CN115851546A - 一株产碱性纤维素酶的短小芽孢杆菌 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物化工生产领域，涉及微生物发酵的菌种突变及菌种选育方法，具体涉及一株产碱性纤维素酶的短小芽孢杆菌及其应用。该菌株是经紫外诱变和硫酸二乙酯诱变育种后获得的，具体为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)WS‑135，保藏编号为CGMCC NO.18641。该菌株生产的碱性纤维素酶耐热、耐碱、酶活力高、性能稳定，同时本发明并优化了相应的发酵机制，该发酵机制，发酵活力更高、提取收率更高、制造成本更低，发酵酶活力平均在360U/mL以上；且开发了碱性纤维素酶的喷雾干燥方法，提供了一种碱性纤维素酶固体酶制剂的喷雾方法。解决了现有碱性纤维素酶保藏，运输不方便的问题，具有广泛的应用前景。

Description

一株产碱性纤维素酶的短小芽孢杆菌

技术领域：

本发明属于生物化工生产领域，涉及微生物发酵的菌种突变及菌种选育方法，具体涉及一株产碱性纤维素酶的短小芽孢杆菌及其应用。

背景技术：

近些年，碱性纤维素酶在国内外研究领域处于很重要的地位。碱性纤维素酶属于葡聚糖内切酶，也是羧甲基纤维素酶，其组分不包含纤维素酶系的β-葡萄糖苷酶和外切-β-1,4-葡聚糖苷酶。早期的研究始于1987年，伊藤把碱性纤维素酶加入到洗涤剂中，能对棉织物有很好的去污效果，此碱性纤维素酶是由嗜碱性芽孢杆菌KSM-635产生的，对去污机理的研究表明，碱性纤维素酶只对天然纤维素中非结晶区的纤维素分子产生影响，对结晶区纤维素分解作用不明显，而非结晶区只占棉纤维总量的10％，因此不会明显的分解棉织物降低牢固度发生断裂。利用这种特性把酶加到洗涤剂中能起到很好的效果，即使加入过量的酶对织物影响也较小。碱性芽孢杆菌是碱性纤维素酶的主要产生菌株，此酶除了在洗涤行业的应用外，近些年逐渐应用到化工、食品、造纸、废水处理等行业。目前我国的加酶洗涤剂主要添加的是脂肪酶和碱性蛋白酶，对碱性纤维素的研究正在开展，还处于起始阶段。

目前碱性纤维素酶面临的主要解决问题是，酶活较低，酶的性质研究的不够透彻，并且产酶量远未达到工业化生产需求，所以开发研究碱性纤维素酶及其产品具有很重要的经济价值和现实意义。

发明内容：

本发明目的是提供一株能够产碱性纤维素酶的短小芽孢杆菌，具体为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)WS-135，该菌株是通过紫外诱变和硫酸二乙酯诱变育种获得，目前已于2019年10月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101，保藏号为CGMCC NO.18641。此菌株大大提高了碱性纤维素酶的发酵产酶率，节约成本。

本发明提供的技术方案之二为：上述短小芽孢杆菌WS-135在生产碱性纤维素酶中的应用。

进一步地，本发明提供一种采用短小芽孢杆菌WS-135液态微生物发酵生产碱性纤维素酶的方法，具体如下：

发酵罐培养：将种子液按5-15％移种量移入发酵培养基中，培养条件：初始pH8.0，温度28-35℃，转速100-600rpm，空气通风量为1-4vvm，罐压0.05-0.08MPa，发酵期间补氨控制pH8.0；

进一步地，发酵培养8h后，流加补料培养基1补料控制溶氧20-40％，直至发酵结束；

进一步地，发酵培养24h后，流加补料培养基2，固定流速，每升发酵液每小时流加4g，直至发酵结束；

进一步地，发酵周期为75-80h，此时发酵罐酶活增长缓慢，菌体自溶严重，发酵结束时，发酵液中碱性纤维素酶酶活力最高可以达到388U/mL。

上述培养过程所使用培养基组分及制作灭菌过程如下：

发酵产酶培养基：葡萄糖1％-3％，玉米粉1％-3％，豆饼粉2％-4％，酵母浸粉0.5％-1.5％，(NH₄)₂SO₄ 0.4％-1％，MgSO₄ 0.01％-0.04％，K₂HPO₄ 0.2％-0.6％，FeSO₄0.05％-1％，其余为水，pH8.0。

发酵罐灭菌工艺：121-123℃，0.11-0.12MPa条件下，灭菌30-35min。

补料培养基1：葡萄糖40％-70％，pH自然。

补料培养基2：40％豆粕水解液。

补料灭菌工艺：121-123℃，0.11-0.12MPa条件下，灭菌30-35min。

进一步地，发酵液中碱性纤维素酶的提取精制方法如下：

发酵液中加入珍珠岩助滤剂，进行板框压滤；后加入硅藻土进行精滤；用超滤膜对精滤液进行超滤浓缩；浓缩液用无菌膜进行过滤除菌(可加入稳定剂、防腐剂)，得到液体成品酶制剂。

进一步地，上述液体碱性纤维素酶成品酶制剂通过喷雾干燥制备固体制剂的方法如下：

取液体成品酶制剂，按酶液质量百分比加入热保护剂：0.2％-0.8％MgSO₄，0.1％-0.5％ZnSO₄，0.5％-1％海藻糖；按酶液质量百分比加入6％-10％酶液助干剂麦芽糊精；调整进风温度125-150℃，出风温度50-80℃，进行喷雾干燥，得到粉末状酶制剂成品。

本发明所产纤维素酶的酶学性质如下：

(1)碱性纤维素酶在45-70℃时能保持80％以上的活力，作用温度广泛，最适作用温度为55℃。

(2)碱性纤维素酶在pH为8.0-11.0时，酶活力均可保持在80％以上，最适pH9.0。

(3)碱性纤维素酶在80℃保温3h仍有70％以上的活力，耐热稳定性好。

(4)碱性纤维素酶在pH5.0-10.5条件下5h后仍有80％以上的酶活，耐碱稳定性好。

有益效果：

本发明通过紫外诱变和硫酸二乙酯诱变选育获得一株高产碱性纤维素酶的短小芽孢杆菌(WS-135)，该菌株采用新的发酵生产工艺，使得碱性纤维素酶活可达到388U/mL，产酶高，周期短，能较大程度的节约能耗，降低发酵成本。另外，由短小芽孢杆菌(WS-135)生产的碱性纤维素酶具有较好的耐碱耐高温特性，作用温度及作用pH广泛，具有广泛的应用前景。

附图说明：

图1.碱性纤维素酶最适温度范围曲线图；

图2.碱性纤维素酶最适作用pH曲线图；

图3.碱性纤维素酶温度稳定性曲线图；

图4.碱性纤维素酶pH稳定性曲线图。

具体实施方式：

为了使本专利的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本专利进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利，并不用于限定本发明。

突变株的选育是基于选择性环境下，因不同微生物之间存在生长和代谢的差异，使不具有产酶优势的菌株被清除，具有产酶优势的细胞被筛选。在不同紫外诱变条件下，产酶菌首先被紫外光照射进行初步筛选，获得基因突变产酶量较大的菌株后对诱变后的菌株培养，加入不同剂量的硫酸二乙酯进行化学诱变得到产酶较高菌株。

本发明所采用的碱性纤维素酶活力测定和定义：

测定方法：以pH9.0甘氨酸-NaOH溶液为缓冲液(准确量取0.2mol/L甘氨酸50mL，0.2mol/L氢氧化钠8.8mL，混匀，定容至200mL)，利用1％CMC-Na溶液为底物，以DNS比色法测定酶解后还原糖的生成量，表示酶的活力。

取25mL刻度具塞试管，加入2mL用pH9.0缓冲溶液配制的1％浓度的CMC-Na溶液，置于水浴(55±1℃)中预热5min。加0.5mL适当稀释的待测酶液，用漩涡混匀器混匀，盖塞，置于水浴(55±1℃)中，准确计时，反应30min后取出。迅速加入DNS试剂3mL，摇匀。沸水浴显色10分钟，取出，迅速冷却至室温，用水定容至25mL，以标准空白样(甘氨酸-NaOH溶液2.5mL，DNS试剂3.0mL，沸水浴加热10min冷却，定容至25mL)为对照，在540nm处测定酶反应液吸光度A₁。

空白对照先加DNS再加酶液，其余步骤相同。在分光光度计波长540nm下，用10mm比色杯，以标准空白样(甘氨酸-NaOH溶液2.5mL，DNS试剂3.0mL，沸水浴加热10min冷却，定容至25mL)为对照，在540nm处测定酶空白样吸光度A₀。

酶活计算公式：

式中：X为稀释酶液中纤维素酶的活力，U/ml；A₁为酶反应液的吸光度；A₀为酶空白样吸光度；K为葡萄糖标准曲线的斜率；C₀为标准曲线的截距；M为葡萄糖的摩尔质量，g/mol；t为酶解反应时间，min；n为酶液稀释倍数；1000为转化因子，1mmol＝1000μmol。

在此条件下(如非特别说明，温度为55℃，pH为9.0)，每分钟水解底物产生1μmol葡萄糖的酶量定义为一个酶活单位，用U/mL表示。

实施例1诱变准备

种子培养基：酵母膏1.5％，蛋白胨1％，可溶性淀粉1％，NaCl 0.05％，KH₂PO₄0.3％，Na₂CO₃ 0.05％，其余为水，pH8.0。

菌悬液制备：

取实验室保存的一株短小芽孢杆菌作为出发菌株于种子培养基中37℃活化24h，取10mL菌液4℃、5000rpm/min离心10min收集菌体，用无菌生理盐水洗涤离心两次，加无菌生理盐水至总体积10mL，充分振荡，悬浮菌体，得菌悬液备用。

实施例2紫外诱变

菌株诱变处理：将超净工作台用纸包裹住，紫外灯提前预热40min，然后进行紫外线照射，将收集的菌悬液置于紫外灯下25cm照射处理100s。采用刚果红染色法鉴定，诱变处理后的菌悬液在黑暗冷藏中保存1-2h，依次稀释至10^-4、10^-5、10^-6，从中各取0.2mL涂布于平板分离培养基中，37℃倒置遮光培养48h，以未经诱变处理菌液稀释涂平板作对照。待菌落长成后，视菌落周围透明圈的大小进行筛选，得到7株水解圈大的突变株。

选取这7株水解圈大的突变株，采用发酵产酶培养基进行摇瓶培养48h，测定碱性纤维素酶活，以原始出发菌株A为对照，结果如表1所示。菌株A-5酶活力最高，可达到36U/mL。

表1紫外诱变下正突变菌株筛选结果

平板分离培养基：CMC 1％，蛋白胨0.5％，酵母膏0.5％，Na₂CO₃ 0.05％，琼脂2％，刚果红0.03％，其余为水。

发酵产酶培养基：葡萄糖2％，玉米粉2％，豆饼粉3％，酵母浸粉1％，(NH₄)₂SO₄0.5％，MgSO₄ 0.03％，K₂HPO₄ 0.5％，FeSO₄ 0.05％，其余为水，pH8.0。

实施例3硫酸二乙酯诱变

以紫外诱变菌株A-5为出发菌株经培养后制备成菌悬液，取1ml硫酸二乙酯加入9ml 95％乙醇中制成硫酸二乙酯稀释液，将稀释的硫酸二乙酯溶液与菌悬液按1:200的比例进行混合(硫酸二乙酯稀释液:菌悬液)，震荡处理25min，加入25％的硫代硫酸钠溶液终止反应，将菌悬液依次稀释至10^-4、10^-5、10^-6，从中各取0.2mL涂布于分离培养基中，37℃倒置遮光培养48h，以未经硫酸二乙酯处理菌液稀释涂平板作对照。待菌落长成后，视菌落周围透明圈的大小进行筛选，得到8株水解圈大的突变株。

选取这8株正突变株，采用发酵产酶培养基进行摇瓶培养48h，测定碱性纤维素酶活，以未经硫酸二乙酯诱变菌株为对照，结果如表2所示。

表2硫酸二乙酯下正突变菌株筛选结果

突变株B-7产酶酶活力达到53.2U/mL，以此菌株为研究对象确定其遗传稳定性，摇瓶发酵进行产酶活力实验，连续传代8次，酶活力保持稳定，结果如表3所示。将突变株B-7命名为短小芽孢杆菌WS-135，并于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏号为CGMCC NO.18641。

表3菌株B-7遗传稳定性结果

实施例4短小芽孢杆菌WS-135液体深层发酵产碱性纤维素酶及产品处理

1、种子罐培养

种子培养基：酵母膏1.5％，蛋白胨1％，可溶性淀粉1％，NaCl 0.05％，KH₂PO₄0.3％，Na₂CO₃ 0.05％，其余为水，pH8.0。

种子罐灭菌工艺：121-123℃，0.11-0.12MPa条件下，灭菌30min。

种子罐培养：将摇瓶发酵后的种子液按照接种量6％的比例接入种子罐中进行培养，培养条件为温度34℃、罐压0.06Mpa、风量3vvm、转速400rpm，培养过程中补氨控制pH8.0，培养时间10h，镜检菌体较多。

2、发酵罐培养

发酵产酶培养基：葡萄糖2％，玉米粉2％，豆饼粉3％，酵母浸粉1％，(NH₄)₂SO₄0.5％，MgSO₄ 0.03％，K₂HPO₄ 0.5％，FeSO₄ 0.05％，其余为水，pH8.0。

发酵罐灭菌工艺：121-123℃，0.11-0.12MPa条件下，灭菌30min。

发酵罐培养：按照移种量10％的比例将种子罐菌液移入发酵罐进行培养，培养条件为：温度34℃，罐压0.06Mpa，转速：600rpm，风量：4vvm，发酵过程补氨控制pH8.0。

3、补料培养

补料培养基1：葡萄糖60％，pH自然。

补料培养基2：40％豆粕水解液。

40％豆粕水解液制作流程：

碱溶→碱性蛋白酶酶解→酸性蛋白酶酶解→灭活→过滤→浓缩→喷雾干燥→溶解：

(1)碱溶：加水配制12.5％豆粕溶液，搅拌转速400rpm，用30％NaOH调节pH12.5，50℃预溶解120min；

(2)碱性蛋白酶酶解：将以上溶液加入4000U/g(以豆粕质量计算)的碱性蛋白酶，加入30％NaOH调节pH11.0，混合均匀，转速400rpm，50℃酶解120min；

(3)酸性蛋白酶酶解：将以上酶解液加入酸性蛋白酶4000U/g(以豆粕质量计算)，转速400rpm，加入HCl调节pH4.0，50℃酶解60min；

(4)灭活：将温度升至90℃，持续20min，将酶灭活；得到豆粕液；

(5)过滤：使用板框压滤，得到压滤液；

(6)进一步地进行喷雾干燥将压滤液进行喷雾干燥，得到粉末状提取物；

(7)将其溶解配成40％浓度，得到40％豆粕水解液。

补料灭菌工艺：121-123℃，0.11-0.12MPa条件下，灭菌30-35min。

补料控制：发酵8小时后开始补料，流加补料培养基1，调整补料量逐渐加料，控制溶氧35％，直至发酵结束。

发酵24h后流加补料培养基2，固定流速，每升发酵液每小时流加4g，流加至发酵结束。

4、发酵结束

酶活增长缓慢，菌体自溶严重时结束发酵，发酵周期为75-80h。准备放罐提取，测定发酵液中碱性纤维素酶酶活，如表4所示。

表4发酵罐发酵实验结果

5、碱性纤维素酶的提取精制

(1)加入3％珍珠岩助滤剂，进行板框压滤；

(2)将压滤液中加入2％硅藻土进行精滤澄清；

(3)用20KDa超滤膜对精滤液进行超滤浓缩；

(4)得到超滤浓缩液，然后用无菌膜进行过滤除菌，即得到液体碱性纤维素成品酶制剂。

6、碱性纤维素酶的喷雾干燥

取液体成品酶制剂，按酶液质量百分比加入热保护剂0.5％MgSO₄，0.3％ZnSO₄，0.7％海藻糖；按酶液质量百分比加入8％酶液助干剂麦芽糊精；调整进风温度142℃，出风温度72℃，进行喷雾干燥，得到粉末状酶制剂成品。

实施例5酶学性质1

a.碱性纤维素酶的最适作用温度

取实施例4批次1制备的液体碱性纤维素成品酶制剂，在pH9.0条件下测定30-80℃温度下碱性纤维素酶活，以55℃时的酶活力为100％，分别计算相对酶活。结果如图1所示，最适反应温度为55℃，在45-70℃时能保持80％以上的活力。由实验结果可知，该突变菌株所产碱性纤维素酶的最适反应温度范围较广，具有很大的市场应用价值，在工业生产中具有很好的应用价值。

b.碱性纤维素酶最适作用pH

取实施例4批次1制备的液体碱性纤维素成品酶制剂，在温度为55℃条件下，分别测定碱性纤维素酶在不同pH值(4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0)条件下的碱性纤维素酶活力，以pH9.0时的酶活力为100％分别计算相对酶活，绘制不同pH条件下相对酶活力变化曲线。测定结果如图2所示，该酶在pH为8.0-11.0时，酶活力均可保持在80％以上，最适pH9.0，说明该菌产生的碱性纤维素酶可以在较宽pH的范围内保持其酶活力的作用效果。

实施例6酶学性质2

a.温度稳定性

取实施例4批次1制备的液体碱性纤维素成品酶制剂，放置于80℃温度下保温不同时间后，在pH9.0，55℃条件下测定酶活进行稳定性实验，实验结果均用相对酶活表示，即初始酶活设定为100％酶活，结果如图3所示，发现随着时间的不断延长，酶活逐渐降低，在保温时间3h后仍有70％以上的酶活，表明碱性纤维素酶在高温下保存稳定性良好。

b.pH稳定性

取实施例4批次1制备的液体碱性纤维素成品酶制剂，在pH4.0-12.0条件下保温5h后，在pH9.0，温度55℃条件下测定酶活，pH稳定性研究如图4所示，在pH5.0-10.5条件下酶的活力均在80％以上，表明在此范围pH环境下均具有很好的稳定性，在pH为12时仍有70％的酶活，表明该酶有很强的耐碱性。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利构思的前提下，上述各实施方式还可以做出若干变形、组合和改进，这些都属于本专利的保护范围。因此，本专利的保护范围应以权利要求为准。

Claims (2)

1.一种产碱性纤维素酶的短小芽孢杆菌，其特征在于，具体为短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)WS-135，保藏编号为：CGMCC NO.18641。

2.权利要求1所述短小芽孢杆菌WS-135的应用。

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