aktivität mit Hg²&spplus; inhibiert wird und mit Co²&spplus; gesteigert wird.
- Der Einfluß verschiedener oberflächenaktiver Mittel (z. B. LAS, AS, ES, AOS, alpha-SFE, SAS, Seife und Polyoxyethylen-sekundärer Alkylether) auf die Enzymaktivität wird bestimmt. Das vorliegende Enzym wird in einer 0,05%igen Lösung des jeweiligen oberflächenaktiven Mittels einer Messung der Aktivität unterworfen. Als Ergebnis stellt man fest, daß kaum eine Inhibierung der Aktivität durch irgendein oberflächenaktives Mittel stattfindet, wie in Tabelle 1 gezeigt wird.
- kein 100
- LAS 79
- AS 108
- ES 98
- AOS 100
- alpha-SFE 129
- SAS 93
- Seife 100
- Polyoxyethylen-sekundärer Alkylether 86
- Darüber hinaus wird die Inhibierung der Aktivität nicht festgestellt, wenn man Natriumdodecylsulfat verwendet, was ein potentielles Waschmittel ist.
- Proteinasen für Waschmittel, wie beispielsweise API-21® (Showa Denko Co., Ltd.), Maxatase® (Gist Co., Ltd.) und Alkalase® (Novo Co., Ltd.), läßt man zum Zeitpunkt der Messung der Aktivität coexistieren (0,1 mg/ml), um ihren Einfluß zu bestimmen. Man stellt fest, daß das Enzym eine hohe Resistenz gegen diese Proteinasen aufweist, wie in Tabelle 2 gezeigt wird.
- keine 100
- Alkalase 111
- API-21 115
- Maxatase 120
- Chelatisiermittel, wie beispielsweise EDTA, EGTA, Natriumtripolyphosphat, Zeolith und Zitronensäure, läßt man zu Zeitpunkt der Messung der Aktivität coexistieren, mit dem Ergebnis, daß keine Inhibierung erkannt wird.
- Das vorliegende Enzym wird einer Messung des UV-Absorptionsspektrums unterzogen. Dabei wird festgestellt, daß es eine maximale Absorption bei etwa 280 nm aufweist mit einer Schulterabsorption, die sich bei 290 nm zeigt, und zwar gemäß einem Differenzialabsorptionsspektrum (Fig. 24).
- Alkalische Cellulase E-III:
- Wirkt gut auf Cellulosen, wie beispielsweise CMC und mit Phosphorsäure gequollene Cellulose, und verursacht ihre Auflösung, wobei reduzierende Zucker, wie beispielsweise Glucose, gebildet werden.
- Dieses Enzym zeigt eine Hauptaktivität nicht nur bei CMC, sondern auch eine Aktivität bei Cellulose, die mit etwa 4,5%iger Phosphorsäure gequollen ist. Darüber hinaus hat es eine geringfügige Zersetzungsaktivität bei Xylan, Lichenan und dergl., jedoch wenig Aktivität bei Cellulosepulver, Avicel® Filterpapier, PNPC und Cellobiose.
- Der Arbeits-pH reicht sehr breit von 4 bis 12,5 und der optimale pH liegt im breiten Bereich von 7 bis 9. In einem Bereich von 6 bis 10,5 beträgt die relative Aktivität nicht weniger als 50% der Aktivität, die in dem optimalen pH-Bereich vorliegt. Folglich wird von diesem Enzym angenommen, daß es eine zufriedenstellende Aktivität auf der äußerst alkalischen Seite unter den bekannten alkalischen Cellulasen, die bisher untersucht worden sind, zeigt (Fig. 25).
- Die Restaktivität wird gemessen, nachdem man das Enzym bei verschiedenen pH's bei 5ºC während 24 Stunden gehalten hat, um die pH-Stabilität zu bestimmen. Als Ergebnis findet man, daß das Enzym sehr stabil ist und bei einem pH von 6 bis 10 nicht inaktiviert wird. In einem pH-Bereich von 5,7 bis 11,5 wird eine Aktivität von etwa 50% oder darüber aufrechterhalten. Das vorliegende Enzym ist somit in einem hochalkalischen Bereich zufriedenstellend stabil (Fig. 26).
- Die Arbeitstemperatur liegt in einem breiten Bereich von 10 bis 80ºC und die optimale Temperatur findet man bei 50ºC. In einem Temperaturbereich von 30 bis 62ºC ist die Aktivität 50 % oder höher, bezogen auf die Aktivität bei der optimalen Temperatur (Fig. 27).
- Nach Behandlung bei einem pH von 7 während 30 min bei unterschiedlichen Temperaturen wird die Restaktivität gemessen. Als Ergebnis stellt man fest, daß es bei 50ºC stabil ist und bei 55ºC eine Restaktivität von etwa 50% erhalten wird (Fig. 21).
- Das Molekulargewicht des vorliegenden Enzyms wird gemäß der Gelfiltrationsmethode unter Verwendung von Bio-Gel®P-100 (Bio-Rad Laboratories Co., Ltd.) bestimmt mit dem Ergebnis, daß es etwa 35 000 beträgt. Mit einer SDS-Polyacrylamidgel- Elektrophorese ermittelt man ein Molekulargewicht von etwa 61 000 (Fig. 23).
- Das vorliegende Enzym wird einer Bestimmung des Einflusses von verschiedenen Metallionen unterworfen (Al³&spplus;, Fe³&spplus;, Ca²&spplus;, Cd²&spplus;, Co²&spplus;, Cr²&spplus;, Cu²&spplus;, Fe²&spplus;, Hg²&spplus;, Mn²&spplus;, Mo²&spplus;, Ni²&spplus;, Pb²&spplus;, Zn²&spplus;, Li&spplus;, K&spplus; und Na&spplus;), indem man den Ionen gestattet, während der Zeit der Messung der Aktivität zu coexistieren (dabei beträgt die Konzentration von K&spplus; oder Na&spplus; 50 mM und die Konzentration der anderen Ionen beträgt 1 mM). Als Ergebnis wird festgestellt, daß die Aktivität mit Hg²&spplus; inhibiert wird und mit Co²&spplus; gesteigert wird.
- Der Einfluß verschiedener oberflächenaktiver Mittel (z. B. LAS, AS, ES, AOS, alpha-SFE, SAS, Seife und Polyoxyethylen-sekundärer Alkylether) auf die Enzymaktivität wird bestimmt. Das vorliegende Enzym wird in einer 0,05%igen Lösung des jeweiligen oberflächenaktiven Mittels einer Messung der Aktivität unterworfen. Als Ergebnis stellt man jeglichen signifikanten Einfluß durch die oberflächenaktiven Mittel fest, wie in Tabelle 3 gezeigt wird.
- kein 100
- LAS 78
- AS 107
- ES 100
- AOS 101
- alpha-SFE 104
- SAS 97
- Seife 101
- Polyoxyethylen-sekundärer Alkylether 96
- Darüber hinaus wird die Inhibierung der Aktivität nicht festgestellt, wenn man Natriumdodecylsulfat verwendet, was ein potentielles Waschmittel ist.
- Proteinasen für Waschmittel, wie beispielsweise API-21® (Showa Denko Co., Ltd.), Maxatase® (Gist Co., Ltd.) und Alkalase® (Novo Co., Ltd.), läßt man zum Zeitpunkt der Messung der Aktivität coexistieren (0,1 mg/ml), um ihren Einfluß zu bestimmen. Man stellt fest, daß das Enzym eine hohe Resistenz gegen diese Proteinasen aufweist, wie in Tabelle 4 gezeigt wird.
- keine 100
- Alkalase 94
- API-21 106
- Maxatase 103
- Chelatisiermittel, wie beispielsweise EDTA, EGTA, Natriumtripolyphosphat, Zeolith und Zitronensäure, läßt man zu Zeitpunkt der Messung der Aktivität coexistieren, mit dem Ergebnis, daß wenig Inhibierung erkannt wird.
- Das vorliegende Enzym wird einer Messung des UV-Absorptionsspektrums unterzogen. Dabei wird festgestellt, daß es eine maximale Absorption bei etwa 280 nm aufweist mit einer Schulterabsorption, die sich bei 290 nm zeigt, und zwar gemäß einem Differenzialabsorptionsspektrum (Fig. 29).
- Die alkalischen Cellulasen der Erfindung haben einen optimalen pH bei einem höheren Niveau (pH 10) als bekannte alkalische Cellulasen und sind äußerst stabil über einen breiten pH-Bereich. So hat beispielsweise alkalische Cellulase K-580 in einem breiten pH-Bereich von 4,5 bis 10,5 eine Aktivität, die nicht kleiner als 50% der Aktivität bei dem optimalen pH ist, und ist in einem pH-Bereich von 4,5 bis 12 äußerst stabil. Alkalische Cellulase K-425 hat auch in einem pH-Bereich von 5,5 bis 10,5 eine Aktivität von nicht weniger als 50% der Aktivität bei dem optimalen pH und ist in einem pH-Bereich von 5 bis 11 äußerst stabil. Darüber hinaus haben die alkalischen Cellulasen K-521 bzw. K-522 einen optimalen pH in einem weiten Bereich von 7,0 bis 10 und sind in einem breiten Bereich äußerst stabil.
- Die alkalischen Cellulasen E-II und E-III, die aus der alkalischen Cellulase K-522 stammen, haben jeweils höhere optimale pH's (von 10 bzw. 9) als bekannte alkalische Cellulasen. Darüber hinaus haben sie jeweils breite optimale pH Bereiche von 7,0 bis 10 bzw. 7,0 bis 9 und sind in diesen breiten Bereichen sehr stabil.
- Diese alkalischen Cellulasen werden durch Bestandteile, wie sie gewöhnlich in Waschmitteln formuliert werden, wie beispielsweise oberflächenaktive Mittel, Proteinasen, Chelatisiermittel und dergl., kaum inhibiert. Folglich können die vorliegenden Enzyme problemlos in Waschmittelzusammensetzungen verwendet werden.
- Die Mikroorganismen der Erfindung wachsen unter neutralen Bedingungen, so daß es möglich ist, industriell alkalische Cellulasen auf einfachere Weisen zu erzeugen als im Falle der Verwendung der alkalophilen Stämmen.
- Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert.
- Ein Löffel voll (0,5 g) Boden, der bei Ichikai-machi, Haga-gun, Tochigi-ken, Japan erhalten wurde, wird in einer sterilisierten, physiologischen Salzlösung suspendiert und 10 min bei 80 ºC thermisch behandelt. Die überstehende Flüssigkeit der thermisch behandelten Lösung wird in zweckentsprechender Weise verdünnt und auf ein Agar-Medium für die Isolierung gegeben (Medium 1), gefolgt von einer Kultivierung bei 30ºC während 3 Stunden unter Bildung von Kolonien. Kolonien, um die herum eine transparente Zone auftritt, werden auf der Basis der Auflösung von CMC selektiert, um CMCase erzeugende Mikroorganismen zu sammeln, die zur der Gattung Bacillus gehören. Die so gesammelten Mikroorganismen werden einem flüssigen Medium, als Medium 2, eingeimpft und 3 Tage bei 30ºC einer Schüttelkultivierung unterworfen. Nach Beendigung der Kultivierung wird eine durch Zentrifugieren abgetrennte überstehende Flüssigkeit erhalten und der Messung der CMCase-Aktivität in einem pH Bereich von 3 bis 13 unterworfen und ferner einem screening für alkalische Cellulase erzeugende Mikroorganismen, die zur Gattung Bacillus gehören, unterzogen.
- Mittels der obigen Verfahrensweise konnten die Stämme Bacillus sp. KSM-580, Bacillus sp. KSM-425 und Bacillus sp. KSM-521 erhalten werden.
- CMC 2%
- Polypepton 0,5
- Hefeextrakt 0,05
- KH&sub2;PO&sub4; 0,1
- Na&sub2;HPO&sub4; · 12H&sub2;O 0,25
- MgSO&sub4;·7H&sub2;O 0,02
- Agar 0,75
- pH 6,8
- CMC 1%
- Polypepton 1
- Hefeextrakt 0,5
- KH&sub2;PO&sub4; 0,1
- Na&sub2;HPO&sub4; · 12H&sub2;O 0,25
- MgSO&sub2;·7H&sub2;O 0,02
- pH 6,8
- Der in Beispiel 1 erhaltene Stamm Bacillus sp. KSM-580 wird in dem flüssigen Medium 2 von Beispiel 1 inokuliert, gefolgt von einer Schüttelkultivierung bei 30ºC während 3 Tagen. Nach Beendigung der Kultur werden die Bacilluszellen durch Zentrifugieren entfernt, um eine rohe Enzymlösung zu erhalten. 3 l Ethanol werden zu 1 l der rohen Enzymlösung in Trockeneis /Ethanol gegeben und das resultierende Präzipitat wird durch Zentrifugieren entfernt, gefolgt von Gefriertrocknung. Man erhält 11 g alkalische Cellulose K-580 (spezifische Aktivität* 33 Einheiten/g) als ein trockenes Pulver. (* Die Enzymaktivität ist ein Wert bei pH 9).
- Der Stamm Bacillus sp. KSM-580 wird in einem Medium der gleichen Zusammensetzung wie das flüssige Medium 2 von Beispiel 1 inokuliert, mit der Ausnahme, daß CMC durch Sucrose ersetzt wird und Polypepton durch 7% Maisquellwasser (corn steep liquor; CSL) ersetzt wird. Es folgt eine Schüttelkultivierung bei 30ºC während 2 Tagen. Das resultierende Kulturprodukt wird zentrifugiert und die resultierende überstehende Flüssigkeit wird wiederrum einer Messung der CMCase-Aktivität unterworfen. Die Aktivität beträgt 60 Einheiten/Liter.
- Der Stamm Bacillus sp. KSM-425, der in Beispiel 1 erhalten wurde, wird in dem flüssigen Medium 2 von Beispiel 1 inokuliert und 3 Tage bei 30ºC schüttelkultiviert. Nach Beendigung der Kultivierung werden die Bacilluszellen durch Zentrifugieren entfernt, um eine rohe Ezymlösung zu erhalten. 3 l Ethanol werden zu 1 l der rohen Enzymlösung in Trockeneis/Ethanol gegeben und das resultierende Präzipitat wird durch Zentrifugieren entfernt und gefriergetrocknet. Man erhält 10 g alkalische Cellulase K-425 (spezifische Aktivität 10 Einheiten/g) als ein trockenes Pulver.
- * Die Enzymaktivität, die bei pH 9 gemessen wird.
- Der Stamm Bacillus sp. KSM-425 wird in einem Medium mit der gleichen Zusammensetzung wie das flüssige Medium 2 von Beispiel 1 inokuliert, mit der Ausnahme, daß CMC durch Sucrose ersetzt wurde und Polypepton durch 7% CSL ersetzt wurde. Anschließend erfolgt eine Schüttelkultivierung bei 30ºC während 2 Tagen. Das Kulturprodukt wird durch Zentrifugieren abgetrennt und die resultierende überstehende Flüssigkeit wird der Messung der CMCase-Aktivität unterworfen. Die Aktivität beträgt 160 Einheiten/Liter.
- Der Stamm Bacillus sp. KSM-521, der in Beispiel 1 erhalten wurde, wird in dem flüssigen Medium 2 von Beispiel 1 inokuliert und 3 Tage bei 30ºC schüttelkultiviert. Nach Beendigung der Kultivierung werden die Bacilluszellen durch Zentrifugieren entfernt, um eine rohe Enzymlösung zu erhalten. 3 l Ethanol werden zu 1 l der rohen Enzymlösung in Trockeneis/Ethanol gegeben und das resultierende Präzipitat wird durch Zentrifugieren abgetrennt und gefriergetrocknet. Man erhält 9 g alkalische Cellulase K-521 (spezifische Aktivität) 20 Einheiten/g) als ein trockenes Pulver.
- * Die Enzymaktivität, die bei pH 9 gemessen wurde. Das gilt hier und im folgenden.
- Der Stamm KSM-521 wird in einem Medium mit der gleichen Zusammensetzung wie das flüssige Medium 2 von Beispiel 1 inokuliert, mit der Ausnahme, daß CMC durch 1% Sucrose ersetzt ist und Polypepton durch 7% CSL ersetzt wurde, gefolgt von Schüttelkultivierung bei 30 C während 2 Tagen. Das Kulturprodukt wird durch Zentrifugieren abgetrennt und die resultierende überstehende Flüssigkeit wird einer Messung der CMCase-Aktivität unterworfen. Man stellt eine Aktivität von 100 Einheiten/l fest.
- Ein Löffel voll (0,5g) des Bodens, der bei Nikko-shi, Tochigiken, Japan erhalten wurde, wird in einer sterilisierten Salzlösung suspendiert. Anschließend wird das Verfahren von Beispiel 1 wiederholt. Man erhält auf diese Weise den erfindungsgemäßen Stamm KSM-522 (FERM BP 1512).
- Der in Beispiel 8 erhaltene Stamm Bacillus sp. KSM-522 wird in dem flüssigen Medium von Beispiel 1 inoculiert und bei 30ºC während 3 Tagen schüttelkultiviert. Nach der Kultivierung werden die Bacilluszellen durch Zentrifugieren abgetrennt, um eine rohe Lösung zu erhalten. 3 l Ethanol werden zu 1 l der rohen Enzymlösung in Trockeneis/Ethanol gegeben und das resultierende Präzipitat wird durch Zentrifugieren abgetrennt und gefriergetrocknet. Man erhält 8 g alkalische Cellulase K-522 (spezifische Aktivität* 23 Einheiten/g) als ein trockenes Pulver.
- * Die Enzymaktivität, die bei pH 9 gemessen wurde.
- Der Stamm KSM-522 wird in einem Medium mit der gleichen Zusammensetzung wie das flüssige Medium 2 von Beispiel 1 inokuliert, mit der Ausnahme, daß CMC durch 1% Sucrose ersetzt wurde und Polypepton durch 7% CSL ersetzt wurde. Es folgt eine Schüttelkultivierung bei einer Temperatur von 30ºC während 2 Tagen. Das Kulturprodukt wird durch Zentrifugieren abgetrennt und die resultierende überstehende Flüssigkeit wird einer Messung der CMCase-Aktivität unterworfen, wobei man eine Aktivität von 150 Einheiten/Liter feststellt.
- 5 l des überstandes, der in Beispiel 10 erhalten wurde, wird gemäß dem folgenden Verfahren gereinigt.
- 1. Konzentrierung durch Ultrafiltration (Amicon Co., Ltd., fraktionierendes Molekulargewicht von 10 000).
- 2. Behandlung mit Streptomycin.
- 3. Chromatographie unter Verwendung von DEAE-BioGel A (Bio-Rad Laboratories Co., Ltd.).
- 4. Chromatographie unter Verwendung von Hydroxyapatit (Wako Junyaku Ind. Co., Ltd.).
- 5. Chromatographie unter Verwendung von DEAE-BioGel®A.
- 6. Chromatographie unter Verwendung von DEAE-BioGel® A.
- In der dritten Stufe der obigen Verfahrensweise wird das Enzym in einer Säule absorbiert, die eine Größe von 3,2 · 33 cm hat (äquilibriert mit einer 10 mM Phosphatpufferlösung mit einem pH von 7), gefolgt von einer linearen Steigerung der Konzentration des NaCl von 0 bis 300 nM für die Eluierung. Auf diese Weise kann neutrale Cellulase E-I, alkalische Cellulase E-II und alkalische Cellulase E-III in der genannten Reihenfolge eluiert werden (Fig. 22). Die Fraktionen von 533 bis 580, aus denen die Fraktion von E-I entfernt worden war, werden gesammelt und weiter gereinigt. In der vierten Stufe werden die Fraktionen in einer Säule absorbiert, die eine Größe von 2,5 · 13 cm hat (äquilibriert mit einer 10 mM Phosphatpufferlösung mit einem pH von 7), woraufhin die Konzentration des Phosphats gesteigert wird von 10 bis 200 mM, und zwar in linearer Weise, um eine alkalische Cellulase-Fraktion (ein Gemisch von E-II und E-III) zu erhalten. In der fünften Stufe wird die Verfahrensweise von (3) wiederholt (dabei wird die Konzentration von NaCl linear gesteigert von 70 auf 200 mM), um alkalische Cellulase E-II zu sammeln, wobei der Rückstand der sechsten Stufe unterworfen wird. Die sechste Stufe wird ähnlich wie (3) oder (5) durchgeführt, jedoch wird der Gradient der Konzentration des NaCl weiter erniedrigt durch Änderung von 90 auf 150 mM für die Eluierung. Auf diese Weise wird die alkalische Cellulase E-III isoliert. Die so gereinigten alkalischen Cellulasen E-II und E-III werden der Polyacrylamid-Elektrophorese auf herkömmliche Weise unterworfen und ferner einer Anfärbung mit Coomassie Brilliant Blue und einer Silberanfärbung. Auf diese Weise wird bestätigt, daß die jeweiligen Cellulasen ein einziges Band ergeben.
- Die alkalischen Cellulasen E-II und E-III, die in Beispiel 11 erhalten wurden, werden der SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese auf gewöhnliche Weise unterworfen. Die Ergebnisse-sind in Fig. 23 gezeigt. Aus den Ergebnissen erkennt man, daß die alkalischen Cellulasen E-II und E-III jeweils ein Molekulargewicht von etwa 61 000 aufweisen.
- Gemäß der Gelfiltrationsmethode unter Verwendung von Bio- Gel®P-100 hat die alkalische Cellulase E-II ein Molekulargewicht von etwa 34 000 und die alkalische Cellulase E-III hat ein Molekulargewicht von etwa 35 000.
Claims (10)
1. Eine alkalische Cellulase, welche erhältlich ist von einem
Mikroorganismus der Gattung Bacillus, der in einem neutralen
Medium wächst, und welche einen optimalen Arbeits-pH in einem
alkalischen Bereich hat, wobei die alkalische Cellulase die
folgenden enzymatischen Eigenschaften aufweist und K-580
genannt wird:
(1) Wirkung
Wirkt auf cellulosische Materialien, einschließlich
Carboxymethylcellulose (CMC), Cellulose, Filterpapier und Avicel® und
verursacht ihre Auflösung, wobei reduzierende Zucker, wie
beispielsweise Glucose, gebildet werden.
(2) Substratspezifität
Zeigt Aktivität nicht nur bei CMC, sondern auch bei
Cellulosepulver, Avicel® , Filterpapier, p-Nitrophenylcellobiosid
(PNPC) und Cellobiose.
(3) Arbeits-pH und optimaler pH
Der Arbeits-pH reicht von 3 bis 12,5 und der optimale pH liegt
im Bereich von 8 bis 10, wobei im Bereich von 5,5 bis 10,5
eine relative Aktivität nicht weniger als 50% der Aktivität
beträgt, die in dem optimalen pH-Bereich vorliegt.
(4) pH-Stabilität
Äußerst stabil und bei einem pH von 5 bis 11 nicht inaktiviert
und bei einem pH von 3 bis 12 wird eine Aktivität von nicht
weniger als etwa 50% aufrechterhalten.
(5) Optimale Temperatur
Die Arbeitstemperatur liegt in einem breiten Bereich von 15
bis 80ºC und die optimale Temperatur beträgt 65ºC. In dem
Bereich von 50 bis 75ºC ist die Aktivität nicht weniger als
50% der Aktivität bei der optimalen Temperatur;
(6) Molekulargewicht
Peaks des Molekulargewichts bei etwa 18 000 und 50 000
(bestimmt mit der Gelfiltrationsmethode unter Verwendung von
Sephadex® G-100)
(7) Einfluß von Metallionen
Inhibierung mit Hg²&spplus; und Aktivierung mit Ba²&spplus;, Ca²&spplus;, Co²&spplus; und
Cd²&spplus;.
(8) Einfluß von oberfächenaktiven Mitteln
LAS, AS, ES, AOS, alpha-SFE, SAS, und Seifen und
Polyoxyethylen-sekundäre Alkylether verursachen kaum Inhibierung der
Aktivität.
(9) Proteinase-Beständigkeit
Ist gegen Proteinasen resistent.
(10) Einfluß von Chelatisiermitteln
EDTA, EGTA, Zitronensäure, Natriumtripolyphosphat und Zeolith
verursachen keine Inhibierung der Aktivität.
2. Eine alkalische Cellulase, welche erhältlich ist von einem
Mikroorganismus der Gattung Bacillus, der in einem neutralen
Medium wächst, und welche einen optimalen Arbeits-pH in einem
alkalischen Bereich hat, wobei die alkalische Cellulase die
folgenden enzymatischen Eigenschaften aufweist und K-425
genannt wird:
(1) Wirkung
Wirkt auf cellulosische Materialien, einschließlich CMC,
Cellulose, Filterpapier und Avicel® und verursacht ihre
Auflösung, wobei reduzierende Zucker, wie beispielsweise
Glucose, gebildet werden.
(2) Substratspezifität
Zeigt Aktivität nicht nur bei CMC, sondern auch bei
Cellulosepulver, Avicel® , Filterpapier, p-Nitrophenylcellobiosid
(PNPC) und Cellobiose.
(3) Arbeits-pH und optimaler pH
Der Arbeits-pH reicht von 3,5 bis 12,5 und der optimale pH
liegt im Bereich von 8 bis 10, wobei in einem Bereich von 5,5
bis 10,5 eine relative Aktivität nicht weniger als 50% der
Aktivität beträgt, die in dem optimalen pH-Bereich vorliegt.
(4) pH-Stabilität
Sehr stabil und bei einem pH von 5 bis 11 nicht inaktiviert
und bei einem pH von 3 bis 12 wird eine Aktivität von nicht
weniger als etwa 50% aufrechterhalten.
(5) Optimale Temperatur
Die Arbeitstemperatur liegt in einem breiten Bereich von 15
bis 75ºC und die optimale Temperatur beträgt 50ºC. In dem
Bereich von 35 bis 55ºC ist die Aktivität nicht weniger als
50% der Aktivität bei der optimalen Temperatur.
(6) Molekulargewicht
Etwa 35000 (bestimmt mit der Gelfiltrationsmethode unter
Verwendung von Sephadex®G100)
(7) Einfluß von Metallionen
Inhibierung mit Hg²&spplus; und Ba²&spplus; und Aktivierung mit Co²&spplus;.
(8) Einfluß von oberfächenaktiven Mitteln
LAS, AS, ES, AOS, alpha-SFE, SAS, und Seifen und
Polyoxyethylen-sekundäre Alkylether verursachen kaum Inhibierung der
Aktivität.
(9) Proteinase-Beständigkeit
Ist gegen Proteinasen resistent.
(10) Einfluß von Chelatisiermitteln
EDTA, EGTA, Zitronensäure, Natriumtripolyphosphat und Zeolith
verursachen keine Inhibierung der Aktivität.
3. Eine alkalische Cellulase, welche erhältlich ist von einem
Mikroorganismus der Gattung Bacillus, der in einem neutralen
Medium wächst, und welche einen optimalen Arbeits-pH in einem
alkalischen Bereich hat, wobei die alkalische Cellulase die
folgenden enzymatischen Eigenschaften aufweist und K-521
genannt wird:
(1) Wirkung
Wirkt auf cellulosische Materialien, einschließlich CMC,
Cellulose, Filterpapier und Avicel® und verursacht ihre
Auflösung,
wobei reduzierende Zucker, wie beispielsweise Glucose,
gebildet werden.
(2) Substratspezifität
Zeigt Aktivität nicht nur bei CMC, sondern auch bei
Cellulosepulver, Avicel® , Filterpapier, PNPC und Cellobiose.
(3) Arbeits-pH und optimaler pH
Der Arbeits-pH reicht von 3 bis 12,5 und der optimale pH liegt
im Bereich von 7 bis 10, wobei in einem Bereich von 4,5 bis
10,5 eine relative Aktivität nicht weniger als 50% der
Aktivität beträgt, die in dem optimalen pH-Bereich vorliegt.
(4) pH-Stabilität
Sehr stabil und bei einem pH von 5 bis 12 nicht inaktiviert
und bei einem pH von 4,5 bis 12,5 wird eine Aktivität von
nicht weniger als etwa 50% aufrechterhalten.
(5) Optimale Temperatur
Die Arbeitstemperatur liegt in einem breiten Bereich von 15
bis 80ºC und die optimale Temperatur beträgt 60ºC. In dem
Bereich von 45 bis 65ºC ist die Aktivität nicht weniger als
50% der Aktivität bei der optimalen Temperatur.
(6) Molekulargewicht
Etwa 31000 (bestimmt mit der Gelfiltrationsmethode unter
Verwendung von Sephadex®G100)
(7) Einfluß von Metallionen
Inhibierung mit Hg²&spplus; und Aktivierung mit Ca²&spplus;.
(8) Einfluß von oberfächenaktiven Mitteln
LAS, AS, ES, AOS, alpha-SFE, SAS, und Seifen und
Polyoxyethylen-sekundäre Alkylether verursachen kaum Inhibierung der
Aktivität.
(9) Proteinase-Beständigkeit
Ist gegen Proteinasen resistent.
(10) Einfluß von Chelatisiermitteln
EDTA, EGTA, Zitronensäure, Natriumtripolyphosphat und Zeolith
verursachen keine Inhibierung der Aktivität.
4. Eine alkalische Cellulase, welche erhältlich ist von einem
Mikroorganismus der Gattung Bacillus, der in einem neutralen
Medium wächst, und welche einen optimalen Arbeits-pH in einem
alkalischen Bereich hat, wobei die alkalische Cellulase die
folgenden enzymatischen Eigenschaften aufweist und K-522
genannt wird:
(1) Wirkung
Wirkt auf cellulosische Materialien, einschließlich CMC,
Cellulose, Filterpapier und Avicel® und verursacht ihre
Auflösung, wobei reduzierende Zucker, wie beispielsweise Glucose,
gebildet werden.
(2) Substratspezifität
Zeigt Aktivität nicht nur bei CMC, sondern auch bei
Cellulosepulver, mit Phosphorsäure gequollener Cellulose, mit Alkali
gequollener Cellulose, Avicel® , Filterpapier, und PNPC.
(3) Arbeits-pH und optimaler pH
Der Arbeits-pH reicht von 3 bis 12,5 und der optimale pH liegt
im Bereich von 7 bis 10, wobei in einem Bereich von 4,5 bis
10,5 eine relative Aktivität nicht weniger als 50% der
Aktivität beträgt, die in dem optimalen pH-Bereich vorliegt.
(4) pH-Stabilität
Sehr stabil und bei einem pH von 5 bis 12 nicht inaktiviert
und bei einem pH von 4,5 bis 12,5 wird eine Aktivität von
nicht weniger als etwa 50% aufrechterhalten.
(5) Optimale Temperatur
Die Arbeitstemperatur liegt in einem breiten Bereich von 15
bis 80ºC und die optimale Temperatur beträgt 60ºC. In dem
Bereich von 45 bis 65ºC ist die Aktivität nicht weniger als
50% der Aktivität bei der optimalen Temperatur.
(6) Molekulargewicht
Etwa 35000 (bestimmt mit der Gelfiltrationsmethode unter
Verwendung von Bio-Gel®P-150)
(7) Einfluß von Metallionen
Inhibierung mit Hg²&spplus;.
(8) Einfluß von oberfächenaktiven Mitteln
LAS, AS, ES, AOS, alpha-SFE, SAS, und Seifen und
Polyoxyethylen-sekundäre
Alkylether verursachen kaum Inhibierung der
Aktivität.
(9) Proteinase-Beständigkeit
Ist gegen Proteinasen resistent.
(10) Einfluß von Chelatisiermitteln
EDTA, EGTA, Zitronensäure, Natriumtripolyphosphat und Zeolith
verursachen keine Inhibierung der Aktivität.
5. Eine alkalische Cellulase, welche erhältlich ist von einem
Mikroorganismus der Gattung Bacillus, der in einem neutralen
Medium wächst, und welche einen optimalen Arbeits-pH in einem
alkalischen Bereich hat, wobei die alkalische Cellulase die
folgenden enzymatischen Eigenschaften aufweist und E-II
genannt wird:
(1) Wirkung
Wirkt auf cellulosische Materialien, einschließlich CMC und
mit Phosphorsäure gequollene Cellulose, und verursacht ihre
Auflösung, wobei reduzierende Zucker, wie beispielsweise
Glucose, gebildet werden.
(2) Substratspezifität
Zeigt Aktivität nicht nur bei CMC und bei mit Phosphorsäure
gequollener Cellulose, sondern auch geringe Aktivität bei
Xylan, Inulin und Lichenan.
(3) Arbeits-pH und optimaler pH
Der Arbeits-pH reicht von 4 bis 12,5 und der, optimale pH liegt
im Bereich von 7 bis 10.
(4) pH-Stabilität
Wenn bei 5ºC während 24 h aufbewahrt, findet bei einem pH von
6 bis 10 keine Inaktivierung statt.
(5) Optimale Temperatur
Die Arbeitstemperatur liegt in einem breiten Bereich von 10
bis 80ºC und die optimale Temperatur beträgt 50ºC.
(6) Molekulargewicht
Etwa 34000 (bestimmt mit der Gelfiltrationsmethode unter
Verwendung von Bio-Gel®P-150);
(7) Einfluß von Metallionen
Inhibierung mit Hg²&spplus; und Aktivierung mit Co²&spplus;.
(8) Einfluß von oberfächenaktiven Mitteln
LAS, AS, ES, AOS, alpha-SFE, SAS, und Seifen und
Polyoxyethylen-sekundäre Alkylether verursachen kaum Inhibierung der
Aktivität.
(9) Proteinase-Beständigkeit
Ist gegen Proteinasen resistent.
(10) Einfluß von Chelatisiermitteln
EDTA, EGTA, Zitronensäure, Natriumtripolyphosphat und Zeolith
verursachen keine Inhibierung der Aktivität.
6. Eine alkalische Cellulase, welche erhältlich ist von einem
Mikroorganismus der Gattung Bacillus, der in einem neutralen
Medium wächst, und welche einen optimalen Arbeits-pH in einem
alkalischen Bereich hat, wobei die alkalische Cellulase die
folgenden enzymatischen Eigenschaften aufweist und E-III
genannt wird:
(1) Wirkung
Wirkt auf cellulosische Materialien, einschließlich CMC und
mit Phosphorsäure gequollene Cellulose, und verursacht ihre
Auflösung, wobei reduzierende Zucker, wie beispielsweise
Glucose, gebildet werden.
(2) Substratspezifität
Zeigt Aktivität nicht nur bei CMC und bei mit Phosphorsäure
gequollener Cellulose, sondern auch geringe Aktivität bei
Xylan und Lichenan.
(3) Arbeits-pH und optimaler pH
Der Arbeits-pH reicht von 4 bis 12,5 und der optimale pH liegt
im Bereich von 7 bis 10.
(4) pH-Stabilität
Wenn bei 5ºC während 24 h aufbewahrt, findet bei einem pH von
6 bis 10 keine Inaktivierung statt.
(5) Arbeitstemperatur und optimale Temperatur
Die Arbeitstemperatur liegt in einem Bereich von 10 bis 80ºC
und eine optimale Temperatur ist 50ºC.
(6) Molekulargewicht
Etwa 35000 (bestimmt mit der Gelfiltrationsmethode unter
Verwendung von Bio-Gel®P-100)
(7) Einfluß von Metallionen
Inhibierung mit Hg²&spplus; und Aktivierung mit Co²&spplus;.
(8) Einfluß von oberfächenaktiven Mitteln
LAS, AS, ES, AOS, alpha-SFE, SAS, und Seifen und
Polyoxyethylen-sekundäre Alkylether verursachen kaum Inhibierung der
Aktivität.
(9) Proteinase-Beständigkeit
Ist gegen Proteinasen resistent.
(10) Einfluß von Chelatisiermitteln
EDTA, EGTA, Zitronensäure, Natriumtripolyphosphat und Zeolith
verursachen keine Inhibierung der Aktivität.
7. Ein alkalische Cellulase K-580 produzierendes Bakterium,
das Bacillus sp. KSM-580 genannt wird und als FERM BP-1511
hinterlegt wurde.
8. Ein alkalische Cellulase K-425 produzierendes Bakterium,
das Bacillus sp. KSM-425 genannt wird und als FERM BP-1505
hinterlegt wurde.
9. Ein alkalische Cellulase K-521 produzierendes Bakterium,
das Bacillus sp. KSM-521 genannt wird und als FERM BP-1507
hinterlegt wurde.
10. Ein alkalische Cellulase K-522 produzierendes Bakterium,
das Bacillus sp. KSM-522 genannt wird und als FERM BP-1512
hinterlegt wurde.
Applications Claiming Priority (10)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP28297086 | 1986-11-27 | ||
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